Informatie

Hoe kan ik een virusneutralisatietest voor influenza uitvoeren?


Hoe kan ik een virusmicroneutralisatietest voor influenzavirus uitvoeren met serum van muizen die met dit virus zijn gevaccineerd?


Er zijn een aantal verschillende protocollen, maar de canonieke is gepubliceerd op de WHO Influenza-site:

SEROLOGISCHE DIAGNOSE VAN INFLUENZA DOOR MICRONEUTRALISATIE ASSAY

Het geeft een gedetailleerd, stap voor stap protocol.


Overzicht van testmethoden voor griep

Het testen van het griepvirus is niet vereist om een ​​klinische diagnose van griep te stellen bij poliklinische patiënten met verdenking op griep, met name tijdens verhoogde griepactiviteit wanneer seizoensinfluenza A- en B-virussen in de lokale gemeenschap circuleren. Het testen van influenzavirussen kan het klinische management echter informeren wanneer de resultaten klinische beslissingen kunnen beïnvloeden, zoals het starten van een antivirale behandeling, het uitvoeren van andere diagnostische tests of het implementeren van infectiepreventie- en controlemaatregelen voor influenza. Het testen van het griepvirus wordt aanbevolen voor alle patiënten met verdenking op griep die in het ziekenhuis worden opgenomen. Het belangrijkste is dat clinici de beperkingen van griepvirustests begrijpen en hoe ze de resultaten, met name negatieve resultaten, op de juiste manier kunnen interpreteren. Tijdens een uitbraak van een luchtwegaandoening in een gesloten omgeving (bijv. ziekenhuizen, langdurige zorginstelling, cruiseschip, kostschool, zomerkamp) kan het testen op influenzavirusinfectie zeer nuttig zijn om te bepalen of influenza de oorzaak is van de uitbraak.

Griepvirustesten

Diagnostische tests die beschikbaar zijn voor de detectie van influenzavirussen in ademhalingsmonsters omvatten: moleculaire testen (inclusief snelle moleculaire testen, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) en andere nucleïnezuuramplificatietests) en antigeendetectietests (inclusief snelle diagnostische tests voor influenza en immunofluorescentie-assays). Virale cultuur is belangrijk voor volksgezondheidsdoeleinden, maar biedt geen tijdige resultaten om het klinische management te informeren. De gevoeligheid en specificiteit van een test voor influenzavirussen in ademhalingsmonsters kan variëren afhankelijk van het type testmethode en specifieke test die wordt gebruikt, de tijd vanaf het begin van de ziekte tot het afnemen van het monster, de kwaliteit van het afgenomen monster, de ademhalingsbron van het monster, de behandeling en verwerking van het specimen, en de tijd van specimeninzameling aan het testen. De post-test waarschijnlijkheid of voorspellende waarden (positieve en negatieve voorspellende waarden) van een griepvirustest hangen af ​​van de prevalentie van circulerende seizoensgriepvirussen in de patiëntenpopulatie, en de specifieke testkenmerken (gevoeligheid en specificiteit) in vergelijking met een &ldquogold standard&rdquo vergelijking test (moleculaire test of virale cultuur). Zoals bij elke diagnostische test, moeten de resultaten worden geëvalueerd in de context van andere klinische en epidemiologische informatie die beschikbaar is voor zorgverleners. Serologische testen leveren geen tijdige resultaten op om klinische managementbeslissingen te onderbouwen.

De Infectious Diseases Society of America (IDSA) beveelt het gebruik van snelle moleculaire influenza-assays aan boven snelle diagnostische influenza-tests (RIDT's) voor de detectie van influenzavirussen in respiratoire monsters van poliklinische patiënten. IDSA beveelt het gebruik van RT-PCR of andere moleculaire testen aan voor de detectie van influenzavirussen in ademhalingsmonsters van gehospitaliseerde patiënten. Raadpleeg het externe pictogram van de IDSA Influenza Clinical Practice Guidelines voor aanbevelingen over grieptesten en informatie over de interpretatie van testresultaten.

Tabel 1: Testmethoden voor griepvirus

Snelle moleculaire tests

Snelle moleculaire testen zijn een soort moleculaire diagnostische grieptest om nucleïnezuren van het griepvirus te detecteren in monsters van de bovenste luchtwegen met een hoge gevoeligheid (90-95%) en specificiteit. Er zijn door de FDA goedgekeurde snelle moleculaire testen beschikbaar die binnen ongeveer 15-30 minuten resultaten opleveren. Sommige van deze snelle moleculaire testen zijn CLIA-vrijgesteld voor gebruik op het punt van zorg.

Andere moleculaire tests

Reverse Transcriptie-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) en andere moleculaire testen kunnen de aanwezigheid van influenzavirus-RNA of nucleïnezuren in ademhalingsmonsters met een zeer hoge gevoeligheid en specificiteit identificeren. Sommige moleculaire tests kunnen infecties met influenza A- en B-virussen detecteren en er onderscheid tussen maken. Andere tests kunnen specifieke subtypes van seizoensinfluenza A-virussen [A(H1N1)pdm09 of A(H3N2) identificeren. Deze tests kunnen resultaten opleveren in ongeveer 45 minuten tot enkele uren, afhankelijk van de test. Met name de detectie van viraal RNA of nucleïnezuren van influenza door deze testen duidt niet noodzakelijkerwijs op detectie van een levensvatbaar infectieus virus of lopende virale replicatie van influenza. Het is belangrijk op te merken dat niet alle testen door de FDA zijn goedgekeurd voor diagnostisch gebruik. Er zijn enkele multiplex moleculaire assays beschikbaar die nucleïnezuren van influenzavirussen kunnen detecteren en influenzavirusinfectie kunnen onderscheiden van andere respiratoire pathogenen en die ook nuttig kunnen zijn voor de behandeling van patiënten met ernstige immunosuppressie, of voor gebruik bij het identificeren van de oorzaak van een institutionele uitbraak van luchtwegaandoeningen.

Snelle diagnostische tests voor griep

Snelle diagnostische tests voor influenza (RIDT's) zijn antigeendetectietests die virale influenzaantigenen in 10-15 minuten kunnen detecteren met een matige gevoeligheid (50-70%) en hoge specificiteit. Sommige tests zijn CLIA-vrijgesteld en goedgekeurd voor gebruik in elke poliklinische setting, terwijl andere moeten worden gebruikt in een matig complex klinisch laboratorium. Sommige RIDT's gebruiken een analysatorlezer om de resultaten te standaardiseren om de gevoeligheid te verbeteren (75-80%). FDA vereist nu dat RIDT's 80% gevoeligheid bereiken. Detectie van influenzavirusantigeen duidt niet noodzakelijkerwijs op detectie van levensvatbaar infectieus virus of lopende virale replicatie van influenza.

Geen van de snelle diagnostische tests voor influenza geeft informatie over subtypes van het influenza A-virus. De soorten monsters die acceptabel zijn voor gebruik (d.w.z. nasofaryngeale of nasale aspiraten, uitstrijkjes of wasvloeistoffen) verschillen ook per test. De specificiteit en in het bijzonder de gevoeligheid van snelle diagnostische tests voor influenza zijn lager dan voor viruskweek en RT-PCR en verschillen per test. De meeste van de snelle diagnostische tests voor influenza die kunnen worden uitgevoerd in het kantoor van een arts, zijn ongeveer 50-70% gevoelig voor het detecteren van influenzavirusantigenen en meer dan 90% specifiek. Onlangs heeft de FDA de RIDT's opnieuw geclassificeerd en vereisten gepubliceerd voor verbeterde nauwkeurigheid, inclusief hogere gevoeligheid. Tests met een lage tot matige gevoeligheid en hoge specificiteit kunnen vaker vals-negatieve resultaten opleveren dan vals-positieve resultaten, vooral tijdens piekinfluenza-activiteit in de gemeenschap. Vanwege de lagere gevoeligheid van de snelle diagnostische grieptests, moeten clinici overwegen om negatieve testresultaten te bevestigen met moleculaire tests, vooral tijdens perioden van piekactiviteit in de gemeenschap en/of tijdens vermoedelijke institutionele influenza-uitbraken vanwege de mogelijkheid van fout-negatieve RIDT-resultaten. Vals-positieve RIDT-resultaten zijn daarentegen minder waarschijnlijk, maar kunnen voorkomen en komen vaker voor tijdens perioden van lage griepactiviteit. Daarom moeten clinici bij het interpreteren van de resultaten van een snelle diagnostische grieptest de test in de context van het niveau van griepactiviteit in hun gemeenschap in overweging nemen (zie Algoritme om te helpen bij de interpretatie van grieptestresultaten en klinische besluitvorming tijdens perioden wanneer influenzavirussen circuleren in de gemeenschap en algoritme om te helpen bij de interpretatie van influenzatestresultaten en klinische besluitvorming tijdens perioden waarin influenzavirussen NIET in de gemeenschap circuleren voor meer informatie). Bijsluiters en het laboratorium dat de test uitvoert, moeten worden geraadpleegd voor meer informatie over het gebruik van snelle diagnostische tests voor influenza.

Immunofluorescentie

Immunofluorescentie-assays zijn antigeendetectie-assays die in het algemeen het gebruik van een fluorescentiemicroscoop vereisen om resultaten te produceren in ongeveer 2-4 uur met matige gevoeligheid en hoge specificiteit. Er zijn zowel directe (DFA) als indirecte fluorescente antilichaam (IFA) kleuringsassays beschikbaar om influenza A- en B-virale antigenen in luchtwegmonsters te detecteren. Subtypering of verdere identificatie van influenza A-virussen is niet mogelijk door middel van immunofluorescentie-assays. Een snelle immunofluorescentietest is een RIDT en maakt gebruik van een analyseapparaat om in ongeveer 15 minuten resultaten te produceren.

Virale cultuur

Virale kweekresultaten leveren geen tijdige resultaten op om het klinische management te informeren. De resultaten van de weefselkweek op de schaal van een flacon kunnen 1-3 dagen duren, terwijl de resultaten van de traditionele virale weefselcelcultuur 3-10 dagen kunnen duren. Virale cultuur maakt echter uitgebreide antigene en genetische karakterisering van influenzavirussen mogelijk. Het verzamelen van enkele ademhalingsmonsters voor virale cultuur is essentieel voor de bewaking en antigene karakterisering van nieuwe seizoensinfluenza A- en B-virusstammen die mogelijk moeten worden opgenomen in het griepvaccin van volgend jaar.

Serologische testen

Serologische testen op influenza worden niet aanbevolen voor klinische besluitvorming. Hoewel aangeboden door sommige commerciële laboratoria, kunnen serologische testresultaten voor antilichamen tegen influenza A- of B-virussen op een enkel serummonster niet betrouwbaar worden geïnterpreteerd. Voor de juiste serologische tests voor de diagnose van influenza zijn gepaarde acute en herstellende sera nodig die met een tussenpoos van 2-3 weken worden verzameld, met betrouwbare tests bij een beperkt aantal volksgezondheids- of onderzoekslaboratoria om een ​​viervoudige of grotere stijging van stamspecifieke antilichamen van het influenzavirus te beoordelen. Daarom leveren serologische testen op influenza geen tijdige resultaten op om te helpen bij klinische besluitvorming en worden ze niet aanbevolen, behalve voor onderzoek en volksgezondheidsonderzoeken.

Nieuwe Influenza A-virusinfecties

Als een menselijke infectie met een nieuw influenza A-virus van dierlijke oorsprong (bijv. aviaire influenza A-virus of varkensinfluenza A-virus) wordt vermoed, moet contact worden opgenomen met de lokale en nationale gezondheidsafdeling om RT-PCR uit te voeren voor seizoensinfluenzavirussen en nieuwe influenza A-virussen . In de handel verkrijgbare diagnostische tests voor influenza detecteren niet specifiek nieuwe influenza A-virussen en een positief resultaat voor influenza A-virus kan geen onderscheid maken tussen seizoensinfluenza A-virus en aviaire of varkensinfluenza A-virusinfecties. Informatie over nieuwe influenza A-virussen is beschikbaar op:

Referenties

Merckx J, Wali R, Schiller I, Caya C, Gore GC, Chartrand C, Dendukuri N, Papenburg J. Diagnostische nauwkeurigheid van nieuwe en traditionele snelle tests voor influenza-infectie vergeleken met omgekeerde transcriptase-polymerasekettingreactie: een systematische review en meta-analyse . Ann Stagiair Med. 2017 september 19167 (6): 394-409.

Vos LM, Bruning AHL, Reitsma JB, Schuurman R, Riezebos-Brilman A, Hoepelman AIM, Oosterheert JJ. Snelle moleculaire tests voor influenza, respiratoir syncytieel virus en andere respiratoire virussen: een systematische review van diagnostische nauwkeurigheid en klinische impactstudies. Clin Infect Dis. 2019 jan 28. doi: 10.1093/cid/ciz056. [E-publicatie voorafgaand aan druk]


Microneutralisatie Titer Berekenen

Dit hoofdstuk beschrijft enkele veelgebruikte methoden voor titratie van het influenzavirus, antigene karakterisering en serologische methoden door middel van antilichaamdetectie. Deze methoden zijn niet alleen essentieel voor de karakterisering van virussen, maar ook voor het identificeren van nieuwe antigene varianten, de selectie van vaccinstammen en sero-epidemiologische studies van de transmissie en prevalentie van influenzavirussen. Virustitratiemethoden zoals de hemagglutinatie-assay, 50% infectieuze dosis van eieren of weefselkweek en plaque-assay worden gebruikt om de hoeveelheid virusdeeltjes in een monster te bepalen. De hemagglutinatieremmingstest is een betrouwbare, relatief eenvoudige en goedkope techniek om isolaten van influenzavirussen antigeen te karakteriseren. Serologische methoden zoals virusneutralisatie en hemagglutinatieremming zijn de fundamentele instrumenten die worden gebruikt in sero-epidemiologische onderzoeken naar de transmissie en prevalentie van influenzavirussen en bij de evaluatie van de immunogeniciteit van vaccins. Hoewel serologische methoden zelden een vroege diagnose van acute influenzavirusinfectie opleveren, kunnen goed getimede, gepaarde acute en herstellende serummonsters de diagnose van een recente influenza-infectie stellen, zelfs wanneer pogingen om het virus te detecteren negatief zijn.

Trefwoorden: virustitratie, hemagglutinatietest, plaquetest, 50% infectieuze dosis in eieren, hemagglutinatieremmingstest, 50% infectieuze dosis weefselkweek, microneutralisatie, virusneutralisatie, neutraliserende antilichamen, griep

1. Inleiding

Er zijn een aantal methoden voor de titratie van het influenzavirus op basis van zijn biologische kenmerken, zoals het vermogen van het virus om rode bloedcellen (RBC's) van verschillende soorten te agglutineren (1). Het vermogen van infectieuze en niet-infectieuze virusdeeltjes om RBC te agglutineren is de basis van de hemagglutinatietest (HA). De plaque-assay, 50% infectieuze dosis weefselkweek (TCID50) en 50% infectieuze dosis eieren (EID50) zijn methoden die worden gebruikt om de hoeveelheid infectieus

Yoshihiro Kawaoka en Gabriele Neumann (eds.), Influenza Virus: methoden en protocollen,

Methoden in Moleculaire Biologie, vol. 865, DOI 10.1007/978-1-61779-621-0_3, © Springer Science+Business Media, LLC 2012

virusdeeltjes in een monster. Serologische methoden zoals virusneutralisatie en hemagglutinatieremming (HAI) zijn de fundamentele instrumenten die worden gebruikt in sero-epidemiologische onderzoeken naar de transmissie en prevalentie van influenzavirussen en bij de evaluatie van de immunogeniciteit van vaccins. Beide testen zijn gebaseerd op de binding van antilichamen aan hemagglutinine (HA), het belangrijkste oppervlakteglycoproteïne van influenza. Neutraliserende antilichamen gericht tegen HA zijn de belangrijkste mediator van beschermende immuniteit tegen influenza.

Een juiste virustitratie is essentieel voor de analyse van antigene eigenschappen van belangrijke oppervlakte-eiwitten van het virus, het hemagglutinine en het neuraminidase. Vergelijkende antigene analyse van verschillende stammen met behulp van standaard antiserum, met name van fretten na infectie, speelt een belangrijke rol bij het volgen van antigene evolutie van influenzavirussen van verschillende typen en subtypen. Antigene karakterisering is een belangrijk hulpmiddel bij de selectie van de meest recente vaccinstammen.

De standaardmethode voor titratie van het influenzavirus is gebaseerd op het vermogen van het virus hemagglutinine (HA) om rode bloedcellen van verschillende soorten te agglutineren (zie opmerking 1). Gewoonlijk worden aviaire RBC's, zoals van kippen of kalkoenen, gebruikt in de hemagglutinatietest (zie opmerking 2). Aviaire RBC zijn klein en hebben kernen, ze bezinken snel en vormen een compacte knop op de bodem van de microtiterplaat met V-wells in afwezigheid van het virus, waardoor een duidelijke bepaling van de eindpuntverdunning wordt verkregen. RBC van zoogdieren zonder kern (mens, cavia, paard, enz.) verschijnen als een "halo" of cirkel van bezonken cellen op de bodem van de controleputjes van de microtiterplaat met U-putjes, wat het aflezen van de eindpuntverdunning moeilijk maakt.

De hemagglutinatie (HA)-test is afhankelijk van de hoeveelheid hemagglutinine op het oppervlak van influenzavirussen en niet van het vermogen van het virus om te repliceren (2). De HA-assay is in staat om virale deeltjes te kwantificeren, ongeacht de besmettelijkheid. Het HA-eindpunt wordt bepaald door de hoogste verdunning van het virus die volledige hemagglutinatie veroorzaakt. De HA-titer is het omgekeerde van de verdunning van het virus in het laatste putje met volledige hemagglutinatie. Een HA-eenheid (HAU) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid virus die nodig is om een ​​gelijk volume gestandaardiseerde RBC's te agglutineren (3). Deze "eenheid" van hemagglu-tinatie is een operationele eenheid en geen maat voor een absolute hoeveelheid virus. Het in celkweek geïsoleerde influenzavirus, zoals de Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-cellijn of geëmbryoneerde kippeneieren, wordt getitreerd door het uitvoeren van een tweevoudige seriële verdunning van het geïsoleerde supernatant in een buffer met behulp van een microtiterplaat met 96 putjes. Het eerste putje bevat alleen het isolaat, het tweede en volgende putjes bevatten 50 ml buffer en het verdunde virus. De HAU's worden gebruikt in de HAI-test om de gestandaardiseerde verdunning van antigeen te bepalen die nodig is om de test uit te voeren.

De EID50 is een biologische methode om de hoeveelheid infectieus virus in een monster te bepalen door de hoogste verdunning van het monster te bepalen die 50% van de geëmbryoneerde kippeneieren kan infecteren.

Deze test omvat het uitvoeren van seriële verdunningen van het eimonster. Om de verdunning te bepalen die nodig is om een ​​50% positief resultaat te verkrijgen, wordt de Reed-Muench-methode gebruikt (4). De Reed-Muench-methode vereist het gebruik van drie of meer eieren per verdunning om het 50% eindpunt te bepalen door een hemagglutinatietest uit te voeren voor elk geïnoculeerd ei.

De plaque-assay is gebaseerd op het vermogen van het influenzavirus om plaques te vormen in een celmonolaag die is bedekt met agar of agarose (5, 6). De plaques worden gevormd door het cytopathische effect (CPE) veroorzaakt door het virus en de dood van de geïnfecteerde cellen, wat leidt tot de vorming van cirkelvormige zones van gelyseerde cellen op de monolaag. Alleen infectieuze virusdeeltjes mogen de gastheercel infecteren en een plaque kunnen produceren. Plaque Forming Units (PFU) is een kwantitatieve maat voor de hoeveelheid infectieus virus in een monster door het aantal plaques te bepalen dat in een celmonolaag wordt gevormd (meestal worden MDCK-cellen gebruikt). Bij een hoge verdunning van de virusvoorraad vertegenwoordigt elke plaque de zone van cellen die zijn geïnfecteerd door een enkel virusdeeltje. Daarom kan de titer van een virusvoorraad worden berekend in PFU per milliliter. De plaque-assay wordt uitgevoerd door tienvoudige seriële verdunningen uit te voeren en vervolgens de celmonolaag te infecteren. Een agarose-overlay wordt in de putjes van de geïnfecteerde celmonolaag geplaatst. De agarose wordt verwijderd, het virus wordt geïnactiveerd met ethanol en kristalviolet wordt aan de monolaag toegevoegd om de plaques zichtbaar te maken.

Specifieke antilichaamhechting aan antigene plaatsen op het HA-molecuul verstoort de binding tussen het virale HA en receptoren op RBC's. Dit effect remt hemagglutinatie en vormt de basis voor de HAI-assay. De HAI-test, oorspronkelijk beschreven door Hirst (7) en later gewijzigd door Salk (8), wordt momenteel uitgevoerd in microtiterplaten met 96 putjes. In het kort wordt een gestandaardiseerde hoeveelheid HA-antigeen gemengd met seriële verdunningen van antiserum en worden RBC's toegevoegd om de specifieke binding van antilichaam aan het HA-molecuul te bepalen. De aanwezigheid van specifieke anti-HA-antilichamen remt de agglutinatie, die anders zou optreden tussen het virus en de rode bloedcellen (7). Deze test is betrouwbaar, relatief eenvoudig en een goedkope techniek. Beperkingen van de HAI-test zijn onder meer de noodzaak om niet-specifieke agglutinines in sommige serummonsters te verwijderen, aangezien deze fout-negatieve resultaten kunnen veroorzaken, de noodzaak om de virusconcentratie te standaardiseren telkens wanneer een test wordt uitgevoerd, en de noodzaak van gespecialiseerde expertise in het lezen van de resultaten van de test.

De microneutralisatietest is een zeer gevoelige en specifieke test voor het identificeren van influenzavirus-specifieke, neutraliserende antilichamen in dierlijke en menselijke sera (9). De 2-daagse test wordt in twee fasen uitgevoerd. Op dag 1 van de test (1) een virus-antilichaamreactiestap, waarbij het virus wordt gemengd met verdunningen van serum en de antistoffen de tijd krijgen om te reageren en (2) een inoculatiestap, waarbij het virus-serummengsel wordt geïnoculeerd in het geschikte gastheersysteem, MDCK-cellen in deze test. Op dag 2 van de test wordt een ELISA uitgevoerd om met virus geïnfecteerde cellen te detecteren. De afwezigheid van besmettelijkheid vormt een positieve neutralisatiereactie en duidt op de aanwezigheid van virusspecifieke antilichamen in het serummonster. De serummonsters die de voorkeur hebben in gevallen van griepachtige ziekte zijn gepaarde acute en herstellende serummonsters, waarbij de acute minder dan 7 dagen na het begin van de symptomen worden verzameld en de herstellende ten minste 14 dagen na het acute monster en idealiter binnen 2-3 maanden na ziekte begin. Een viervoudige of grotere stijging van de antilichaamtiter wijst op een seroconversie en wordt als diagnostisch beschouwd. Bij enkelvoudige serummonsters moet voorzichtigheid worden betracht bij het interpreteren van lage titers zoals 20 en 40. Over het algemeen is kennis van de antilichaamtiters in een op leeftijd afgestemde controlepopulatie nodig om een ​​minimale titer te bepalen die indicatief is voor een specifieke antilichaamrespons op de virus gebruikt in de test.

Conventionele neutralisatietests voor influenzavirussen op basis van de remming van CPE-vorming en/of detectie van hemagglutinatie-activiteit in MDCK-celculturen zijn arbeidsintensief en tamelijk traag. Doorgaans wordt CPE afgelezen op dag 3-7. De hier beschreven microneutralisatietest maakt gebruik van een ELISA op dag 2 van de test om met virus geïnfecteerde cellen te detecteren. Studies hebben aangetoond dat neutralisatietesten die gebruik maken van ELISA om met virus geïnfecteerde cellen te detecteren, minder variabel zijn dan neutralisatie geëvalueerd met behulp van CPE en/of detectie van hemagglutinatieactiviteit, mogelijk vanwege de langere duur van dergelijke testen, het gebruik van een eindpunt dat hoger is moeilijk te meten dan absorptie, en/of het gebruik van voorgevormde monolagen (10, 11). De stappen die betrokken zijn bij de microneutralisatietest van het influenzavirus zijn de volgende. Serieel verdunde sera worden voorgeïncubeerd met een gestandaardiseerde hoeveelheid virus voorafgaand aan de toevoeging van MDCK-cellen. Serumneutraliserende antilichamen tegen hemagglutinine van het influenzavirus remmen de infectie van MDCK-cellen met virus. Na een nacht incubatie worden de cellen gefixeerd en wordt de aanwezigheid van influenza A-virus nucleoproteïne (NP) in geïnfecteerde cellen gedetecteerd door middel van ELISA. De detectie van NP wijst op de afwezigheid van neutraliserende antilichamen bij die serumverdunning.

De microneutralisatietest geeft het meest directe antwoord op de vraag of een individu antilichamen heeft die de besmettelijkheid van een bepaalde virusstam kunnen neutraliseren. De test heeft verschillende extra voordelen voor het detecteren van antistoffen tegen het influenzavirus. Ten eerste detecteert de test voornamelijk antilichamen tegen het virus hemag-glutinine en kan dus functionele, stamspecifieke antilichamen in dierlijke en menselijke sera identificeren. Ten tweede, aangezien infectieus virus wordt gebruikt, kan de test snel worden ontwikkeld na herkenning van een nieuw virus en is beschikbaar voordat geschikte gezuiverde virale eiwitten beschikbaar komen voor gebruik in andere tests. Het gebruik van levend virus in deze test impliceert echter ook de noodzaak van naleving van richtlijnen voor bioveiligheid zoals uiteengezet in de Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm).

2.1. Hemagglutinatie 1. Microtiterplaten met 96 putjes (Nunc, Thermo Fisher Scientific): Titratie-assay V-bodem voor RBC's van vogels of U-bodem voor RBC's van zoogdieren.

2. 0,01 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,2-7,4 (Invitrogen, Corporation, Cat. # 4539).

3. Gestandaardiseerde RBC's (zie Opmerkingen 1 en 2): 0,5% voor aviaire en 0,75% voor zoogdier-RBC. Filtreer RBC's door steriel gaas, centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 minuten bij 4-8°C, aspireer plasma, alsevers en buffy coat, voeg PBS toe, centrifugeer en herhaal tweemaal. Resuspendeer RBC's in PBS en pas aan tot de vereiste concentratie. Bewaren bij 4-8°C (zie opmerking 3).

2.2.50% Ei 1. 9 tot 11 dagen oude geëmbryoneerde kippeneieren, gekaard om ervoor te zorgen

Infectieuze dosis dat de embryo's levensvatbaar zijn (zie opmerking 4).

2. Virusverdunningsmiddel: vul 10 ml PBS aan met 1 ml penicilline-streptomycine-oplossing (100 E/ml penicilline G en 100 mg/ml streptomycine) (Invitrogen, Cat. # 15140) en 0,2 ml 50 mg/ml gentamicinevoorraad (10 mg /ml) (Invitrogen, Cat. # 15750060). Filter met een 0,2 mm membraanfilter en tot 2 maanden houdbaar bij 4-8°C.

3. Gestandaardiseerde RBC's (0,5% voor vogels en 0,75% voor zoogdieren), filtreer door steriel gaas, centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min bij 4-8°C, aspireer plasma, alsevers en buffy coat, voeg PBS toe, centrifugeer en herhaal tweemaal. Resuspendeer RBC in PBS tot de noodzakelijke concentratie. Bewaren bij 4-8°C.

4. Microtiterplaten met 96 putjes (Nunc, Thermo Fisher Scientific): V-bodem voor RBC's van vogels of U-bodem voor RBC's van zoogdieren.

2.3. Plaque-assay 1. 2x Plaque-assaymedium: Dulbecco's gemodificeerd Eagle's-medium

(DMEM) (Invitrogen) aangevuld met penicilline-streptomycine (100 E/ml penicilline G en 100 mg/ml streptomycine), l-glutamine 4 mM en HEPES-buffer 50 mM. Om te steriliseren, filtreer door een 0,2 mm membraanfilter. Niet langer dan 2 maanden bewaren bij 4-8°C.

2. Lonza SeaKem Le Agarose (Thermo-Fisher Scientific, Cat. # 5004).

3. MDCK-cellen (ATCC# CCL-34) confluent in weefselkweekplaten met 6 putjes (Nunc, Thermo-Fisher Scientific, Cat. # 150239).

4. Wasmedium voor plaque-assay: vul 490 ml DMEM aan met 5 ml penicilline-streptomycine (100 E/ml penicilline G en 100 mg/ml streptomycine). Filtreer door een 0,2 mm membraanfilter. Bij 4-8°C tot 2 maanden houdbaar.

5. l-1-Tosylamide-2-fenylethylchloormethylketon (TPCK)-trypsine (2 mg/ml) werkoplossing: supplement 10 ml identificatie van bepaalde producten wordt verstrekt als richtlijn om te helpen bij de selectie van gelijkwaardige, geschikte producten

DMEM met 20 mg TPCK-behandeld type XIII trypsine uit runderpancreas (Sigma-Aldrich, Cat. # T1426-100 mg). Steriliseren door middel van filtratie. Bewaren in kleine hoeveelheden bij -70 tot -80°C tot de vroegste houdbaarheidsdatum van de producten.

7. Gramkristalviolette primaire kleurstof (Becton, Dickinson, and Company, Cat. # 212525).

2.4. Hemagglutinatie 1. Receptor vernietigend enzym (RDE) (II) "Seiken" (Denka Seiken Inhibition Assay Co, Ltd.), opgelost in fysiologische zoutoplossing (0,85% NaCl).

3. Microtiterplaten met 96 putjes (Nunc, Thermo Fisher Scientific): V-bodem voor RBC's van vogels of U-bodem voor RBC's van zoogdieren.

4. Gestandaardiseerde RBC's (0,5% voor vogels en 0,75% voor zoogdieren): filtreer RBC's door steriel gaas, centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min bij 4-8°C, aspireer plasma, alsevers en buffy coat, voeg PBS toe, centrifugeer en twee keer herhalen. Resuspendeer RBC's in PBS tot de vereiste concentratie. Bewaren bij 4-8°C (zie opmerking 3).

2.5. MDCKCell Culture 1. MDCK-medium bereid uit DMEM (Invitrogen, Cat. #

11965-092), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (Hyclone Cat. # SH30070.03), 100 E/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine (Invitrogen, Cat. # 15140-122) en 2 mM l-glutamine (Invitrogen Cat. # 25030-081). Steriliseren door filtratie.

2. Oplossing van trypsine (0,05%) en ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (Invitrogen, Cat. # 25300-054) (zie opmerking 5).

2.6. TCID-assay De materialen die nodig zijn voor de TCID zijn dezelfde als die vermeld voor het bepalen van de werking van de microneutralisatieassay.

Verdunning van virus voor microneutralisatie

2.7. Microneutra 1. Virusverdunningsmiddel bereid met DMEM, aangevuld met 1% lization Assay runderserumalbumine (BSA) (fractie V, proteasevrij, Roche,

Kat. # 03117332001, bereid als een 10% w/v oplossing in dH2O, gefilterd gesteriliseerd en bewaard bij 4-8°C) 100 E/ml penicilline, 100 mg/ml streptomycine en 20 mM HEPES (Invitrogen, Cat. # 15630 -080). Bereid vers voor elke test. Steriliseren door filtratie.

2. PBS (0,01 M PBS, pH 7,2). Steriliseren door autoclaveren.

3. Fixatief: koude 80% aceton in PBS. Bereid en gebruik 80% aceton in een BSC die extern wordt geventileerd of in een chemische kap. Draag standaard persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder latex- of nitrilhandschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril. De dag voor gebruik klaarmaken en bewaren bij -20°C. Het is van cruciaal belang dat het fixeermiddel koud is bij gebruik. Na gebruik op de juiste manier weggooien.

4. Wasbuffer: PBS + 0,3% Tween 20 (Sigma-Aldrich, Cat. P1379). Dagelijks vers bereiden.

5. Antilichaamverdunningsmiddel: PBS + 0,3% Tween 20 + 5% w/v melk (magere droge melk). Dagelijks vers bereiden. Er is ongeveer 1 L nodig voor 40 microtiter-assayplaten.

6. 1° antilichaam: Anti-influenza A NP-muis monoklonaal antilichaam (Millipore, Cat. # MAB8257 en MAB8258, beide gezuiverde Ig mengen gelijke hoeveelheden). Verdun in antilichaamverdunningsmiddel bij optimale concentratie zoals bepaald door titratie (zie subrubriek 3.7.2, stappen 5-11).

7. 2° Antilichaam: Geiten-anti-muis IgG geconjugeerd aan mierikswortelperoxidase (hRP) (KPL, Cat. # 074-1802). Verdun in antilichaamverdunningsmiddel bij optimale concentratie zoals bepaald door titratie (zie subrubriek 3.7.2, stappen 1-4).

8. Substraat: a-fenyleendiaminedihydrochloride (OPD) in citraatbuffer. Bereid citraatbuffer door een buffercapsule (Sigma-Aldrich Cat. # P4922) te mengen met 100 ml dH2O. De inhoud van één capsule opgelost in 100 ml dH2O levert 0,05 M fosfaat-citraatbuffer op, die 0,03% natriumperboraat bevat als vervanging voor H2O2, pH 5,0 bij 25°C. Hanteer OPD-tabletten in een BSC met externe ventilatie of in een chemische kap. Draag standaard persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder latex- of nitrilhandschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril. Nadat de tabletten zijn opgelost, kan het substraat worden gebruikt op de BSL-2 laboratoriumtafel. Bereid OPD onmiddellijk voor gebruik voor door OPD-tabletten (Sigma-Aldrich, Cat. # P8287) toe te voegen aan citraatbuffer, één tablet voor elke 20 ml citraatbuffer. Na gebruik op de juiste manier weggooien.

9. OPD-stopoplossing (0,5 M zwavelzuur). Voeg 28 ml geconcentreerd zwavelzuur (18 M) toe aan 972 ml dH2O om 0,5 M zwavelzuur te verkrijgen. Bereid deze oplossing voor in een BSC die extern wordt geventileerd of in een chemische kap. Na toevoeging van dH2O kan de stopoplossing worden gebruikt op de BSL-2 laboratoriumtafel. Draag standaard persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder latex- of nitrilhandschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril. Bewaar na bereiding 0,5 M H2SO4 op het werkblad. Na gebruik op de juiste manier weggooien.

10. Influenzavirus (zie opmerking 6). De TCID (weefselkweek infectieuze dosis) moet worden bepaald voor elk lotnummer van het virus voordat een MN-assay wordt gestart. Virus dat in MDCK-cellen of in de allantoïsvloeistof van eieren wordt vermeerderd, moet worden bewaard bij -70°C of kouder in porties voor eenmalig gebruik. Kort voor gebruik snel ontdooien en op ijs zetten. Zodra de virusverdunning voor de test is gemaakt, moet het resterende virus in de ontdooide hoeveelheid op de juiste manier worden weggegooid. Virus dat opnieuw is ingevroren, mag niet worden gebruikt.

11. Serummonsters om te testen. Alle serummonsters moeten ingevroren worden bewaard bij -20 tot -80°C. Ontdooi serummonsters snel bij 37°C

waterbad. Zodra ontdooid, plaats op ijs. Bewaar op ijs of bij 4-8°C tot terug in de vriezer. Als de volgende dag met hetzelfde aliquot wordt getest, is het acceptabel om serummonsters een nacht bij 4-8°C te bewaren en de volgende dag weer in de vriezer te leggen. Deze methode van snel ontdooien en hanteren bij 4-8°C minimaliseert de denaturatie van antilichamen. Voor gebruik in de microneutralisatietest moeten menselijke serummonsters gedurende 30 minuten bij 56°C door hitte worden geïnactiveerd. Dierlijke serummonsters, bijvoorbeeld positieve en negatieve controlesera, moeten voor gebruik met RDE worden behandeld (zie subrubriek 3.4.1). RDE-behandeling omvat een warmte-inactiveringsstap.

12. Gezuiverd muis-IgG (Thermo-Fisher Cat. # 31202) is nodig voor de bepaling van de werkverdunning van het 2° antilichaam (conjugaat).

3. Methoden:

3.1. Hemagglutinatie Bij de hemagglutinatietest worden seriële virusverdunningen gemengd met Assay een constante hoeveelheid RBC's. De rode bloedcellen bevatten talrijke receptoren voor hemagglutinine van het virus en agglutinatie treedt op als de virusconcentratie hoog genoeg is. If serum is added, the agglutination of RBCs by the influenza virus will be blocked this is the bases of the HAI assay. Control antiserum and antigens should be included in every HAI assay to verify the specificity of the test.

1. An aliquot (100 ml) of each influenza virus isolated in tissue culture or embryonated chicken eggs (see Note 7) is placed in a well at the first row (row 1) of the 96-well microtiter plate (Fig. 1). Add 50 ml of PBS to rows 2 through 12. Perform a serial twofold dilution series down the 96-well plate transferring 50 ml from row 1 to row 2, etc., disposing of the final 50 ml from the last well. Add 50 ml of the standardized RBCs to all wells. Tap the plate gently to mix or use a mechanical plate shaker. Incubate the plates at room temperature (20-25°C) for the incubation time required for the RBCs used (Table 1).

2. After the incubation period, the HAU are observed for their endpoint of agglutination (Fig. 2). The RBCs will settle to the bottom of the V-well microtiter plate in negative samples, and in positive samples they will agglutinate. The wells in column 8 contain no virus. RBCs that agglutinate will evenly distribute within the well, whereas RBCs that do not agglutinate will form a button in the bottom of the V-well. The HA titer is the last dilution that shows complete hemagglutination activity (see Note 8).

OOOOOOOO' 00000000' 00000000' 00000000' oooooooo 00000000 00000000 00000000 00000000 + oooooooo.

Fig. 1. The 96-well microtiter plate layout for the hemagglutination titration assay.

Recommended time of incubation at 20-25°C for the hemagglutination assay with the use of different species of RBCs


Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop

Immune recognition of protein antigens relies on the combined interaction of multiple antibody loops, which provide a fairly large footprint and constrain the size and shape of protein surfaces that can be targeted. Single protein loops can mediate extremely high-affinity binding, but it is unclear whether such a mechanism is available to antibodies. Here we report the isolation and characterization of an antibody called C05, which neutralizes strains from multiple subtypes of influenza A virus, including H1, H2 and H3. X-ray and electron microscopy structures show that C05 recognizes conserved elements of the receptor-binding site on the haemagglutinin surface glycoprotein. Recognition of the haemagglutinin receptor-binding site is dominated by a single heavy-chain complementarity-determining region 3 loop, with minor contacts from heavy-chain complementarity-determining region 1, and is sufficient to achieve nanomolar binding with a minimal footprint. Thus, binding predominantly with a single loop can allow antibodies to target small, conserved functional sites on otherwise hypervariable antigens.

Figuren

Figure 1. C05 neutralizes multiple influenza virus…

Figure 1. C05 neutralizes multiple influenza virus subtypes from groups 1 and 2


Functional virus assays: research and high throughput methods

There are different types of functional assays to study how a virus works, such as how it infects cells and which mechanisms and enzymes are important for the virus. Functional methods are employed for both: basic research as well as for HTS drug screening.

  • Methods in basic research: in basic research, functional virus assays help to find immunogenic components for vaccines and potential drug targets for therapy. Microplate-based tests employed for virus characterization, mainly use plates up to 96 wells. As soon as a virus is understood and potential drug targets are identified, higher throughput virus assays search for molecules interfering with pathogenic processes.
  • High throughput assays: the development of antivirals requires to screen compound libraries for various aspects and relies on high throughput compatible virus assays. These are performed in plate formats of 384 wells or 1536 wells. In addition to the plate density, high throughput virus assays are automatically prepared with the use of automated liquid handlers and industrial robots.

The FDA suggests the use of in vitro virus assays for measuring CPE, mechanism of action and testing of resistance to novel antivirals before proceeding with clinical studies 15 . The basic assay principles of high throughput and research tests are similar and virus specific. Some examples are described below.

Neuraminidase assay

Neuraminidase is one of two key glycoproteins found on the surface of influenza viruses (the other being hemagglutinin, fig. 10). Neuraminidase is crucial to the release of influenza from infected cells and enables spread within the respiratory tract. Viral neuraminidase cleaves sialic acid groups from glycoproteins on the host cell surface, leading to release of virus particles from infected cells. It is therefore the target of new therapies such as the FDA-approved neuraminidase inhibitors zanamivir and oseltamivir 16, 17 . Its activity further reports on viral titer and potential neuraminidase inhibitor resistance.

Figure 10: Structure of the influenza virus.

Neuraminidase activity and inhibition is mainly measured using a synthetic substrate which releases a fluorophore, if processed by the enzyme. In this assay, the virus is mixed with the substrate and fluorescence intensity is measured on a microplate reader. The intensity is directly related to neuraminidase activity. A fluorescence-based neuraminidase assay was measured by Hong Kong-based researchers on the CLARIOstar microplate reader and revealed a neuraminidase inhibitory activity by traditional multi-herb formulations 18 .

A second type of neuraminidase assay employs chemiluminescence instead of fluorescence and provides higher sensitivity 19 . This virus assay uses a sialic acid derivative which emits light in the presence of active neuraminidase.

RNA dependent RNA Polymerase assays

Another target for RNA viruses such as such as SARS, hepatitis C and influenza is viral RNA-dependent RNA Polymerase (RdRP) (fig. 10). Viruses localized in the cytoplasm of a cell do not have access to the host’s RNA polymerase and encode their own polymerase to allow replication. The RdRP enzyme transcribes RNA from a viral RNA template, in contrast to DNA-dependent RNA polymerase that transcribes RNA from the host DNA template. RdRP enzyme activity and inhibition are important virus assays and rely on multiple RNA-dependent RNA polymerase assays.

RNA transcribed by RdRP is measured by fluorescent RNA dyes that increase their fluorescence in the presence of RNA. Recombinant RdRP or RdRP isolated from infected cells catalyses in vitro RNA synthesis. The increase in RNA is then measured using RNA dyes such as SYTO-9 20 , Quantifluor 21 or a protein-based sensor 22 .

Measuring nucleotide incorporation is a traditional virus assay to determine the activity of RdRP by in vitro RNA transcription. The RdRP enzyme is mixed with a biotin-labelled primer to initialize the reaction and labelled nucleoside triphosphates (NTPs). If the enzyme is active, it elongates the primer strand and incorporates the labelled NTPs. The complex of primer and newly synthesized RNA is subsequently immobilized on a streptavidin coated microplate and excessive NTPs can be washed away. Dependent on the activity of RdRP, the amount of NTPs immobilized onto the microplate differs. In the past, the NTPs were radioactively labelled. Today fluorophores are used and quantified in a fluorescence microplate reader 23 .

A fluorescence polarization-based (FP) assay also uses the in vitro complementation of a template RNA strand by RdRP to determine its activity. A single stranded “template” RNA is fluorescently labelled and displays a low FP value. If RdRP synthesizes the complementary strand, the molecule enlarges its mass (double-stranded) leading to an increase in FP 24 .

Fig. 11: Principle of a fluorescence polarization-based assay to measure activity of an RNA-dependent RNA Polymerase. A fluorescently labelled template RNA (green) serves for RNA synthesis by RdRp. Full length RNA synthesis leads to a high polarization and the biggest difference in FP (black line) compared to single strand template RNA, whereas incomplete RNA synthesis (yellow and purple lines) have a lower increase in FP change.

Viral neutralization assays

The effectiveness of an antibody, vaccine treatment or infection-related immunity is tested with a neutralization assay. The purpose of this virus assay is to evaluate the ability of an antibody to bind viral surface antigens that are required for a successful viral replication thus neutralizing the infection 36 . The neutralization assay combines incubation of the virus or pseudotypes with samples containing potentially neutralizing antibodies, e.g. sera of vaccinated humans/animals or therapeutics. This is followed by a cell-based infection assay, which provides information as to whether the virus can infect the cells despite treatment.

Neutralization assays were traditionally performed with a virus solution mixed with the neutralizing samples at different concentrations. Due to the infection risk of using the native pathogen, today, pseudotypes are used. Pseudo viruses are chimeric viruses bearing the viral glycoproteins of interest without the disease-causing phenotype. For a neutralization assay, they are engineered to express reporter genes for luciferase or GFP that are activated in the infected cell when undergoing replication. This way, the neutralization assay is easily detected in a fluorescence or luminescence microplate reader (fig. 12).

Fig. 12: a neutralization assay overview. In a luminescence-based neutralization assay, virus pseudotypes are pre-incubated with neutralizing samples such as sera of immunized organisms or antibodies. Subsequently, cells are added and incubated with the virus samples to allow infection. Upon addition of the luciferase substrate, luminescence is measured on a microplate reader. Neutralized viruses are not capable of infecting cells and display low luminescence while infectious pathogens show high luminescence.

Visit our blog post “Vaccine Development: past, present and future” for more information on neutralization tests and other vaccine development assays.

Virus infectivity assays to study antiviral activity

Methods used to test the antiviral effect of compounds overlap with assays used to diagnose infections. Voor in vitro and high throughput assays, cell-based microplate assays are employed.

Studying the cytopathic effect of a virus in presence and absence of a compound identifies if it prevents infection. Infectivity assays to detect cytopathic effects in screening are mainly based on measuring viability with an ATP-dependent luciferase such as CellTiter-Glo ® or ToxiLight TM . These assays are compatible with a 1536 well format and reagents can be added directly to cells after the appropriate incubation of cells, virus and compound. The microplate is subsequently measured on a high throughput luminescence plate reader where low signals correlate to a high cytopathic effect. In addition to a toxic effect related to infection, this assay reports on toxicity induced by the compounds themselves in control wells with compound and cells lacking the virus.

In this short talk, Ahlam Ali from Queen’s University Belfast, UK shows a screen for SARS-CoV-2 antivirals, measuring the cytopathic effect on a CLARIOstar Plus in 384-well plates.

Another infectivity assay suited to screening uses recombinant viruses that are engineered to express fluorophores or a luciferase after infection. Cells and virus are incubated together with the compounds. If infection is inhibited by one of the compounds, the fluorescent or luminescent signal is low, whereas infection is reported by high signals, as demonstrated in the application note Studying the molecular mechanism of viral replication in real time using the CLARIOstar Plus with ACU.

Binding assays for compound screens

In the context of virus research and antiviral development, binding assays screen for molecules that interact with target structures essential for the virus lifecycle. Popular target structures are: receptors on host cells used by viruses to attach and enter the cell, proteases cleaving viral precursor proteins or cell proteins, polymerases, integrases and methyltransferases required for genome replication.

Binding assays rely either on proximity assays such as resonance energy transfer, AlphaScreen assays, or the use of fluorescence polarization to track binding-induced changes in molecular weight.

A) Proximity based virus assays

Proximity assays employ donor molecules that transfer a signal to an acceptor molecule if found nearby. Two binding partners of an interaction are labelled, one with the donor molecule, the other with the acceptor molecule. The acceptor only emits a signal if binding occurs and donor and acceptor are close. Screening for binding molecules uses a competitive setup: a target molecule bearing the donor and a known target binder bearing the acceptor lead to acceptor signal emission. If a compound of a screening library displaces the acceptor-labelled molecule, acceptor signal decreases due to separation. Therefore, the signal decreases if a compound binds the viral target.

Upon excitation, the donor beads in AlphaScreen-based assays release singlet oxygen which can travel up to 200 nm and react to release light if the acceptor bead is in close proximity.

A research group of the National Institutes of Health (NIH) used this method to establish a high-throughput virus assay in 1536 well format to find inhibitors of the interaction between SARS-CoV-2 spike protein and ACE2 receptor. The viral spike protein attaches to the ACE2 receptor for cell entry and an inhibitor of the interaction is a promising therapeutic. The assay measured on a PHERAstar FSX provided an excellent assay quality with Z’ > 0.7 and identified 25 compounds out of 3400 which inhibited spike protein – ACE2 interaction 25 . To learn more about an AlphaLisa-based approach to study the interaction of the cellular ACE2 receptor and a viral spike protein, see our AN 357: Development of an AlphaLISA protein-protein interaction assay to screen for re-purposed drugs as targeted disruptors.

The second type of proximity assays are based on resonance energy transfer taking place between two fluorophores (FRET) or between a luciferase and a fluorophore (BRET). High throughput screens rely on simple mix and read, homogeneous assays with low background signals. The homogeneous mix and read approach applies to any resonance transfer assay.

Low background signals are observed with NanoBRET TM assays that use red shifted acceptor fluorophores, and with Time Resolved FRET (TR-FRET) that uses long lifetime donor fluorophores. TR-FRET emissions can be measured after a delay that allows autofluorescence to fade prior to signal detection. A TR-FRET based assay was used by US researchers to screen inhibitors of the interaction of HIV-1 integrase and its main co-factor. They determined a potent inhibitor which acted on integration of HIV-1 as well as on post-integration steps, therefore being regarded as a promising candidate for HIV therapy 26 .

Fig. 13: the principle of TR-FRET-based virus assays. A donor molecule (e.g. virus protein) coupled to a long-lifetime fluorophore (A) interacts with an acceptor molecule (B). The acceptor molecule (e.g. an inhibitor) is bound to an acceptor fluorophore which receives the energy of the donor and emits light. As energy transfer occurs only in proximity of donor and acceptor, the acceptor emission intensity directly reports on a binding event.

B) Fluorescence polarization-based virus assays

Fluorescence polarization is a cost effective and high throughput compatible method to assay the interaction of virus structures such as nucleic acids and proteins with either virus components required for replication, host proteins, or inhibitors. The fluorescence polarization of fluorophore emission increases with an increase in molecular weight of the fluorescent molecule. Therefore, binding assays based on fluorescence polarization rely on gain and loss of molecular weight of the fluorescent molecule upon binding and dissociation, respectively. Since it is easy and inexpensive to label oligonucleotides with fluorophores, FP is ideal for studying interactions between the viral genome and replication proteins. A virus assay published in “Scientific reports” employed a FAM-labelled RNA template from the Zika virus to compare how tight the polymerase subunit RdRp of NS5 and full length NS5 bind the RNA. The results helped to identify the full length NS5 protein including RdRp as well as a methyltransferase as a potential target for Zika virus therapy 27 .


Toxin Neutralization Assay

Toxin Neutralization Assay A. Cell death by toxin
B. Neutralization of toxin and prevention of cell death
Image source Brock Biology of Microorganisms

Neutralization of a microbial toxin by a specific antibody occurs when the toxin and specific antibody combine in such a way that the active portion of the toxin is blocked. Neutralization reactions can block the effects of many bacterial exotoxins.

  1. Schick test: It is a diphtheria toxin-antitoxin neutralization test done to assess the immune status of a person. It was used in the past to know the susceptibility of individuals to Corynebacterium diphtheriae. The test is performed by intradermal injection of 0.1 mL of a purified standardized toxin. If the patient has no antitoxin, the toxin will cause inflammation at the site 4 to 7 days later. If no inflammation occurs, anti-toxin is present and the patient is immune.
  2. Nagler’s reaction: Opalescence on egg yolk agar produced by α-toxin of Clostridium perfringens is inhibited when anti-α-toxin is added to the medium, which neutralizes the α-toxin.

Applications

Antitoxin therapy is used in the medicine to neutralize the toxins of Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani en Clostridium botulinum to prevent the development of diphtheria, tetanus, and botulism respectively.


Discussie

Addition, removal or substitution of N-glycosylation sites of the glycan shield are one of the common strategies for RNA viruses to evade recognition by antibodies [20,48–50]. In this study, we demonstrated that 2G12, despite being elicited as an anti-HIV antibody, also has the ability to broadly neutralize human H3N2 influenza viruses that have evolved over the past five decades. Through comprehensive and evolutionary trajectory-based site-specific glycoproteomics, mutagenesis, and nsEM imaging, we found that neutralization by 2G12 is achieved through binding to two high mannose glycans present on N-glycosylation sites, N165 and N246, that are proximal to the HA RBS. 2G12 then likely represents a neutralizing antibody against human influenza viruses that only recognizes a glycan epitope on the HA. The emergence of N246 around 1980 endowed H3N2 viruses with an oligomannose cluster at N246 and N165 that can be recognized by 2G12. Escape mutants at these sites are then likely to have a high fitness cost, since abolition of the conserved N165 decreases viral fitness as shown here and in a previous study [42], and abolition of the N246 site could not be rescued in recent viruses.

How similar are the glycosylation profiles of antigens derived from virus with soluble recombinant proteins is one of the important issues for vaccine design [51–54]. For example, some differences in the glycoforms of soluble and viral HIV-1 Env have been found that may affect neutralization and elicitation of bnAbs [52, 53]. From our data on H3N2 influenza viruses, the site-specific high mannose glycans are conserved between recombinant HA from 293F cells and viral HAs derived from MDCK-SIAT1 cells (Madin-Darby canine kidney cells overexpressing the α-2,6-linked sialic acid receptor). This finding also implies that soluble recombinant HA could be used as an immunogen to attempt to elicit anti-carbohydrate antibodies. Although self-glycans are poorly immunogenic, if in high enough density on viral glycoproteins, they can become a focus of the immune response by antibodies that interact with both glycan and protein [4,35,55,56]. Multivalent binding to the high mannose glycans contributes to a potent IC50 of 2G12 against HIV-1. Notably, 2G12 exhibited neutralization (IC50 from 1 to 10 μg/ml) of sensitive HIV-1 viral strains through involvement of four major N-glycosylation sites that constitute the high mannose patch [26,57]. In our study, 2G12 neutralized sensitive H3N2 influenza strains only at sub-micromolar IC50 through targeting a mannose cluster that is formed by only two N-glycosylation sites, and is less potent compared to bnAb CR9114 by five to ten-fold. The 1 to 2-log difference seems to result from fewer high mannose N-glycosylation sites within the HA trimer compared to HIV-1 Env. Incomplete neutralization by 2G12 may be a consequence of other nearby N-glycosylation sites (N133, N285) that may contain ligands for 2G12, which distract from its neutralizing ability, e.g. 2G12 binding to wild type Bris07 HA has other minor poses that may include these glycans (Fig 5B). Heterogeneity in the glycan composition can also result in incomplete neutralization, especially for 2G12 if any complex glycans were present in addition to any heterogeneity in high mannose glycans. In a previous study, at low concentration (0.5 mM) of Man7, Man8, and Man9, 2G12 binding to gp120 was almost the same for Man9 and Man8 and less for Man7 (by

20%) [58]. Incomplete neutralization is also found in several antibodies against HIV-1 possibly as a result of glycan heterogeneity [59–61].

Since 2G12-like antibodies are not typically found to be induced by influenza virus HA, it seems to indicate that the mannose cluster on the HA has not yet been a focus of immune selection pressure. Many enveloped virus pathogens, such as Ebola virus, Hepatitis C virus, Lassa fever virus and coronaviruses, including Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS CoV-2), are highly glycosylated and present oligomannose on their surface antigens (Fig 6). [44,54,62,63].

(EEN) From left to right, HK68 HA, Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) spike, SARS-CoV-2 spike, MERS-CoV spike, Vic11 HA, LASV GPC, HIV-1 Env (PDB ID: 4FNK, 5X58, 6VSB, 5X59, 4O5N, 5VK2, 5ACO, respectively) [15,38,93–96]. Glycans are colored according to site-specific oligomannose-type glycan content [44,45], as per the key. (B) Glycans are colored according to Man8/9GlcNAc2 content (2G12 epitopes), as per the key.

Indeed, besides H3N2 HAs and HIV-1 Env, 2G12 has been purported to bind SARS-CoV-2 S by recognizing high mannose glycans on the S2 subunit [64]. Mannose clusters on surface antigens can also be recognized or captured by various lectins, such as human mannose binding lectin (MBL) or DC-SIGN [65–67]. Similar to our finding of high mannose glycans near the RBS on H3 HA, some high mannose glycans are also found near the RBS of the glycoprotein of Lassa virus [44,54]. Based on our findings, it is possible that other clusters of high mannose glycans present near the critical functional sites of highly glycosylated viruses could be a target for 2G12. Furthermore, 2G12-like, Fab-dimerized glycan-reactive antibodies were recently isolated from an HIV-1 naïve population with a precursor frequency of 1 in 340,000. Such glycan-reactive antibodies were also found in rhesus macaques infected with simian-human immunodeficiency virus (SHIV), and Fab-dimerized glycan-reactive antibody precursors could be boosted through vaccination [68]. Thus, 2G12-like anti-carbohydrate antibodies without a domain swap can indeed be elicited through vaccination. Here, we reveal that 2G12 could neutralize human H3N2 viruses due to the emergence of an N246 glycosylation site around 30–35 years ago during H3N2 evolution from the 1968 pandemic. As 2G12 also binds to high mannose epitopes on HIV-1 Env, this raises the question whether such carbohydrates could act as a universal epitope on enveloped RNA viruses. The ontogeny of 2G12 has not been documented and most antibodies against viruses that have carbohydrate in their epitopes to date have been found in patients with chronic HIV-1 infection. While 2G12-like Fab-dimerized glycan antibodies and precursors have been discovered in HIV-1-naïve human subjects [68], further vaccination studies would shed light on eliciting 2G12-like anti-carbohydrate antibodies against highly glycosylated viruses.


Invoering

Influenza virus continues to cause seasonal epidemics and pandemics despite vaccine availability. Between 2010 and 2018, seasonal influenza virus infection resulted in an estimated 140,000–810,000 hospitalizations and 12,000–61,000 deaths in the United States alone(1). In the most recent influenza pandemic in 2009, the virus claimed >10,000 lives(2). In addition, highly pathogenic avian influenza viruses cause sporadic outbreaks in humans with a high mortality rate, posing potential risk of human adaptation and are considered pandemic threats(3). Of the four types of influenza viruses (A–D), only influenza A and B viruses cause high morbidity and mortality in humans. Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are the only targets for neutralizing antibodies on the virus envelope. HA is required for viral entry into the host cell through binding to sialic acid moieties on glycoproteins or glycolipids and mediates fusion of the viral membrane with host endosomal membranes. NA cleaves sialic acid and promotes the release of progeny viruses from infected cells. Neutralizing antibodies are primarily directed against HA and can either compete for receptor-binding, inhibit the membrane fusion machinery, or cause virus aggregation. Antibodies to NA can sometimes have neutralizing activity, but are thought to primarily limit virus egress by inhibiting enzyme activity and release of virus thereby inhibiting viral spread. Based on the genetic and antigenic properties of HA and NA, influenza A viruses are divided into group 1 and 2, each of which have several subtypes defined primarily by HA. To date, there are 18 HA and 11 NA subtypes identified and characterized(4). Currently, strains of H1N1 and H3N2 influenza A viruses co-circulate in humans. In addition, several other subtypes of animal influenza viruses (e.g., H5N1, H6N1, H7N9, H9N2, and H10N8) can also infect humans and occasionally result in mortality. In contrast to influenza A viruses, which have an avian reservoir and can achieve sustained transmission in several mammalian species (e.g., swine, dogs, horses, and bats), influenza B viruses are isolated almost exclusively from humans with a more limited evolutionary history and have diverged into only two genetically and antigenically-distinct lineages (Victoria- and Yamagata lineages), which presently co-circulate in humans(5).

Due to the wide diversity and continuous evolution of influenza viruses, repeated vaccinations remain the most effective approach to mitigate influenza burden in humans. Current influenza vaccines confer protection primarily to the strains closely related to those used in its preparation, thus reformulation is needed each season to match the antigenic properties of circulating strains. As a result, the effectiveness of seasonal influenza vaccines varies widely (<10–60%) depending on the adequacy of this match(6, 7). Moreover, current seasonal influenza vaccines confer no protection against animal viruses that can cause human diseases, such as H5N1 or H7N9 highly pathogenic avian influenza viruses in animal models. There are also limitations in current manufacturing approaches and general public apathy for immunization. Therefore, new vaccine options for influenza are urgently needed and have become a high priority for public health officials(8). The current approach for qualifying vaccines each year and licensing vaccines for public use is largely based on the ability of new or reformulated vaccines to induce neutralizing antibodies targeting the receptor-binding site (RBS) in the HA head, which have hemagglutination inhibition (HAI) activity. The HAI assay depends on the availability of HA to bind receptors on red blood cells and was developed as a surrogate for measuring neutralizing activity in the 1940s. The HAI assay is also complicated because some influenza strains do not have enough hemagglutination activity to be useful in this assay.

The discovery of broadly neutralizing antibodies (bnAbs) capable of neutralizing multiple influenza virus subtypes in humans opens an opportunity for developing a universal influenza vaccine which elicits such antibodies(9–11). Many of these antibodies target conserved epitopes in the HA stem and neutralize virus by inhibiting the viral fusion machinery and hence, the activity is not detectable by HAI assay. Several less broad bnAbs bind to the RBS in the HA head and prevent the virus from engaging sialic acid moieties on the host cell surface, thus exhibiting HAI activity(12). Currently, most universal influenza vaccine candidates aim to induce protective levels of such bnAb response(11, 13). Therefore, comprehensive analysis of the neutralization breadth and potency regardless of HAI activity is critical to accelerate the efforts to develop effective universal influenza vaccines.

The influenza microneutralization (MN) assay is the most commonly used assay to measure virus neutralizing activity of antibodies to influenza virus(14). The assay measures virus replication by detecting viral nucleoprotein (NP) levels with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), titrating hemagglutination titers, or through monitoring virus-induced cytopathic effects. Plaque-reduction neutralization assay is also commonly used for influenza and other viruses. These approaches are labor-intensive, not easily scalable and the handling of live viruses of animal origin requires high-containment laboratories. There is also significant performance variability between laboratories due to multi-step signal amplification or reliance on experienced operators. Given these inevitable limitations of the current MN assay, there is a need to transform the MN assay to be safe, high-throughput, robust, easy to standardize, and automation compatible(15).

The use of reporter viruses for developing high throughput and reproducible neutralization assays has greatly advanced our ability to measure and characterize antibody responses induced by infection and/or vaccination(16–18). While pseudotyped reporter lentiviruses have been constructed for influenza and utilized effectively for rank-ordering neutralizing activity (19), they are often criticized for being too sensitive and may not accurately represent some of the key properties of influenza viruses like entry through the endosome under low pH conditions(20, 21). Therefore, building influenza viruses with a reporter feature is an attractive alternative. Amongst several approaches to produce influenza reporter viruses, a replication-competent reporter virus can be developed by fusing a reporter gene to a viral gene (e.g. PA or NS)(22). This new virus remains as virulent and replication-competent as the parental virus, making it suitable for viral pathogenesis studies, yet still subject to precautions regarding handling in high-containment laboratories. In contrast, single-cycle infectious or replication-restricted reporter (R3) influenza viruses can be prepared by replacing one of the essential viral genes (e.g. PB1, or HA) with a reporter gene(22–25). Thereby the R3 virus is capable of replicating only in cells engineered to express the deleted viral gene in trans, making it safe to rescue and propagate in low-containment laboratories.

In the present study, we developed a comprehensive panel of R3 viruses to enable high-throughput and in-depth influenza virus neutralization profiling. We generated a robust neutralization matrix of 24 monoclonal antibodies and 55 R3 viruses spanning 6 subtypes of influenza virus, and compared the R3 virus-based assay with the gold-standard ELISA-based MN assay(14). The reporter virus assay provides a more robust method for probing the breadth of anti-influenza immunity needed for developing universal influenza vaccines.


7. Strategies to Augment ADCC Activity

Augmenting ADCC activity is a novel research direction in cancer research. Target cell killing activities triggered by ADCC mAbs can be substantially increased by the addition of ADCC-promoting agents, which has attracted substantial attention in cancer research [134,135]. Means of augmentation of these responses in cancer research might shed light on influenza research as well. Different strategies for enhancing ADCC were developed and employed in clinical trials in recent studies.

Considering Fc- FcγRIII interaction is required to elicit ADCC activities, the potency of ADCC can be improved by strengthening this interaction. By selecting Fc variants with optimized Fc-FcγRIII affinity, antibodies can elicit a more robust activating signal to the effector cells [59]. Lazar et al. report that Fc variant S239D/I332E has the capacity to optimize Fc-FcγR interaction and enhance effector function both in vitro en in vivo [136].

Other strategies have been attempted to promote the secretion of cytokines by activating effector cells. Reovirus and toll-like receptor (TLR) agonists can increase NK-mediated ADCC by facilitating cytokines secretion [137]. TLR agonists can significantly enhance ADCC by increasing the percentage of activated NK cells. It has been reported that CpG-containing oligodeoxynucleotides (CpG ODN), TLR9 agonists, have the effect of promoting the cytokines secretion from an activated NK cell [138].


Animal Influenza Virus

This third edition aims to provide new and updated methods on animal influenza viruses as well as more advanced protocols that will guide the reader in designing research. Chapters detail influenza in peridomestic animals, marine mammals, savian influenza, swine influenza, equine influenza, hemagglutination, genome sequencing, and influenza in other mammals. Written in the highly successful Methods in Molecular Biology series format, chapters include introductions to their respective topics, lists of the necessary materials and reagents, step-by-step, readily reproducible laboratory protocols, and tips on troubleshooting and avoiding known pitfalls.

Authoritative and cutting-edge, Animal Influenza Virus: Methods and Protocols, Third Edition aims to ensure successful results in the further study of this vital field.

“The book is targeted to researchers in animal disease, specifically animal influenza viruses. … This book is a useful resource for individuals involved in animal influenza research, specifically those addressing avian, equine, or swine influenza viruses, but has little application for veterinary practitioners and those investigating non-influenza viruses or other disease agents.” (Marcella Ridgway, Doody’s Book Reviews, July 10, 2020)