Informatie

Is elke cel competent?


Ik zou graag willen weten of elke cel competent is of dat er cellen zijn die niet competent zijn.


Ervan uitgaande dat je vraagt ​​naar E coli cellen die competent worden gemaakt voor transformatie met behulp van plasmide-DNA, wordt hier een antwoord van deze bron in de cache opgeslagen:

Hanahan, D. & Bloom, FR (1996). Mechanismen van DNA-transformatie. In FC Neidhardt (red.). Escherichia coli en Salmonella: cellulaire en moleculaire biologie. (blz. 2449-2459). Washington DC, Verenigde Staten: ASM Press.

De bron (en het is misschien de moeite waard om te benadrukken dat Hanahan een transformatiegoeroe is/was) stelt dat behandeling met divalente kationen 10% van de cellen competent kan maken, terwijl behandeling voor elektroporatie overdracht naar 95% van de cellen kan bereiken.

Deze informatie is uiteraard in 1996 gepubliceerd, dus het is denkbaar dat er met de eerstgenoemde methode vooruitgang is geboekt.


Hoe u uw eigen chemisch competente cellen kunt maken?

Ik heb eens de vreselijke ervaring gehad dat ik geen test kon uitvoeren omdat ik geen commerciële voorraad van transformatie-competenten meer had Escherichia coli (E coli). Vanaf die dag leerde ik in het lab mijn eigen chemisch competente cellen te maken.

Ik raad iedereen aan om zijn eigen voorraad transformatie-competent te maken E coli voorraden, naast andere voorgestelde laboratoriumactiviteiten. Ten eerste zou elke moleculair bioloog moeten leren hoe hij dit moet doen. Ten tweede is het heel eenvoudig. Ten derde bespaart het u geld en voorkomt u noodsituaties.

Vandaag laat ik je zien hoe je een doe-het-zelfvoorraad kunt maken van chemisch competente E coli., het werkpaard in het laboratorium voor moleculaire biologie.


Bevoegde cellen

Kies voor kloneringsexperimenten uit verschillende competente celstammen met hoog rendement. Deze E coli stammen zijn T1-faagresistent en zijn eindeA deficiënt voor plasmidepreparaten van hoge kwaliteit. Bovendien zijn alle competente cellen van NEB vrij van dierlijke producten.

Gist

NEB biedt chemisch competente Kluyveromyces lactis cellen en varianten van deze stam die zijn afgestemd op specifieke behoeften op het gebied van eiwitexpressie. Deze cellen zijn geschikt voor transformatie met elk van onze gelineariseerde expressievectoren uit de pKLAC-reeks.

E coli voor eiwitexpressie

NEB biedt verschillende stammen met verschillende niveaus van expressiecontrole, elk met T1-faagresistentie en extreem hoge transformatie-efficiënties.

Kies Type:

Toekomstige artikelen

Lees hoe u veelvoorkomende obstakels in eiwitexpressie kunt vermijden die interacties met cellulaire machines voorkomen.

Brochures

Selectiehulpmiddelen

Gidsen voor probleemoplossing

Gebruiksrichtlijnen

Dit product valt onder een of meer patenten, handelsmerken en/of auteursrechten die eigendom zijn van of beheerd worden door New England Biolabs, Inc (NEB).

Hoewel NEB haar producten voor verschillende toepassingen ontwikkelt en valideert, kan het voor het gebruik van dit product van de koper zijn dat hij voor bepaalde toepassingen aanvullende intellectuele eigendomsrechten van derden moet verkrijgen.

Neem voor meer informatie over commerciële rechten contact op met het Global Business Development-team van NEB via [email protected]

Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden. Dit product is niet bedoeld voor therapeutische of diagnostische doeleinden bij mensen of dieren.

Videos

Een transformatie uitvoeren met NEB & reg-bevoegde cellen

Gebruik dit protocol voor maximale transformatie-efficiëntie.

Tips voor succesvolle transformaties met NEB & reg competente cellen

Volg deze tips om superieure resultaten te krijgen.

Oplossingen voor de expressie van moeilijke eiwitten

NEB heeft een lange geschiedenis in de expressie van recombinante eiwitten en heeft een breed scala aan oplossingen ontwikkeld voor eiwitten die moeilijk tot expressie kunnen worden gebracht.

Snelle transformatie plating met glasparels

Bekijk in deze video hoe transformatieplateren snel en gemakkelijk kan met glasparels.


Soorten kunstmatig competente cellen

Er zijn twee soorten kunstmatig competente cellen: chemisch competente en elektrocompetente.

Chemisch competente cellen

Chemisch competente cellen zijn cellen die competent zijn gemaakt met een zoutbehandeling gevolgd door een hitteschokstap. Dit proces permeabiliseert het celmembraan, waardoor het plasmide binnenkomt. Protocollen met behulp van CaCl2 of MgCl2 zijn de meest gebruikelijke methode voor het maken van chemisch competente cellen, maar sommige protocollen omvatten andere zouten of combinaties van verschillende zouten en chemicaliën.

Lijst van zouten en chemicaliën die worden gebruikt om chemisch competente cellen te maken

  • CaCl2: Neutraliseert de negatieve ladingen van de fosfolipide dubbellaag en DNA.
  • DMSO: DMSO verzamelt zich bij de hydrofiele koppen van de lipidedubbellaag, waardoor de krachten worden verzwakt. Naarmate de DMSO-concentratie toeneemt, neemt de dikte van de dubbellaag af, waardoor de membraanpermeabiliteit toeneemt.
  • MgCl2: Werkt op dezelfde manier als CaCl2, maar zorgt voor een betere DNA-binding aan de cel.
  • PIN: Beschermt de negatieve ladingen van de fosfolipide dubbellaag en het DNA.
  • RbCl: Werkt op dezelfde manier als CaCl2 en MgCl2. Sommige onderzoekers geven de voorkeur aan RbCl wanneer hogere competentie vereist is.

Welke rol speelt CaCl2 en hitteschokbehandeling spelen bij het maken van competente cellen?

Bij het maken van chemisch competente cellen, omvat de eerste stap het gebruik van een zout, typisch CaCl2 of MgCl2. De zout (chemische) behandeling neutraliseert de negatieve ladingen van de fosfaatkoppen en het negatief geladen DNA. Het neutraliseren van deze ladingen elimineert de natuurlijke afstoting, waardoor het DNA dichter bij de cel kan komen.

De heat-shock-stap omvat het snel afkoelen en verwarmen van cellen, wat leidt tot tijdelijke poriën waardoor DNA de cel kan binnendringen. Het mechanisme achter hoe dit echt werkt, wordt niet goed begrepen. Eén studie suggereert de oorzaken van de hittepulsstap E coli om lipiden van het oppervlak vrij te maken, waardoor tijdelijke poriën ontstaan ​​waardoor DNA de cel kan binnendringen.

Elektrocompetente cellen

Elektrocompetente cellen worden competent gemaakt met behulp van een elektrische puls van een elektroporator om tijdelijke poriën (poratie) in het celmembraan van prokaryotische of eukaryote cellen te creëren. De elektrische puls verstoort het celmembraan en veroorzaakt een lichte herschikking van de lipidedubbellaag, waardoor exogeen materiaal de cel kan binnendringen. Hoewel exogeen materiaal de cel kan binnendringen vanwege de verhoogde permeabiliteit, kan tijdens het proces ook celmateriaal verloren gaan.

Onderzoekers kiezen om verschillende redenen voor elektroporatie. Een hogere transformatie-efficiëntie van deze methode in vergelijking met andere methoden is een reden voor de keuze. Een andere reden waarom onderzoekers elektroporatie zouden kunnen gebruiken, is om ander materiaal, zoals nieuwe medicijnen of moleculaire sondes, in de cel te introduceren.

Hoe werkt elektroporatie?

De fosfolipide dubbellaag zijn dubbele ketens van fosfolipiden (fosfolipiden zijn samengesteld uit een hydrofiele kop en een hydrofobe staart). De hydrofiele koppen van de dubbellaag zijn naar buiten gericht: de ene rij is gericht naar de extracellulaire ruimte, terwijl de andere rij naar de intracellulaire vloeistof is gericht. De hydrofobe staarten zijn naar binnen gericht, dat wil zeggen, het interne deel van de dubbellaag. Wanneer spanning van elektroporatie wordt toegepast, herschikt de elektrische puls de oriëntatie van de dubbellaag op een manier die een opening vormt. Raadpleeg de onderstaande afbeelding.

Het verschil tussen omkeerbare en onomkeerbare elektroporatie

Omkeerbare elektroporatie (RE) omvat een spanning tot 1 kV. Cellen die omkeerbare elektroporatie ondergaan, kunnen de effecten van membraanpermeatie overleven en herstellen (het celmembraan kan daarna opnieuw worden afgesloten). Moleculair biologen gebruiken deze techniek om tijdelijk door het celmembraan te dringen om vreemd moleculair materiaal, zoals DNA, in een cel te brengen.

Onomkeerbare elektroporatie (IRE) omvat tot 3 kV gelijkstroom. In tegenstelling tot omkeerbare elektroporatie waarbij membraannanoporiën tijdelijk zijn, creëert onomkeerbare elektroporatie permanente poriën die uiteindelijk leiden tot apoptose (geprogrammeerde celdood). Onderzoekers gebruiken IRE voor de behandeling van tumoren. Daarom zal IRE geen methode zijn die wordt gebruikt voor moleculaire transformatie en transfectie.

Voor meer informatie over competente cellen en transformatie, blader door bronnen op de competente celpagina van GoldBio die hier te vinden is: https://www.goldbio.com/collection/competent-cells


Restrictie-enzymen en klonen

Dit gedeelte over klonen bevat informatie die een noodzakelijke basis is voor onderzoekslaboratoria, maar die van tijd tot tijd nodig kan zijn in klinische laboratoria wanneer er iets heel interessants wordt gevonden in het moleculaire laboratorium. Het klonen van een gensequentie (of een deel) is ook vereist om stabiele templates te hebben voor de productie van probes, of om dat interessante PCR-product te bewaren. Langdurige opslag van PCR-producten zonder ze te klonen, maakt ze vatbaar voor afbraak door bacteriële exonucleasen (enzymen die DNA van de uiteinden verteren). Restrictie-enzymen zijn de ruggengraatreagentia van klonen, maar worden gebruikt in klinische toepassingen die verband houden met vingerafdrukken - genetische identiteit, epidemiologie en als voorbereiding op blotting voor andere toepassingen.

Klonen Stap 1: restrictievertering.
Dit is een stap die in wezen DNA in kleine stukjes knipt. Bedenk uit module subset II-a dat er ook materiaal was over restrictie-enzymdigestie dat enige achtergrond heeft gegeven voor deze sectie en ook de toepassing van restrictiedigesties op identificatie omvatte (DNA-fingerprinting). De moleculaire scharen worden restrictie-endonucleasen genoemd. Bedenk dat restrictie-endonucleasen enzymen zijn die DNA splitsen. Ze zijn afgeleid van bacteriën waar ze functioneren bij het splitsen van vreemd DNA en zo de integriteit van de gastheerbacteriën beschermen (een bacterieel immuunsysteem). Deze enzymen herkennen specifieke basensequenties in dubbelstrengs DNA. De basenvolgorde dient als een code voor het restrictie-enzym dat zegt "cut here". Het enzym met het label EcoRI herkent bijvoorbeeld de GAATTC-sequentie van basen en knipsels tussen de G en A.

De plaatsen op het DNA-molecuul die door de enzymen worden herkend, worden restrictieplaatsen genoemd. Restrictiesites zijn palindroom en lezen dezelfde 5' → 3' op beide strengen van het DNA. De verschillende enzymen zijn genoemd naar de bacteriën waarvan ze zijn afgeleid. Eco is bijvoorbeeld afgeleid van Escherichia coli en Hin van Haemophilus influenzae. U zult merken dat het eerste paneel boven de snede geen overhang achterlaat en een stompe snede wordt genoemd met stompe uiteinden. Elk stomp uiteinde kan worden samengevoegd met elk ander stomp uiteinde - iets om te onthouden bij het klonen van PCR-producten. Het andere paneel toont een snede die overhangende uiteinden laat die ofwel 5' of 3' overhangen worden genoemd, afhankelijk van welke streng overhangt.

Er kunnen enzymen worden gekozen die aan weerszijden van een gewenste DNA-sequentie zullen splitsen. In deze gevallen zijn knipplaatsen vooraf bepaald door de sequentie van nucleotiden te vinden die coderen voor een specifiek eiwit of kenmerk. In andere gevallen zullen verschillende endonucleasen worden geprobeerd.

Zodra het DNA restrictiedigestie heeft ondergaan, kan het worden gebruikt om te recombineren met elk ander stuk DNA dat de complementaire uiteinden heeft, ongeacht de bron van dat DNA. Hierdoor kan een DNA-segment worden ingevoegd in een plasmide dat is gesplitst met hetzelfde enzym(en)

Universiteit van Calgary Biotechnologie Training Center


SIG10 chemisch competente cellen

De SIG10 chemisch competente cellen zijn een afgeleide van: Escherichia coli die zijn geoptimaliseerd voor een hoge transformatie-efficiëntie.
Deze cellen zijn ideaal voor het klonen en vermeerderen van plasmide-, cosmide- of fosmideklonen en zijn zeer efficiënt voor routinematige kloneringstoepassingen.
Ze delen de meest bruikbare genetische elementen van standaard kloneringsstammen zoals DH5a™ DH10B™, JM109, TOP10, enz. en vervangen ze rechtstreeks in kloneringsprotocollen.
Ze worden geleverd in porties van 40 L, 80 L en 160 L, die elk voldoende zijn voor respectievelijk één, twee en vier transformaties.
De cellen hebben een transformatie-efficiëntie van >1 x 109 cfu/μg
Het formaat met 96 putjes wordt geleverd in hoeveelheden van 20 L per putje en heeft een transformatie-efficiëntie van >1 x 108 cfu/μg.

Genotype
F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) endA1 recA1 Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 araD139 Δ(ara,leu)7697 galU galK rpsL nupG λ- tonA


Plantae

Planten zijn uiterst belangrijk voor al het leven op aarde, omdat ze zuurstof, onderdak, kleding, voedsel en medicijnen leveren aan andere levende organismen.

Deze diverse groep omvat vaat- en niet-vatplanten, bloeiende en niet-bloeiende planten, evenals zaaddragende en niet-zaaddragende planten. Zoals geldt voor de meeste fotosynthetische organismen, zijn planten primaire producenten en ondersteunen ze het leven voor de meeste voedselketens in de belangrijkste biomen van de planeet.


Elke cel in je lichaam weet hoe het DNA moet repliceren, maar jij niet.

En ja, ik weet dat cellen eigenlijk niets "weten"

Bewerken: aan alle mensen die PCR zeggen - ja ik weet ook hoe dat werkt, maar dan werkt de grap niet!

als je je cellen bent, weet je dat technisch ook niet, alleen niet bewust als je begrijpt wat ik bedoel.

Het probleem hiermee is om te definiëren wat is jij

Het lijkt op je automatische lichaamsfuncties (zoals het rondpompen van bloed, ademhalen en het aanmaken van antilichamen). Je lichaam zorgt ervoor dat het gebeurt, maar je hebt er geen controle over.

Dat is waar, tenzij je moleculaire biologie studeert. Of je beschouwt je cellen als 'jij'.

Je hoeft niet eens te bestuderen dat je er waarschijnlijk mee in aanraking komt in algemene bio of chemie. Polymerase kettingreactie, google het gerust voor een voorbeeld.

Ja grappen over OP, ik kweek dagelijks plasmiden in competente cellen.

vals. Ik heb het gedaan. Ik ben een identieke tweeling.

Het repliceren van DNA is eenvoudig. Daarom zijn het twee strengen. Breek de strengen uit elkaar en vorm de ontbrekende in elk.

Hoe DNA in godsnaam een ​​heel mens uitdrukt, dat is iets heel anders.


Hoe is Laminin een icoon van het christendom geworden?

Een argument dat in het moderne christendom heel gewoon is geworden, wordt goed geïllustreerd door de relatie van de structuur en functie van laminine tot bijbelse waarheden. Dit kleine, onbekende eiwit werd populair nadat het in een preek was gebruikt. Het onderwerp laminine verscheen al snel in veel e-mails en blogs, en uiteindelijk vond zijn vorm zijn weg naar merchandising (bijv. T-shirts en koffiemokken).

In een preek vraagt ​​Louie Giglio hoe we kunnen weten dat God ons bij elkaar zal houden (wat hij afleidt uit Psalm 33). Hij zegt: "Dat is echt wat we vandaag willen weten, en ik zal je vertellen hoe je vandaag kunt weten dat God je altijd bij elkaar zal houden, wat er ook gebeurt." De heer Giglio bespreekt vervolgens de functie van laminine (als lijm) en zijn structuur (een kruis) in het lichaam. Hij vertelt dit aan Kolossenzen 1:17, waar staat: “Hij [Christus] is vóór alle dingen, en in hem houden alle dingen samen. Zijn argument is eigenlijk dat God laminine in de vorm van een kruis heeft ontworpen en het de specifieke functie van "lijm" in het lichaam heeft gegeven, zodat we (in zijn woorden) de waarheid kunnen weten dat Christus alle dingen bij elkaar houdt.


In de psychologie is internalisatie het resultaat van een bewuste geest die redeneert over een specifiek onderwerp, het onderwerp is geïnternaliseerd en de overweging van het onderwerp is intern. Verinnerlijking van idealen kan plaatsvinden na religieuze bekering, of in het proces van, meer in het algemeen, morele bekering. [1] Internalisatie wordt direct geassocieerd met leren binnen een organisme (of bedrijf) en herinneren aan wat is geleerd.

In de psychologie en sociologie omvat internalisatie de integratie van attitudes, waarden, normen en de meningen van anderen in de eigen identiteit of het zelfgevoel. In de psychoanalytische theorie is internalisatie een proces waarbij het superego wordt gevormd. [2] Veel theoretici zijn van mening dat de geïnternaliseerde gedragswaarden die tijdens de vroege socialisatie zijn geïmplementeerd, sleutelfactoren zijn bij het voorspellen van het toekomstige morele karakter van een kind. De zelfbeschikkingstheorie [3] stelt een motiverend continuüm voor van extrinsieke naar intrinsieke motivatie en autonome zelfregulering. Sommige onderzoeken suggereren dat het morele zelf van een kind zich begint te ontwikkelen rond de leeftijd van drie. [4] Deze vroege jaren van socialisatie kunnen de basis zijn van morele ontwikkeling in de latere kinderjaren. Voorstanders van deze theorie suggereren dat kinderen wiens zelfbeeld 'goed en moreel' is, over het algemeen een ontwikkelingstraject hebben in de richting van prosociaal gedrag en weinig tekenen van antisociaal gedrag.

In een ontwikkelingsstudie bij kinderen [5] onderzochten onderzoekers twee belangrijke dimensies van het vroege geweten - internalisering van gedragsregels en empathische affecten voor anderen - als factoren die toekomstig sociaal, adaptief en competent gedrag kunnen voorspellen. Gegevens werden verzameld uit een longitudinaal onderzoek van kinderen, uit twee oudergezinnen, op de leeftijd van 25, 38, 52, 67 en 80 maanden. De internalisering van de regels van elke ouder en empathie voor de gesimuleerde nood van elke ouder werden waargenomen na 25, 38 en 52 maanden. Ouders en leerkrachten beoordeelden hun adaptief, competent, pro-sociaal gedrag en antisociaal gedrag na 80 maanden. De onderzoekers ontdekten dat zowel de geschiedenis van de vroege internalisering van ouderlijke regels door het kind als de geschiedenis van hun empathie het competente en adaptieve functioneren van de kinderen na 80 maanden voorspelde, zoals beoordeeld door ouders en leraren. Ten tweede, kinderen met een sterkere geschiedenis van internalisering van ouderlijke regels van 25 tot 52 maanden zagen zichzelf als moreel na 67 maanden. Ten derde gingen de kinderen die een sterkere internalisering vertoonden van 25 tot 52 maanden zichzelf als moreel en 'goed' beschouwen. Deze zelfpercepties voorspelden op hun beurt de manier waarop ouders en leraren hun competent en adaptief functioneren na 80 maanden zouden beoordelen.

Als een symptoom

In de gedragspsychologie kan het concept internalisatie ook verwijzen naar stoornissen en gedragingen waarbij een persoon omgaat met stressoren op manieren die niet extern duidelijk zijn. Dergelijke stoornissen en gedragingen omvatten depressie, angststoornis, boulimia en anorexia. [6]

In wetenschappen zoals de biologie is internalisatie een andere term voor endocytose, waarbij moleculen zoals eiwitten worden opgeslokt door het celmembraan en de cel in worden getrokken.

In de economie verklaart internalisatietheorie de praktijk van multinationale ondernemingen (MNO's) om transacties binnen hun organisatie uit te voeren in plaats van te vertrouwen op een externe markt. Het moet voor een multinational goedkoper zijn om de overdracht van zijn unieke eigendomsvoordelen tussen landen te internaliseren dan om dit via markten te doen. Met andere woorden, het alternatief voor internalisering door middel van directe investeringen is een of andere vorm van licentiëring van de knowhow van het bedrijf aan een bedrijf in de doeleconomie.

In de financiële wereld kan internalisatie verwijzen naar verschillende concepten. "Wanneer u een order plaatst om een ​​aandeel te kopen of verkopen, heeft uw makelaar keuzes waar hij uw order wil uitvoeren. In plaats van uw order naar een markt of marketmakers te routeren voor uitvoering, kan uw makelaar de order uit de eigen voorraad van het bedrijf uitvoeren – dit heet 'verinnerlijking'. Op deze manier kan het bedrijf van uw makelaar geld verdienen op de "spread" - dat is het verschil tussen de aankoopprijs en de verkoopprijs." [7] Zie voor een gerelateerd probleem met betrekking tot de uitvoering van transacties, betaling voor orderstroom.