Informatie

Wat zijn de belangrijkste verschillen in de bereidingsprocessen van gigantische en grote unilamellaire blaasjes?


Ik moet de vouwing van mijn peptide op membraanmimetica (modelmembraan) bestuderen door circulair dichroïsmespectra. Nu ben ik op zoek naar geschikte methoden voor de bereiding van blaasjes: LUV, SUV, GUV - grote, kleine en gigantische unilamellaire blaasjes.

Ik heb verschillende methoden bestudeerd, maar ik vind het moeilijk om de belangrijkste factoren te begrijpen die van invloed zijn op de resulterende vesikelgrootte (LUV, SUV, GUV, enz.)

Om het even welke wijzers worden zeer gewaardeerd.


Gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's) worden gemaakt met methoden zoals hydratatie van het fosfolipidemembraan, in het algemeen door gebruik van een oplosmiddel, gebruik van elektrische stroom, het combineren van kleine blaasjes enz. Grote unilamellaire blaasjes (LUV's) worden gemaakt met methoden zoals verdamping met een lage concentratie fosfolipide, dialyse enz. Kleine unilamellaire blaasjes (SUV's) worden gemaakt door methoden Spontane oplossing te injecteren, microfludische methoden enz. Er zijn veel methoden uitgebreid beoordeeld (zoek gewoon in pubmed, u krijgt er veel)

Nu komt uw vraag, de factor die van invloed is op de maten, hangt af van de methode die u gebruikt. Ik zal er een paar opnoemen, rest kunt u de referenties van elke methode die ik hierboven heb gegeven, raadplegen. Meestal hebben deze methoden allerlei blaasjes. Het succes van deze methoden hangt af van welke methode u het hoogste percentage blaasjes geeft dat u wenst.

  • Microfludische methode: - totale stroomsnelheid, verhouding van oplosmiddel tot waterige fase (Kastner et al 2014)
  • elektrische methode: - mate van toepassing van elektrisch veld (Angelova en Dimitrove 1986)
  • Hydratatie methode: - hoeveelheid fosfolipide, verdampingssnelheid (Lasic 1988)

Naast dit alles, wordt hier de basisfysica uitgelegd, zoals het hieronder getoonde energieverschil (Afbeelding genomen uit (Lasic 1988))


Het eukaryote leven bevat hiërarchische vesiculaire architecturen (d.w.z. organellen) die cruciaal zijn voor materiële productie en handel, informatieopslag en -toegang, evenals energieproductie. Om specifieke taken uit te voeren, verschillen deze compartimenten onderling in hun membraansamenstelling en hun interne lading en ook van het celmembraan en het cytosol. Door de mens gemaakte structuren die deze geneste architectuur reproduceren, bieden niet alleen een dieper begrip van de functionaliteiten en evolutie van organeldragend eukaryotisch leven, maar maken ook de engineering van nieuwe biomimetische technologieën mogelijk. Hier tonen we de nieuw ontwikkelde vesicle-in-water-in-oil emulsie-overdrachtstechniek om te resulteren in gigantische unilamellaire vesicles die intern zijn gecompartimenteerd door unilamellaire vesicles met verschillende membraansamenstelling en interne lading, d.w.z. hiërarchische unilamellaire vesicles met gecontroleerde heterogeniteit in samenstelling. De gecompartimenteerde gigantische unilamellaire blaasjes werden vervolgens geïsoleerd door een scheidingsstap waarbij gebruik werd gemaakt van de heterogeniteit van de membraansamenstelling en de ingekapselde lading. Vanwege het gecontroleerde, efficiënte en technisch ongecompliceerde karakter van de nieuwe preparatietechniek, maakt deze studie de hiërarchische fabricage mogelijk van gecompartimenteerde gigantische unilamellaire blaasjes met gecontroleerde heterogeniteit in samenstelling en zal de ontwikkeling van eukaryote celnabootsers die lijken op hun natuurlijke sjablonen en de fabricage van nieuwe multi-agent medicijnafgiftesystemen voor combinatietherapieën en complexe kunstmatige microreactoren.

Gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's), die afzonderlijke waterige compartimenten vertegenwoordigen met een diameter van 1 tot 100 &#m gescheiden van een waterige omgeving door een enkele fosfolipide dubbellaag, worden intensief bestudeerd in verschillende gebieden van (bio-)chemie, fysica en in het gebied van kunstmatige celsynthese (voor een recent overzicht zie [1]). Hun nauwe analogie met natuurlijke cellen maakt blaasjes ideaal voor de bottom-up analyse van biologische processen [2], [3]. Bovendien kunnen ze door hun vermogen om verschillende chemische ladingen, biologische en biochemische machines en reactieproducten op te slaan, te vervoeren en te beschermen, dienen als minilaboratoria [4] en als ruimtelijk beperkte bioreactoren [5]–[7].

Eukaryotische cellen zijn verdeeld in kleinere compartimenten (bijvoorbeeld kern, vacuolen, mitochondriën, endosomen). Deze zeer gespecialiseerde compartimenten nemen talrijke en cruciale taken over (bijvoorbeeld nucleïnezuurproductie, materiaalopslag, energieproductie, materiaalafbraak) en hun evolutie wordt beschouwd als een van de belangrijkste gebeurtenissen in het ontstaan ​​van leven van hogere orde [8]. Intern gestructureerde GUV's werden niet alleen voorgesteld om een ​​grotere gelijkenis met natuurlijke eukaryote cellen te bereiken, maar ook voor toekomstige plaatsspecifieke multi-agens medicijnafgiftesystemen [9] met gunstige afgifte-eigenschappen [10] evenals voor complexe kunstmatige microreactoren met meerdere compartimenten [11] ]. Daarom is de voorbereiding van gecompartimenteerde blaasjes de afgelopen drie decennia onderzocht. In tegenstelling tot multilamellaire blaasjes (MLV's) die bestaan ​​uit veel concentrische membranen met een 'conion'-achtige structuur [12], zijn multivesiculaire blaasjes (MVV's) die voor het eerst werden beschreven als grote clusters van kleinere compartimenten die gemeenschappelijke bilagen delen [13], opnieuw gedefinieerd om alle structuren van niet-concentrische blaasjes in een groter blaasje te bedekken [14]. Er werden verschillende MVV-bereidingstechnieken gerapporteerd, waaronder de spontane [15] of geïnduceerde [16]–[18] endo-ontluiking van GUV's, de inkapseling van kleine blaasjes door in elkaar grijpende lipidevellen [10], [19], de inkapseling van vastgebonden blaasjes door moleculaire herkenning [20], en de vorming van dubbele liposomen als gevolg van de verspreiding van lipidenfilms op een glassubstraat [21], [22] of door verdamping in de omgekeerde fase [23]. De meeste van deze voorbereidingstechnieken lijden aan intense instrumentele manipulatie met vervelende en meertraps procedures. Bovendien missen de bereidingsprocedures ofwel een controle van de lamellaire werking, wat resulteert in biologisch onwaarschijnlijke en technisch beperkende multilamellaire membranen, ofwel resulteren in compartimenten met dezelfde membraansamenstelling en/of interne lading als het opsluitende blaasje. Tot dusver werd gemeld dat alleen de rehydratatie van gedroogde lipidefilms met een waterige oplossing die kleine unilamellaire vesicles bevat, resulteerde in gecompartimentaliseerde vesikels met een heterogene samenstelling en met gedefinieerde lamellaire aard, dwz de ingebouwde niet-concentrische kleine unilamellaire vesicles (SUV) verschilden van de opsluitende grote vesikels. unilamellaire blaasjes (LUV), zowel door hun membraansamenstelling als door hun interne lading [11]. Vanwege het stochastische karakter van het incorporatieproces is de kans op incorporatie echter gering en moest deze worden verbeterd door de elektrostatische interactie tussen de ingekapselde SUV's en de beperkende LUV in evenwicht te brengen door de lipidesamenstelling van de SUV's en LUV's [24] aan te passen. Zo beperken het ontbreken van een scheidingsprocedure, de kleine omvang van zowel de compartimenten (gemiddelde diameter: 250 nm) als de gecompartimenteerde blaasjes (gemiddelde diameter: ς µm), en de vereiste voor bepaalde lipidesamenstellingen het bereik van toepassingen voor de rehydratatie van gedroogde lipidefilms.

Hier werd gerapporteerd over de vesicle-in-water-in-oil (v/w/o) emulsieoverdracht met een daaropvolgende scheidingsprocedure als een nieuw ontwikkelde voorbereidende methode voor de gecontroleerde, efficiënte en technisch rechttoe rechtaan hiërarchische fabricage van gigantische (dwz 1� µm in diameter) unilamellaire vesicles intern gecompartimenteerd door niet-concentrische gigantische unilamellaire vesicles met verschillende membraansamenstelling en interne lading. De kern van de nieuwe preparatieve methode is de sequentiële toepassing van de water-in-olie (w/o) emulsie-overdrachtsmethode die naar verluidt resulteert in unilamellaire gigantische blaasjes en in een hoge inkapselingsefficiëntie [25]. Hier werden, voor de bereiding van de interne compartimenten, w/o-emulsiedruppeltjes gestabiliseerd door een enkele laag fosfolipiden door centrifugatie gedwongen om een ​​grensvlak tussen een water- en oliefase te passeren die gestabiliseerd is door een andere monolaag van fosfolipiden. Tijdens de passage combineerden de twee monolagen en vormden een dubbellaag die het waterige lumen van de tussenliggende GUV's, geladen met sucrose en een fluorofoor, isoleerde van de externe waterige gastheeroplossing die glucose bevatte. Voor de inkapseling van deze tussenliggende GUV's in grotere GUV's werden de tussenliggende GUV's geëxtrudeerd, overgebracht naar een oliefase, geëmulgeerd en ingekapseld in een tweede GUV-populatie met behulp van dezelfde methode. GUV's werden gemaakt van verschillende fosfolipidensamenstellingen zoals hieronder gespecificeerd. De interne compartimenten waren dus niet alleen geladen met verschillende lading (d.w.z. sucrose), maar bestonden ook uit verschillende membraancomponenten (d.w.z. gebiotinyleerde lipiden) dan de beperkende GUV's. Deze methode maakte bijgevolg de bereiding mogelijk van wat we noemen als hiërarchische unilamellaire blaasjes (HUV's) met controle van de heterogeniteit van de samenstelling van de betrokken membranen en lading tot een niveau dat niet mogelijk is met traditionele MVV- en MLV-bereidingsmethoden. Bovendien wordt onze HUV-voorbereidingsmethode gekenmerkt door een hoge opbrengst aan HUV's, een hoge inkapselingsefficiëntie en een lage technische inspanning.


Invoering

Biologische membraan nanobuisjes zijn buisvormige structuren die vaak worden waargenomen in de cel en tussen cellen. Het wordt steeds meer erkend dat de vorming en dynamiek van nanobuisjes een belangrijke rol spelen bij een groot aantal biologische ontwikkelingen, zoals de afgifte van endosomale antigeen in gepolariseerde T-cellen 1 , transport tussen ER en Golgi 2 en tussen Golgi en het plasmamembraan 3 . We hebben onlangs ook de rol aangetoond van nanobuisdynamiek bij autofagische lysosoomreformatie tijdens autofagie 4, 5 en mitochondriale netwerkremodellering 6 . De vorming van nanobuisjes is meestal een actief proces dat werken vereist. McMahon en Gallop hebben de factoren beoordeeld die biologische membraanvervorming veroorzaken, waaronder de lipidesamenstelling, membraaneiwitten en steigereiwitten, evenals het cytoskelet en de bijbehorende motoreiwitten 7 . Tot nu toe is het mechanistische begrip van membraantubulatie voornamelijk gebaseerd op: in vitro reconstitutie-assays, die twee benaderingen omvatten 8 . In de eerste benadering worden componenten waarvan wordt gedacht dat ze betrokken zijn bij membraantubulatie ofwel gesynthetiseerd, gezuiverd of zelfs bewaard in celextracten en gebruikt om het tubulatieproces te reconstrueren. Deze aanpak heeft ertoe bijgedragen dat de benodigde componenten voor de vorming van nanobuisjes zijn verminderd 9 . Dergelijke testen hebben bijvoorbeeld vastgesteld dat kinesinemotoren en microtubuli voldoende zijn om membraanbuizen uit blaasjes te induceren in afwezigheid van andere machines of eiwitten 10 . De andere benadering richt zich meer op de mechanische respons van membraantubulatie en wordt daarom vaak uitgevoerd met modelliposomen, namelijk gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's) 11,12. Gewoonlijk worden bij deze testen directe manipulatietechnieken met één blaasje gebruikt, waaronder hydrodynamische stroming 13, micropipetten 14 en optische pincetten 15,16. Aangezien deze technieken het mogelijk maken om de belasting nauwkeurig te regelen, kan de mechanische respons van membraantubulatie in detail worden bestudeerd.

Ondanks alle bevindingen is het niet duidelijk in hoeverre de grootte van een blaasje de tubulatie beïnvloedt. Deze vraag is van groot belang omdat de grootte van blaasjes en organellen in de cel heterogeen is. Hoewel een eerdere in vitro studie geeft aan dat de kracht die nodig is om de tubulatie te initiëren wordt geschaald met de grootte van de blaasjes, de conclusie was beperkt tot GUV's met een diameter van ongeveer 20 m 15 , veel groter dan de meeste intracellulaire blaasjes en organellen. Daarentegen is er weinig bereikt voor het begrijpen van tubulatie van kleine blaasjes die fysiologisch relevanter zijn.

In dit werk is ons doel om te bepalen hoe de grootte van de blaasjes de membraantubulatie in levende cellen beïnvloedt met behulp van lysosomen en autolysosomen als een set modelsystemen. Autolysosomen zijn degraderende compartimenten gevormd door fusie van een autofagosoom en meerdere lysosomen tijdens autofagie. We hebben onlangs ontdekt dat in het late stadium van autofagie, buisvormige structuren worden geëxtrudeerd en afgeknepen van autolysosomen om kleine proto-lysosomen te vormen, die na een rijpingsproces functionele lysosomen worden. Dit proces, namelijk autofagische lysosomale reformatie (ALR), is cruciaal voor cellen om hun lysosoomniveau te behouden wanneer ze het autofagische stadium verlaten 4 . Hoewel de membraansamenstelling van autolysosomen vergelijkbaar is met die van lysosomen, zijn hun afmetingen behoorlijk verschillend. Het is bekend dat het bereik van de lysosoomdiameter tussen 50 nm en 500 nm ligt 17 . Voor autolysosomen varieert hun grootte van enkele honderden nanometers tot enkele micrometers, groter en gevarieerder dan die van lysosomen 17 . We speculeren dat cellen de grootte van de blaasjes kunnen gebruiken om lysosomen en autolysosomen te onderscheiden bij het bevorderen van de vorming van tubuli, specifiek op autolysosomen. Om dit idee te bewijzen, kwantificeren we eerst het tubulatiepercentage van lysosomen en autolysosomen in de cel. De in vivo observaties onthullen dat autolysosomen een veel grotere kans op tubulatie vertonen dan lysosomen. De grootte-afhankelijkheidshypothese wordt verder versterkt door een sucrose-geïnduceerde vergrotingsmethode in de cel. Bovendien, met de wetenschap dat de tubulatie van zowel autolysosomen als lysosomen wordt aangedreven door geassocieerde kinesinemotoren, reconstrueren we het tubulatieproces in vitro met behulp van gezuiverde lysosomen, autolysosomen en kunstmatige liposomen. Nauwkeurige afstemming van de kinesinemotorconcentratie maakt het mogelijk om het grootte-effect op de tubulatie te scheiden van andere factoren. Ten slotte passen we Atomic Force Microscopy (AFM) toe om de krachtbarrière tijdens het tubulatieproces kwantitatief te meten en een eenvoudige berekening uit te voeren op basis van de metingen.

Over het algemeen suggereren deze resultaten dat de grootte van de blaasjes inderdaad de tubulatiekans voor lysosomen en autolysosomen beïnvloedt, waarvan de grootte varieert tussen 50 nm en enkele micrometers. Onze testen die zijn gebouwd voor lysosomen en autolysosomen kunnen gemakkelijk worden uitgebreid naar andere vesikelvervormingssystemen. Belangrijk is dat het effect van de grootte-afhankelijkheid een van de mechanismen voor de cel kan zijn om cellulaire processen te reguleren waarbij membraanvervorming betrokken is.


2 SOORTEN EXTRACELLULAIRE BLAASJES

Momenteel ingedeeld in de brede categorieën van exosomen, MV's of apoptotische lichamen op basis van hun vormingsmechanisme, wijze van afgifte uit cellen en grootte 2 (tabel 1), logenstraft deze classificaties enigszins de heterogeniteit die kan bestaan ​​binnen blaasjesklassen in termen van zowel lading als functionaliteit. 36 Exosomen, de best gekarakteriseerde van de EV-subtypes, worden eerst gevormd als intraluminale blaasjes in een multivesiculair lichaam (MVB), die vrijkomen in de extracellulaire ruimte na MVB-fusie met het plasmamembraan. 37 MV's, soms aangeduid als ectosomen of microdeeltjes, worden gevormd door naar buiten blazen van het plasmamembraan en daaropvolgende splijting van plasmamembraanblaasjes. 2 MV's afgeleid van menselijke kankercellen (Figuur 1A) hebben veel aandacht gekregen vanwege hun vermogen om deel te nemen aan de horizontale overdracht van signaaleiwitten tussen kankercellen en om bij te dragen aan hun invasieve activiteit. Apoptotische lichamen worden gevormd tijdens cellulaire blebbing en fragmentatie bij celdood 2 (Figuur 1B), en hun impact op andere cellen is niet goed bestudeerd. Blaasjes kunnen ook vrijkomen uit nanotubulaire structuren die uitstralen vanuit het plasmamembraan. 38 Op dit moment lijkt het erop dat de meeste, zo niet alle celtypen EV's vormen, 25, 39, maar in het algemeen zorgen celstress en ziekte vaak voor opregulatie van hun vorming en veranderen ze de lading die erin zit. 40

  • Op dit moment onbekend
  • Intercellulaire communicatie
  • Bevorder de progressie van kanker
  • Intraluminale blaasjes van multivesiculair lichaam
  • Vrijgegeven na MVB-fusie met plasmamembraan
  • Intercellulaire communicatie in gezonde en zieke cellen
  • Conditie/educatie van de extracellulaire micro-omgeving
  • Kan pathogenese van ziekten bevorderen
  • Direct ontluiken van plasmamembraan
  • Vrijgegeven via door acto-myosine aangedreven splijting in de extracellulaire ruimte
  • Intercellulaire communicatie in gezonde en zieke cellen
  • Conditie/educatie van de extracellulaire micro-omgeving
  • Kan pathogenese van ziekten bevorderen
  • Willekeurige plasmamembraanblebs van cytoplasma en organelfragmenten
  • Afbraak van apoptotische cellen
  • Potentiële intercellulaire signaaltransductie
  • Direct ontluiken van plasmamembraan
  • Intercellulaire communicatie verzonden door kankercellen
  • Conditie/educatie van de extracellulaire micro-omgeving
  • Kan pathogenese van ziekten bevorderen
  • Gevormd door het kunstmatig stimuleren van cellen om klontjes van lipidenrijk plasmamembraan af te werpen
  • Bestudeer het gedrag van plasmamembraaneiwitten
  • Bestudeer plasmamembraan lipide-organisatie
  • In vitro gesynthetiseerd als mengsels van cholesterol en fosfolipiden in een organisch oplosmiddel. Kan sonische of mechanische verwerking vereisen om de enkelvoudige lipide dubbellaagse (unilamellaire) of meervoudige dubbellaagse (multilamellaire) blaasjes te vormen
  • Bestudeer eigenschappen van het plasmamembraan zoals lipid rafts en fasescheiding
  • Levering van therapieën

Over het algemeen omvatten EV's een breed spectrum van blaasjes, variërend van 8 nm tot enkele microns. MV's hebben over het algemeen een diameter van 200 nm tot enkele microns, terwijl exosomen kleiner zijn en een diameter hebben van 50 tot 100 nm. 2, 41 Nanoblaasjes variërend van 8 tot 12 nm in perifeer bloed zijn ook recentelijk beschreven,42 en deze zeer kleine blaasjes kunnen per ongeluk worden geïsoleerd met exosomen met behulp van veel van de momenteel gebruikte isolatieprotocollen. Vanwege de aanzienlijke heterogeniteit in de grootte van MV's, zijn er waarschijnlijk subpopulaties binnen deze categorie blaasjes. De term "oncosomen" is gebruikt om MV's of zelfs alle EV's te beschrijven die zijn vrijgegeven uit kankercellen. 43 Merk echter op dat grote oncosomen (LO) verwijzen naar een subtype van plasmamembraan-afgeleide MV's, met een diameter van 1 tot 10 m, die worden afgegeven door tumorcellen. 44, 45 De nomenclatuur, evenals de afmetingen die aan verschillende EV-subtypes worden toegeschreven, zijn niet zonder discussie geweest. 46, 47 Wat deze zaak compliceert, is het feit dat isolatiemethoden voor EV-subtypen nog in ontwikkeling zijn en dat er nog geen consensus is bereikt over de beste praktijken, wat leidt tot verschillen in de populaties van blaasjes die tussen onderzoeken worden geëvalueerd. 36, 48 Als gevolg van het ontbreken van een duidelijk onderscheid tussen EV-subtypen, is in veel onderzoeken gebruik gemaakt van collectieve EV-populaties. Voor de doeleinden van deze review gebruiken we de term "extracellulaire blaasjes" voor alle onderzoeken die niet zijn toegeschreven aan een bepaalde populatie of wanneer de isolatiemethoden suggereren dat er waarschijnlijk meerdere subtypes werden onderzocht. We hebben kenmerken toegeschreven aan "microvesicles" als de methodologieën voor vesicle-isolatie zijn verrijkt voor de MV-fractie.

Het is waarschijnlijk dat de wijze van biogenese en EV-lading een cruciale rol zullen spelen bij het definiëren van criteria voor classificatie. In deze geest zijn recentelijk subpopulaties van EV's beschreven door karakterisering van lading, grootte en dichtheid, 36, 49, 50, evenals hun effecten op ontvangende cellen. 49 Het is mogelijk, zo niet waarschijnlijk, dat naarmate het veld vordert, er extra vesikelklassen of wijzigingen aan de huidige classificatiesystemen zullen ontstaan.

Hoewel niet samen met het bovenstaande geclassificeerd, zijn aanvullende typen blaasjes voornamelijk beschreven als onderzoeksinstrumenten om het gedrag van lipiden en eiwitten te bestuderen. Deze kunnen worden gevormd bij kunstmatige stimulatie van cellen, zoals in gigantische plasmamembraanblaasjes (GPMV's), die worden gevormd bij de behandeling van levende cellen met stimuli zoals laserbestraling, zoutbehandeling of de chemicaliën paraformaldehyde en dithiothreitol. 51-53 Dit resulteert in de vorming van grote (microngrootte) blaasjes die vaak worden gebruikt om de lipide- en eiwitorganisatie op het plasmamembraan 52, 54, 55 te bestuderen (Figuur 2). Andere typen blaasjes worden in vitro volledig synthetisch bereid, zoals in kleine, grote en gigantische uni- en multilamellaire lipide-vesicles, 56 waaronder varianten die kunstmatige plasmamembraan-vesicles worden genoemd. 57 Deze synthetische blaasjes zijn ook gebruikt voor therapeutische doeleinden, wat zorgt voor verbeterde stabiliteit en opname van medicijnen en nucleïnezuren, 58, 59 waarschijnlijk gebruikmakend van dezelfde mechanismen die worden gebruikt door natuurlijk afgeleide blaasjes.


3.&emspConclusies

We hebben hier aangetoond dat het vermogen om de verknopingsdichtheid van een dunne gel ruimtelijk te moduleren, ongekende groottecontrole biedt bij de gel-ondersteunde vorming van enkelvoudige dubbellaagse blaasjes. Door de verknopingsdichtheid in dunne gels van PNIPAAm te modelleren, hebben we in wezen monodisperse gigantische verankerde blaasjes verkregen met een variatie in diameters kleiner dan 10%.

De in dit artikel ontwikkelde strategie was gebaseerd op de differentiële zwelverhoudingen tussen gelgebieden met hoge en lage verknopingsdichtheden. Na het zwellen verschenen de sterk gezwollen delen van de gel als pilaren versierd met een gigantisch blaasje, de harde gebieden rond de pilaren leidden niet tot gigantische blaasjesgroei. Dit gebeurde omdat het vesikelvormingsproces sterk afhankelijk is van de mate van verknoping en de zwellingsverhouding, zelfs voor ongestructureerde PNIPAAm-gels (zie figuur S2 en de ondersteunende informatie voor details). Hoewel zich op dergelijke gels een groot aantal blaasjes met verschillende grootten vormt, is er een algemene tendens dat de gemiddelde grootte en de fractie van grote blaasjes geleidelijk afnemen met de toename van de verknopingsdichtheid (Figuur S2). De parameters van het patroon van het optische masker die de geometrie van de hoge en lage verknoopte gebieden regelen, vertaalden zich dus direct in gigantische blaasjesgrootte en positionering. De overdraagbaarheid van patroonontwerp naar gigantische blaasjeseigenschappen is een intrinsiek flexibel krachtig kenmerk van de methode, omdat het niet alleen gigantische blaasjes van een gerichte grootte kan bereiden, maar ook complexere maar goed gedefinieerde mengsels van verschillende groottes met vooraf bepaalde posities.

In tegenstelling tot gelondersteunde groei met andere polymeergels, bleven de gigantische blaasjes hier vast aan het substraat en gepositioneerd op de pilaren. Dientengevolge worden duizenden verankerde, nauwkeurig gepositioneerde gigantische blaasjes gevormd na eenvoudige toevoeging van de oplossing aan de droge patroongel waar lipide werd verspreid. De verankering is te wijten aan de penetratie van lipiden in de droge en gezwollen gel, waardoor de capillaire randvoorwaarden tussen de bilagen en het substraat veranderen. Hoewel de gedetailleerde structuur van het verankeringsgebied waarschijnlijk zal bepalen hoe goed het interieur van de GUV's is afgedicht met betrekking tot verschillende moleculen, brengt dit de zuiverheid van de gevormde GUAV's niet in gevaar, aangezien de gel chemisch verknoopt is. Het is belangrijk om te onderstrepen dat de stabiliteit van dit gigantische blaasjesplatform ook wordt verzekerd door de chemische verknoping van de gelfilm met het substraat, wat resulteert in een zeer robuust vormings- en observatieplatform voor GUAV's.

Fysieke metingen uitgevoerd op GUAV's onthulden ook de mogelijkheden die dit platform biedt met betrekking tot positiecontrole en parallelle metingen onder een microscoop. FCS-metingen konden gedurende enkele minuten onder zeer stabiele omstandigheden worden uitgevoerd, waarbij lipidediffusiecoëfficiënten werden verkregen die in overeenstemming waren met waarden uit de literatuur. Fotosensibilisatie van de blaasjes werd ook gemakkelijk bereikt en de resulterende transformaties konden tegelijkertijd worden gevolgd en kwalitatief geëvalueerd op veel blaasjes. Opwindend genoeg zijn deze prestaties een belangrijke stap in de richting van de ontwikkeling in een nabije toekomst van geautomatiseerde metingen onder een optische microscoop aan enorme reeksen biomimetische lipidemembranen.


Karakterisering van gigantische blaasjes gevormd door faseoverdrachtsprocessen

Blaasjes zijn van groot belang als medicijnafgiftesysteem of modellen voor celmembranen. Voor veel toepassingen is het noodzakelijk blaasjes te produceren die unilamellair, monodispers zijn, gemakkelijk in grootte kunnen worden aangepast en die kunnen worden gevuld met verschillende soorten actieve verbindingen. In een reeks experimenten produceerden we gigantische blaasjes met een afmeting van enkele millimeters door faseoverdrachtsprocessen. Met deze nieuwe techniek konden gedefinieerde blaasjes worden gesynthetiseerd met membranen van lipiden en oppervlakteactieve stoffen. De bereiding van deze aggregaten gebeurde in twee stappen. Eerst hebben we een hoeveelheid water in een cuvet gedaan en deze vloeistof bedekt met een oliefase. Oppervlakteactieve stoffen of lipiden werden opgelost in de water- of de oliefase. In de tweede stap werd een waterdruppel gevuld met methylblauw en sacharose gevormd met een injectiespuit in de oliefase. Vanwege het dichtheidsverschil passeerde de waterdruppel het vlakke olie/water-grensvlak en tijdens dit proces werd het omgezet in een blaasje. De zo gevormde reusachtige liposomen vertoonden een hoge gevoeligheid voor variaties van de osmotische druk en hun stabiliteit reikte van seconden tot uren. Vanwege het faseoverdrachtsproces bevatten de blaasjesmembranen vaak ingebouwde olielenzen. Als deze hydrofobe vloeistof uit het membraan vrijkwam, vielen de blaasjes uiteen in kleinere liposomen met een brede deeltjesgrootteverdeling.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Fluorescerende sondeverdeling in gigantische unilamellaire blaasjes van 'lipid raft'-mengsels

Directe visualisatie van vlotachtige lo (vloeistofgeordende) domeinen in modelsystemen en cellen met behulp van microscopische technieken vereist fluorescentieprobes met bekende partitioneringsvoorkeur voor een van de aanwezige fasen. Fluorescerende sondes kunnen echter ongelijke verdelingsvoorkeuren vertonen in verschillende lipidesystemen en kunnen ook het fasegedrag van de lipidedubbellaag van de gastheer beïnvloeden. Daarom is een gedetailleerd begrip van het gedrag van fluorescerende sondes in gedefinieerde lipide dubbellaagsystemen met bekend fasegedrag essentieel voordat ze kunnen worden gebruikt voor het identificeren van domeinfasetoestanden. Met behulp van gigantische unilamellaire blaasjes bestaande uit het ternaire lipidemengsel DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine)/DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine)/cholesterol, waarvoor de fase gedrag bekend is, hebben we negen veelgebruikte fluorescerende sondes onderzocht met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie. De verdelingsvoorkeur van elke probe werd toegewezen op basis van kwantificering van de domeingebiedfracties of door gebruik te maken van een goed gekarakteriseerde Id (vloeistof-wanorde)-fase marker. Fluorescerende sondes werden zowel afzonderlijk als met behulp van dubbele of drievoudige labelingsbenaderingen onderzocht. De meeste probes verdeelden zich individueel in de ld-fase, terwijl alleen NAP (nafto(2,3-a)pyreen) en NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro) -2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) gaf de voorkeur aan de lo-fase. We vonden dat Rh-DPPE (Lissamine & trade rhodamine B & ndash 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine) de overgangstemperatuur van de mengbaarheid, T-mengsel, verhoogde. Interessant is dat de verdeling van DiIC 18 (1,1&prime-dioctadecyl-3,3,3&prime,3&prime-tetramethylindocarbocyanineperchloraat) werd beïnvloed door Bodipy®-PC (2-(4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora -3a,4a-diaza-s-indaceen-3-pentanoyl)-1-hexa-decanoyl-sn -glycero-3-phosphocholine) Het specifieke gebruik van elk van de fluorescerende probes wordt bepaald door de fotostabiliteit, partitioneringsvoorkeur, vermogen om lipide-fasescheidingen en geïnduceerde verandering in T-mix te detecteren We demonstreren het belang van het testen van een specifieke fluorescerende sonde in een bepaald model membraansysteem, in plaats van aan te nemen dat het labelt een bepaalde lipidefase.

Logboek

Biochemical Journal &ndash Portland Press

Gepubliceerd: 15 sep. 2010

trefwoorden: confocale fluorescentiemicroscopie, fluorescerende sonde, gigantische unilamellaire blaasje, lipid raft, vloeistof-geordende fase, partitionering


Onderzoek

Onderzoek in het lab van Prof. Dr. Kirsten Bacia richt zich op biologische membranen en biofysische instrumenten voor het bestuderen van eiwitten en membranen.

  • We voeren reconstitutie-experimenten uit om te leren hoe eiwitten lipidedubbellagen hermodelleren en hoe eiwitten en synthetische polyfiele moleculen interageren met lipidenassemblages.
  • We ontwikkelen verder membraanmodellen en op microscopie en spectroscopie gebaseerde tools om deze supramoleculaire assemblages en hun interacties te bestuderen.

Wij zijn lid van het Instituut voor Chemie, Vakgroep Fysische Chemie (Faculteit Natuurwetenschappen II). Ons laboratorium bevindt zich in het Charles-Tanford-Protein Center, samen met de laboratoria van de Faculteit der Natuurwetenschappen I (Life Sciences) en de Medische Faculteit, en maakt deel uit van het Center of Innovation Competence (Zentrum f r Innovationskompetenz) HALOmem .

Onderzoeksinteresses: We bestuderen lipide dubbellagen, interacties van eiwitten en synthetische moleculen met membranen en eiwitten in oplossing. We passen modelmembraantools en optische tools toe en ontwikkelen ze verder, evenals nieuwe combinaties daarvan.

Onderzoeksinteresses: We bestuderen lipide dubbellagen, interacties van eiwitten en synthetische moleculen met membranen en eiwitten in oplossing. We passen modelmembraantools en optische tools toe en ontwikkelen ze verder, evenals nieuwe combinaties daarvan.

Membraan hermodellering

Intracellulair transport vereist de hermodellering van lipidemembranen. Bij het endoplasmatisch reticulum (ER) van eukaryote cellen vormt een reeks eiwitten een complex, het COPII-complex, dat een eiwitlaag vormt rond een ontluikende lipidemembraanknop. We zijn geïnteresseerd in de fysisch-chemische mechanismen achter dit verbazingwekkende proces van hermodellering van membranen en in wat er echt nodig is om de kiem door middel van tweelaagse splitsing te laten gaan. Dit is een al lang bestaande vraag op het gebied van intracellulaire mensenhandel.

Membraanremodellering door eiwitten Links: Eiwitzuivering door chromatografie ( KTA FPLC). Midden: Confocale microscopie-afbeelding van de COPII-laag gereconstitueerd op gigantische liposomen (Bacia et al., Sci. Rep. 2013), schaalbalk = 10 m. Rechts: organisatie van de COPII op een lipidemembraanbuisje van cryo-elektronenmicroscopie (Zanetti et al., eLife 2013), schaalbalk = 100 nm.

Membraanremodellering door eiwitten
Links: eiwitzuivering door chromatografie ( KTA FPLC). Midden: Confocale microscopie-afbeelding van de COPII-laag gereconstitueerd op gigantische liposomen (Bacia et al., Sci. Rep. 2013), schaalbalk = 10 m.
Rechts: organisatie van de COPII op een lipidemembraanbuisje van cryo-elektronenmicroscopie (Zanetti et al., eLife 2013), schaalbalk = 100 nm.

Kunstmatige membraansystemen

liposomen kan in verschillende maten worden bereid, variërend van tientallen nanometers tot tientallen micrometers. Reconstitutie van integrale membraaneiwitten in liposomen (d.w.z. de vorming van proteoliposomen) evenals de perifere binding van manteleiwitten aan liposomen wordt geanalyseerd met behulp van zowel biochemische als biofysische tests.

(A) FCS (fluorescentiecorrelatiespectroscopie) analyse van reconstitutie van membraaneiwit. Het eiwit draagt ​​een fluorescerend label. Vrij eiwit in oplossing diffundeert snel (rode curve), terwijl proteoliposomen veel langzamer diffunderen (paarse curve). (B) Biochemische test voor reconstitutie van membraaneiwit.

(A) FCS (fluorescentiecorrelatiespectroscopie) analyse van reconstitutie van membraaneiwit. The protein carries a fluorescent label. Free protein in solution diffuses fast (red curve), whereas proteoliposomes diffuse much more slowly (purple curve). (B) Biochemical assay for membrane protein reconstitution.

Using dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS), the success of membran protein reconstitution can be assessed within minutes. (from Simeonov et al., Biophys. Chem. 2013, doi: 10.1016/j.bpc.2013.08.003)

Using dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS), the success of membran protein reconstitution can be assessed within minutes. (from Simeonov et al., Biophys. Chem. 2013, doi: 10.1016/j.bpc.2013.08.003)

Dual-color FCCS (see below) allows to obtain quantitative binding curves of protein (or ligand) binding to freely diffusing liposomes (from Kruger et al., BioRxiv 2017, DOI 10.1101/146464 , now published in Biophys. J. 2017, doi: 10.1016/j.bpj.2017.06.023)

Dual-color FCCS (see below) allows to obtain quantitative binding curves of protein (or ligand) binding to freely diffusing liposomes (from Kruger et al., BioRxiv 2017, DOI 10.1101/146464 , now published in Biophys. J. 2017, doi: 10.1016/j.bpj.2017.06.023)

Very large liposomes, so-called Giant Unilamellar Vesicles (GUVs), prepared by the electroformation method are on the order of 10 m in size, making them well-suited for studies by confocal fluorescence microscopy and fluorescence correlation spectroscopy (FCS, see below).

(A) Electroformation setup for producing Giant Unilamellar Vesicle (B) Dye-labeled Giant Unilamellar Vesicles in a test tube (C) Confocal slice image of Giant Unilamellar Vesicles

(A) Electroformation setup for producing Giant Unilamellar Vesicle (B) Dye-labeled Giant Unilamellar Vesicles in a test tube (C) Confocal slice image of Giant Unilamellar Vesicles

Langmuir monolayers are prepared at the buffer/air interface. The interaction of proteins with the monolayers can be studied using infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS).

Determination of the orientation of the COPII-protein Sar1p at a lipid monolayer by IRRAS (from Schwieger et al., Polymers 2017, doi: 10.3390/polym9110612)

Determination of the orientation of the COPII-protein Sar1p at a lipid monolayer by IRRAS (from Schwieger et al., Polymers 2017, doi: 10.3390/polym9110612)

Lipid phase behavior We are interested in dynamic lateral heterogeneities in membranes from natural components (proteins, lipids) and synthetic components (artificial amphiphiles and polyphiles).

Dendritic, star-shaped domains with sixfold symmetry formed in membranes from DPPC and X-shaped bolapolyphiles (from Werner et al., Polymers 2017, doi:10.3390/polym9100476, see also Werner et al., Chem. Eur. J. 2015, doi 10.1002/chem.201405994). The molecular structure of the bolapolyphile influences the domain shape.

Dendritic, star-shaped domains with sixfold symmetry formed in membranes from DPPC and X-shaped bolapolyphiles (from Werner et al., Polymers 2017, doi:10.3390/polym9100476, see also Werner et al., Chem. Eur. J. 2015, doi 10.1002/chem.201405994). The molecular structure of the bolapolyphile influences the domain shape.

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a very useful tool for examining mobility and interactions in a variety of systems including membranes. FCS is highly sensitive to small differences in the diffusion rates of proteins and lipids, which allows for instance to characterize differences in phase behavior of lipid bilayers. FCS is used to analyze the binding of diffusible ligands to membrane receptors, such as membrane proteins or glycolipids. Changes in the fluorescence brightness parameter reveal membrane protein oligomerization. Moreover, the use of dual-color fluorescence cross-correlation (dcFCCS) allows to assess protein-protein binding in cases, where binding does not lead to significant changes in diffusion rates. The dual-color cross-correlation technique can also be employed to detect dynamic co-localization of labeled cargo molecules in small, mobile carriers, such as transport vesicles. Owing to the use of fluorescent labels, FCS is highly specific and can be applied both to artificial, reconstituted systems and directly to living cells.

Parameters accessible by FCS (for details see: Bacia et al., Nat. Methods 2006)

Parameters accessible by FCS (for details see: Bacia et al., Nat. Methods 2006)

Schematic view of an FCS setup with dual color FCCS capability

Schematic view of an FCS setup with dual color FCCS capability

FCS is typically performed on a setup that is similar to a confocal microscope. One or more laser lines are focused in the sample and the fluorescence is collected through the same objective. A pinhole serves to delimit the detection volume. The fluorescence emission(s) from the label(s) are selected by means of emission filter(s) and the fluorescence intensity as a function of time is recorded by avalanche photodiode detectors. Different methods of analysis are available to extract information from the fluorescence fluctuations, which occur as labeled molecule diffuse through the focus. Correlation analysis yields an autocorrelation curve, whose amplitude is inversely related to the concentration of the fluorescent particles. The decay time of the correlation curve reflects the diffusional mobility of the particles. In dual-color FCCS, the relative amplitude of the cross-correlation curve depends on the fraction of double-labeled (i.e., bound) particles.

Principle of FCS and dcFCCS measurements, for details see Bacia et al., Nat. Methods 2006

Principle of FCS and dcFCCS measurements, for details see Bacia et al., Nat. Methods 2006

Methods and instrumentation

We are interested in working out other applications of the methods we use in the lab, e.g. in cell biology and plant biology through active collaborations. Please get in touch if any of the following spectroscopic methods are of interest for your research:

  • Fluorescence Fluctuation Spectroscopy (particle diffusion/mobility analysis in solution, in model system and inside live cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS), binding analysis using dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS), diffusion/mobility analysis using raster image correlation spectroscopy (RICS))
  • Confocal Fluorescence Microscopy
    • Laser Scanning Microscopy (LSM) on an Inverse or Upright Scope
    • Zeiss Airy Scan (improved spatial resolution)
    • Spinning Disc (fast scanning for dynamic processes)
    • Confocal fluorescence microscopy on cryo-fixed samples (in liquid nitrogen)
    • Confocal anisotropy imaging
    • Total Internal Fluorescence (TIRF) and single molecule localization microscopy (Zeiss Elyra)

    The same applies to methods for producing and characterizing model membrane systems, e.g. monolayers on a Langmuir film balance (stand-alone or combined with widefield or confocal microscopy), giant unilamellar vesicles (GUVs), membrane protein reconstitution into liposomes, flotation assays, dynamic light scattering, sample preparation for cryo-EM at HALOmem (Lab of Prof. Dr. Kastritis) or the EM facility (Dr. Gerd Hause) and more.

    We are able to collaborate on a range of projects. For core facility type services in light microscopy, please refer to the CFI (Core Facility Imaging) of the Medical Faculty in the same building.

    Interested in joining the lab?

    Being an interdisciplinary team, we welcome contributions from biology, biochemistry, chemistry, physics, medical physics, pharmacology, engineering and other relevant backgrounds.

    Students interested in joining the lab during their Bachelor of Masters program should feel free to contact Prof. Kirsten Bacia. Periodically, listings of exemplary Bachelor thesis projects are available at the Institute of Biochemistry/Faculty of Natural Sciences I and the Institute of Chemistry/Faculty of Natural Sciences II, respectively.

    Students interested in a PhD project en Postdocs are also welcome to inquire about opportunities.

    Job announcements at the University of Halle can be found at the Human Resource Department.


    Large Scale Conformational Transitions

    Large scale conformational transitions can occur in lipid bilayers. These include bud formation, formation of vesicles which split off from the membrane, and fusion of membrane vesicles, all of which are important biologically. To some extent, the tendency to engage in these larger shape transitions depends on the local curvature of the vesicle, which depends on the local phospholipid composition and fluidity of the membrane. We have previously seen that segregation of lipids into rafts (or domains) within a leaflet depends on the phospholipid content. Baumgart et al. have made giant unilamellar vesicles (GUV) containing a mixture of three lipids: sphingomyelin (SM), dioleylphosphatidylcholine (DOPC), and cholesterol (C) to study transitions in the bilayers. SM and C segregate laterally into a "liquid phase" domain characterized by significant order (Lo) while DOPC forms a "liquid phase" with more disorder (Ld). They could detect the different phases through fluorescence microscopy of GUV's labeled with fluorophores (molecules that absorb visible or UV light and emit photons of lower energy (higher wavelength). The first, N-lissamine rhodamine dipalmitoylphosphatidylethanolamine (red fluorescence), partitions almost exclusively into the Ld phase. The second, perylene (blue fluorescence), partitioned with great selectivity into the Lo phase. The results of their studies are shown in the figures below. This images provide stunning visualization of lipid domains (rafts) including those in the shapes of circles, stripes, and rings. Their works shows that the boundary between the domains is important in determining lipid structures. Structures are favored which reduce the perimeter at the boundaries of the phases. It appears that the Ld phase (and associated lipids) is found preferentially in area of high membrane curvature, while the Lo phase is found is regions of lower curvature. The two figures below are reprinted with permission of Nature and the authors: Baumgart, Hess, and Webb, W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Natuur. 425, pg 821 (2003)

    Figure: Equatorial cross sections of GUVs with multiple phases

    Figure: GUVs structures with multiple phases

    Movie: Molecular Dynamics Simulation of vesicle fusion (scroll down to 52: Control of Membrane Fusion Reaction..)


    Applying pattern matching analysis to lifetime images for studying bead diffusion dynamics

    The diffusion behavior of two types of dye-labeled beads was monitored via rapidFLIM, as above. Doubling the image acquisition speed by reducing the pixel dwell time towards 4 µs (about 6 frames per second) results in more noise in the FastFLIM image leading to a lower FLIM contrast, as can be seen in the top video.

    The lifetime contrast can be enhanced by applying the pattern matching approach. For each species, a lifetime pattern was generated (shown below: green curve = Dragon Green, red curve = Nile Red) and the recorded FLIM data was analyzed, resulting in the second video with improved lifetime contrast.