Informatie

11.11: Het Major Histocompatibility Complex (MHC) - Biologie


11.11: Het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex (MHC)

Het dendritische cel Major Histocompatibility Complex II (MHC II) peptidome is afgeleid van een verscheidenheid aan verwerkingsroutes en omvat peptiden met een breed spectrum van HLA-DM-gevoeligheid

Het repertoire van peptiden dat in vivo wordt weergegeven door MHC II-moleculen is afgeleid van een breed spectrum van eiwitten die door verschillende celtypen worden geproduceerd. Hoewel intracellulaire endosomale verwerking in dendritische cellen en B-cellen is gekarakteriseerd voor een paar antigenen, is het algemene bereik van verwerkingsroutes die verantwoordelijk zijn voor het genereren van het MHC II-peptidoom momenteel onduidelijk. Om de bijdrage van niet-endosomale verwerkingsroutes te bepalen, hebben we meer dan 3000 HLA-DR1-gebonden peptiden geëlueerd en gesequenced die in vivo door dendritische cellen worden gepresenteerd. De verwerkingsenzymen werden geïdentificeerd door te verwijzen naar een database van experimenteel bepaalde splitsingsplaatsen en experimenteel gevalideerd voor vier epitopen afgeleid van complement 3, collageen II, thymosine β4 en gelsoline. We hebben vastgesteld dat zelf-antigenen die worden verwerkt door weefselspecifieke proteasen, waaronder complement, matrixmetalloproteasen, caspasen en granzymen, en gedragen door lymfe, aanzienlijk bijdragen aan het MHC II-zelfpeptidome dat in vivo door conventionele dendritische cellen wordt gepresenteerd. Bovendien vertoonden de gepresenteerde peptiden een breed spectrum van bindingsaffiniteit en HLA-DM-gevoeligheid. De resultaten geven aan dat het HLA-DR1-beperkte zelf-peptidome dat onder fysiologische omstandigheden wordt gepresenteerd, afkomstig is van een verscheidenheid aan verwerkingsroutes. Niet-endosomale verwerkingsenzymen dragen bij aan het aantal epitopen dat wordt gesplitst door cathepsinen, waardoor een breder peptiderepertoire wordt gegenereerd. Samen met HLA-DM-afhankelijke en onafhankelijke laadroutes, zorgt dit ervoor dat dendritische cellen een breed zelfpeptidoom presenteren. Dit werk vestigt de aandacht op de rol van "zelfherkenning" als een dynamische interactie tussen dendritische cellen en de metabolische/katabole activiteiten die in elk parenchymaal orgaan plaatsvinden als onderdeel van weefselgroei, hermodellering en fysiologische apoptose.


PATHOGEEN WEERSTAND EN GENETISCHE VARIATIE BIJ MHC LOCI

Abstract.- Het balanceren van selectie in de vorm van heterozygoot voordeel, frequentieafhankelijke selectie of selectie die varieert in tijd en/of ruimte, is voorgesteld om de hoge variatie bij MHC-genen (major histocompatibility complex) te verklaren. Hier wordt het effect van variatie van de aan- en afwezigheid van pathogenen in de tijd op genetische variatie op multiallele loci onderzocht. In het basismodel wordt resistentie tegen elk pathogeen verleend door een bepaald allel en wordt aangenomen dat dit allel dominant is. Gezien het feit dat s is het selectieve nadeel voor homozygoten (en heterozygoten) zonder het resistentie-allel en het aantal generaties dat een pathogeen aanwezig is, is e, fitnesses voor homozygoten worden (1 —s) (n-1)e en de fitnesses voor heterozygoten worden (1 —s) (n-2)e , waarbij N is het aantal allelen. In deze situatie wordt voldaan aan de voorwaarden voor een stabiel, multiallelisch polymorfisme, ook al is er geen intrinsiek heterozygoot voordeel. De verdeling van allelfrequenties en bijgevolg heterozygotie zijn een functie van de autocorrelatie van de aanwezigheid van het pathogeen in volgende generaties. Wanneer er een positieve autocorrelatie over generaties is, wordt de waargenomen heterozygotie verminderd. Daarnaast zijn de effecten van lagere selectie- en dominantieniveaus en de invloed van genetische drift onderzocht. Deze effecten werden vergeleken met de waargenomen heterozygotie voor twee MHC-genen in verschillende Zuid-Amerikaanse Indiase monsters. Over het algemeen kan resistentie die wordt verleend door specifieke allelen tegen tijdelijk variabele pathogenen bijdragen aan het waargenomen polymorfisme bij MHC-genen en andere vergelijkbare gastheerverdedigingsloci.


Elektronisch aanvullend materiaal is online beschikbaar op https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.c.3653177.

Uitgegeven door de Royal Society. Alle rechten voorbehouden.

Referenties

Penn DJ, Damjanovich K, Potts WK

. 2002 MHC-heterozygotie geeft een selectief voordeel tegen meervoudige staminfecties. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 99, 11 260-11 264. (doi:10.1073/pnas.162006499) Crossref, ISI, Google Scholar

Worley K, Collet J, Spurgin LG, Cornwallis C, Pizzari T, Richardson DS

. 2010 MHC heterozygotie en overleving bij rode junglehoenders. Mol. Ecol . 19, 3064-3075. (doi:10.1111/j.1365-294X.200.04724.x) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2011 Computationele voorspelling van MHC II-antigeenbinding ondersteunt uiteenlopende allelvoordeel en verklaart transspeciespolymorfisme. Evolutie 65, 2380-2390. (doi:10.1111/j.1558-5646.2011.01288.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Wakeland EK, Boehme S, She JX, Lu C-C, McIndoe RA, Cheng I, Ye Y, Potts WK

. 1990 Voorouderlijke polymorfismen van MHC klasse II-genen: divergent allelvoordeel. Immunol. Onderzoek . 9, 115-122. (doi:10.1007/BF02918202) Crossref, PubMed, Google Scholar

Landry C, Garant D, Duchesne P, Bernatchez L

. 2001 'Goede genen als heterozygositeit': het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex en partnerkeuze bij Atlantische zalm (Salmo salar) . Proc. R. Soc. Londen. B 268, 1279-1285. (doi:10.1098/rspb.2001.1659) Link, Google Scholar

Olsson M, Madsen T, Nordby J, Wapstra E, Ujvari B, Wittsell H

. 2003 Groot histocompatibiliteitscomplex en partnerkeuze bij zandhagedissen. Proc. R. Soc. Londen. B 270, S254-S256. (doi:10.1098/rsbl.2003.0079) Link, ISI, Google Scholar

. 2008 Is partnerkeuze bij mensen MHC-afhankelijk? PLoS Genet. 4, e1000184. (doi:10.1371/journal.pgen.1000184) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Setchell JM, Charpentier MJE, Abbott KM, Wickings EJ, Knapp LA

. 2010 Tegenpolen trekken elkaar aan: MHC-geassocieerde partnerkeuze in een polygyne primaat. J. Evol. Biol . 23, 136-148. (doi:10.1111/j.1420-9101.2009.01880.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Strandh M, Westerdahl H, Pontarp M, Canback B, Dubois M-P, Miquel C, Taberlet P, Bonadonna F

. 2012 Major histocompatibiliteitscomplex klasse II-compatibiliteit, maar niet klasse I, voorspelt partnerkeuze bij een vogel met een sterk ontwikkelde reukzin. Proc. R. Soc. B 279, 4457-4463. (doi:10.1098/rspb.2012.1562) Link, Google Scholar

Yamazaki K, Yamaguchi M, Baranoski L, Bard J, Boyse EA, Thomas L

. 1979 Erkenning bij muizen. Bewijs van het gebruik van een Y-doolhof dat differentieel geparfumeerd wordt door congene muizen van verschillende belangrijke histocompatibiliteitstypes. J. Exp. Med . 150, 755-760. (doi:10.1084/jem.150.4.755) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Wedekind C, Seebeck T, Bettens F, Paepke AJ

. 1995 MHC-afhankelijke partnervoorkeuren bij mensen. Proc. R. Soc. Londen. B 260, 245-249. (doi:10.1098/rspb.1995.0087) Link, ISI, Google Scholar

Ruff JS, Nelson AC, Kubinak JL, Potts WK

. 2012 MHC-signalering tijdens sociale communicatie. In Zelf en niet-zelf (red.

. 2008 MHC en voorkeuren voor mannengeur in de oeverwoelmuis. ethologie 114, 827-833. (doi:10.1111/j.1439-0310.2008.01528.x) Crossref, ISI, Google Scholar

Bonadonna F, Sanz-Aguilar A

. 2012 Kinherkenning en inteeltvermijding bij wilde vogels: het eerste bewijs voor individuele verwante geurherkenning. dier. Gedragen . 84, 509-513. (doi:10.1016/j.anbehav.2012.06.014) Crossref, ISI, Google Scholar

Doodskist H, Watters J, Mateo J

. 2011 Op geur gebaseerde herkenning van bekende en verwante soortgenoten: een eerste test uitgevoerd op Humboldt-pinguïns in gevangenschap (Spheniscus humboldti) . PLoS ONE 6, e25002. (doi:10.1371/journal.pone.0025002) Crossref, PubMed, Google Scholar

Krause TE, Krüger O, Kohlmeier P, Caspers BA

. 2012 Olfactorische verwantschapsherkenning bij een zangvogel. Biol. Lett . 8, 327-329. (doi:10.1098/rsbl.2011.1093) Link, ISI, Google Scholar

Leclaire S, van Dongen WF, Voccia S, Merkling T, Ducamp C, Hatch SA, Blanchard P, Danchin É, Wagner RH

. 2014 Preen-secreties coderen informatie over MHC-overeenkomst in bepaalde geslachtsdyaden bij een monogame zeevogel. Wetenschap. vertegenwoordiger 4, 6920. (doi:10.1038/srep06920) Crossref, PubMed, Google Scholar

Bonadonna F, Villafane M, Bajzak C, Jouventin P

. 2004 Erkenning van de olfactorische signatuur van hol in blauwe stormvogels, Halobaena caerulea: een efficiënt discriminatiemechanisme in het donker . dier. Gedragen . 67, 893-898. (doi:10.1016/j.anbehav.2003.08.013) Crossref, Google Scholar

. 2010 Eén huis twee gezinnen: stormvogelkrakers snuffelen aan goedkope broedmogelijkheden. ethologie 116, 176–182. (doi:10.1111/j.1439-0310.2009.01725.x) Crossref, Google Scholar

. 2009 Atypische homing of zelfgeur vermijden? Blauwe stormvogels (Halobaena caerulea) worden aangetrokken door de geur van hun partner, maar vermijden die van hen. Gedraag je. Ecol. Sociobiol . 63, 537-542. (doi:10.1007/s00265-008-0688-z) Crossref, ISI, Google Scholar

Chaurand T, Weimerskirch H

. 1994 Incubatieroutine, regulering van de lichaamsmassa en verwaarlozing van eieren bij de blauwe stormvogel Halobaena caerulea . Ibis 136, 285-290. (doi:10.1111/j.1474-919X.1994.tb01097.x) Crossref, ISI, Google Scholar

Chaurand T, Weimerskirch H

. 1994 De regelmatige afwisseling van korte en lange foerageertochten in de blauwe stormvogel Halobaena caerulea: een voorheen onbeschreven strategie van voedselvoorziening in een pelagische zeevogel . J. Anim. Ecol . 63, 275-282. (doi:10.2307/5546) Crossref, Google Scholar

Celerier A, Bon C, Malapert A, Palmas P, Bonadonna F

. 2011 Chemische verwantschapslabel bij zeevogels. Biol. Lett . 7, 807-810. (doi:10.1098/rsbl.2011.0340) Link, Google Scholar

Fridolfsson A-K, Ellegren H

. 1999 Een eenvoudige en universele methode voor moleculaire geslachtsbepaling van niet-loopvogels. J. Avian Biol . 30, 116-121. (doi:10.2307/3677252) Crossref, ISI, Google Scholar

Prada PA, Curran AM, Furton KG

. 2010 Vergelijking van extractiemethoden voor de verwijdering van vluchtige organische stoffen (VOS) die aanwezig zijn in sorptiemiddelen die worden gebruikt voor het verzamelen van bewijsmateriaal voor menselijke geuren. Anaal. Methoden: 2, 470-478. (doi:10.1039/b9ay00239a) Crossref, Google Scholar

Strandh M, Lannefors M, Bonadonna F, Westerdahl H

. 2011 Karakterisering van MHC klasse I en II genen in een subantarctische zeevogel, de blauwe stormvogel, Halobaena caerulea (Procellariiformes). Immunogenetica 63, 653-666. (doi:10.1007/s00251-011-0534-8) Crossref, PubMed, Google Scholar

Sebastian A, Herdegen M, Migalska M, Radwan J

. 2015 amplisas: een webserver voor multilocus-genotypering met behulp van amplicon-sequencinggegevens van de volgende generatie. Mol. Ecol. bron. 16, 498-510. (doi:10.1111/1755-0998.12453) Crossref, PubMed, Google Scholar

Stamatakis A, Hoover P, Rougemont J

. 2008 Een snel bootstrap-algoritme voor de RAxML-webservers. Syst. Biol . 57, 758-771. (doi:10.1080/10635150802429642) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Sandberg M, Eriksson L, Jonsson J, Sjöström M, Wold S

. 1998 Nieuwe chemische descriptoren die relevant zijn voor het ontwerp van biologisch actieve peptiden. Een multivariate karakterisering van 87 aminozuren. J. Med. Chemo . 41, 2481-2491. (doi:10.1021/jm9700575) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2005 UniFrac: een nieuwe fylogenetische methode voor het vergelijken van microbiële gemeenschappen. toepassing omgeving. microbiologisch . 71, 8228-8235. (doi:10.1128/AEM.71.12.8228-8235.2005) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2006 MHC-peptiden en de sensorische evaluatie van het genotype. Trends Neurowetenschappen . 29, 100-107. (doi:10.1016/j.tins.2005.1.006) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Milinski M, Croy I, Hummel T, Boehm T

. 2013 Belangrijke histocompatibiliteitscomplex-peptideliganden als olfactorische aanwijzingen bij de beoordeling van menselijke lichaamsgeur. Proc. R. Soc. B 280, 20130381. (doi:10.1098/rspb.2013.0381) Link, Google Scholar

Jones BC, DeBruine LM, Perrett DI, Little AC, Feinberg DR, Law Smith MJ

. 2008 Effecten van de menstruatiecyclus op gezichtsvoorkeuren. Boog. Seks. Gedragen . 37, 78-84. (doi:10.1007/s10508-007-9268-y) Crossref, PubMed, Google Scholar

Roberts SC, Gosling LM, Carter V, Petrie M

. 2008 MHC-gecorreleerde geurvoorkeuren bij mensen en het gebruik van orale anticonceptiva. Proc. R. Soc. B 275, 2715-2722. (doi:10.1098/rspb.2008.0825) Link, ISI, Google Scholar

Yano S, Sakamoto KQ, Habara Y

. Aan de oestruscyclus gerelateerde voorkeur van vrouwelijke BALB/c-muizen voor C57BL/6-mannetjes wordt veroorzaakt door oestrogeen. J. Vet. Med. wetenschap . 74, 1311-1314. (doi:10.1292/jvms.12-0067) Crossref, PubMed, Google Scholar

Yano S, Sakamoto KQ, Habara Y

. 2015 Vrouwelijke muizen vermijden mannelijke geur van dezelfde stam via het vomeronasale systeem op een oestrogeenafhankelijke manier. Chem. Zintuigen 40, 641-648. (doi:10.1093/chemse/bjv052) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1998 MHC-disassortatieve paringsvoorkeuren omgekeerd door kruisbevruchting. Proc. R. Soc. Londen. B 265, 1299-1306. (doi:10.1098/rspb.1998.0433) Link, ISI, Google Scholar

Manning CJ, Wakeland EK, Potts WK

. 1992 Gemeenschappelijke nestpatronen bij muizen impliceren MHC-genen bij verwantschapsherkenning. Natuur 360, 581-583. (doi:10.1038/360581a0) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1999 Dagelijkse estradiol- en progesteronspiegels in verhouding tot de leg en het begin van de incubatie bij kanaries. Gen. Comp. Endocrinol . 114, 257-268. (doi:10.1006/gcen.1999.7252) Crossref, PubMed, Google Scholar

Williams T, Kitaysky A, Vezina F

. 2004 Individuele variatie in plasma-estradiol-17β en androgeenspiegels tijdens eivorming bij de spreeuw Sturnus vulgaris: implicaties voor de regulering van dooiersteroïden. Gen. Comp. Endocrinol . 136, 346-352. (doi:10.1016/j.ygcen.2004.01.010) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2012 Sequentiegebaseerd bewijs voor belangrijke histocompatibiliteitscomplex-disassortatieve paring bij een koloniale zeevogel. Proc. R. Soc. B 279, 153-162. (doi:10.1098/rspb.2011.0562) Link, ISI, Google Scholar

2012 MHC-genotype voorspelt partnerkeuze bij de ringnekfazant Phasianus colchicus . J. Evol. Biol . 25, 1531-1542. (doi:10.1111/j.1420-9101.2012.02534.x) Crossref, PubMed, Google Scholar

Løvlie H, Gillingham MA, Worley K, Pizzari T, Richardson DS

. 2013 Cryptische vrouwelijke keuze geeft de voorkeur aan sperma van grote histocompatibiliteitscomplex-ongelijke mannen. Proc. R. Soc. B 280, 20131296. (doi:10.1098/rspb.2013.1296) Link, ISI, Google Scholar

Freeman-Gallant CR, Meguerdichian M, Wheelwright NT, Sollecito SV

. 2003 Sociale paring en vrouwelijke paringsgetrouwheid voorspeld door polymorfisme-overeenkomst van restrictiefragmentlengte bij het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex in een zangvogel. Mol. Ecol . 12, 3077-3083. (doi:10.1046/j.1365-294X.2003.01968.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Kamiya T, O'Dwyer K, Westerdahl H, Senior A, Nakagawa S

. 2014 Een kwantitatief overzicht van op MHC gebaseerde paringsvoorkeur: de rol van diversiteit en ongelijkheid. Mol. Ecol . 23, 5151-5163. (doi:10.1111/mec.12934) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Olsen KH, Grahn M, Lohm J, Langefors A

. 1998 MHC en verwantschapsdiscriminatie bij juveniele Arctic charr, Salvelinus alpinus (L.) . dier. Gedragen . 56, 319-327. (doi:10.1006/anbe.1998.0837) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2010 Feromonen bij vogels: mythe of realiteit? J. Comp. Fysiol. EEN 196, 751-766. (doi:10.1007/s00359-010-0534-4) Crossref, Google Scholar


<p>Dit gedeelte beschrijft post-translationele aanpassingen (PTM's) en/of verwerkingsgebeurtenissen.<p><a href='/help/ptm_processing_section' target='_top'>Meer. </a></p> PTM / Verwerking i

Molecuulverwerking

FunctietoetsPositie(s)Beschrijving Acties Grafische weergaveLengte
<p>Deze subsectie van de sectie 'PTM / Processing' geeft de aanwezigheid van een N-terminaal signaalpeptide aan.<p><a href='/help/signal' target='_top'>Meer. </a></p> Signaalpeptide i 1 – 16 Sequentieanalyse

Automatische bevestiging volgens sequentieanalyse i

Automatische bevestiging volgens sequentieanalyse i

Trefwoorden - PTM i

Automatische bevestiging volgens regels i


Resultaten

Grondgedachte, ontwerp en kenmerken van PLAtEAU

Eerdere benaderingen voor het kwantitatief definiëren van het immunopeptidome dat wordt weergegeven door MHCII-moleculen, waren meestal gericht op individuele geïdentificeerde peptiden (12�). Peptiden die slechts één of meerdere aminozuren in lengte verschillen, worden vaak gevonden als producten van met cathepsine gesplitste eiwitten en worden behandeld als afzonderlijke epitopen, zelfs als ze een gemeenschappelijk bindingsmotief delen. Tot op heden is er slechts één rapport waarin kwantitatieve informatie van sets van geneste peptiden is geanalyseerd met een proteomics-benadering. Omdat in dit rapport slechts 14 sets van geneste peptiden werden geanalyseerd die handmatig waren geannoteerd (17), wilden we het concept uitbreiden naar grote datasets. We hebben dus een algoritme ontwikkeld voor het groeperen van peptiden in consensus-epitopen op basis van geneste peptiden, die de gedeelde sequentie (epitoop) vertegenwoordigen die wordt gepresenteerd door individuele peptiden die op het celoppervlak worden weergegeven. Deze epitopen kunnen vervolgens worden gekwantificeerd met behulp van conventionele labelvrije of isotopische kwantificatiestrategieën.

Onze aanpak is samengevat in figuur 1A. In eerste instantie worden peptiden die uit HLA-DR geëlueerd en geïdentificeerd zijn door LC–MS/MS uitgelijnd met de in silico primaire sequentie van het juiste oudereiwit. We berekenen dan de totale intensiteitswaarde op a per-residubasis door sommatie van de intensiteiten van alle peptiden die deze specifieke plaats bevatten. Dit geeft aanleiding tot een intensiteit “landscape,” waarbij “plateaus” de gedeelde sequentie van de geïdentificeerde peptiden vertegenwoordigt. Dientengevolge zal een eiwit dat meerdere consensus-epitopen bevat, worden geïdentificeerd en onderscheiden door verschillende plateaus. Elk van de gedeelde epitopen wordt gedefinieerd door een minimale lengte van 11 aminozuren, aangezien we redeneerden dat deze beperkingen de selectie van het kernbindende epitoop (9 residuen) plus ten minste één residu aan elke kant van het bindende epitoop zullen begunstigen. Om rekening te houden met de extra invloed van residuen in langere sequenties, berekenen we het gemiddelde aantal residuen als N- en C-terminale overhangen.

Figuur 1. Grondgedachte van het algoritme voor antigeen-epitoopuitlijning van het peptidelandschap (PLAtEAU). (EEN) Het algoritme lijnt elk geïdentificeerd peptide uit met de primaire sequentie van de database-gematchte eiwitinvoer (oudereiwit). Reeksen van geneste peptiden worden gegroepeerd en uitgelijnd, en de totale intensiteit wordt berekend op een niveau per residu. De intensiteit “plateaus” definieert de consensus-epitopen. Het algoritme haalt ook de som op van alle MS1-intensiteitswaarden van elke specifieke LC–MS/MS-run, wat de relatieve procentuele intensiteit van het consensus-epitoop oplevert. (B) Om frame-shifted epitopen te detecteren, worden peptiden uitgelijnd met de primaire eiwitsequentie en geordend op de N-terminale residupositie (N). De afstand tot de N-terminus van het volgende peptide (N + m) wordt geanalyseerd, wat meestal leidt tot “steps” in het plateau. “Sprongen” van vijf of meer residuen naar het volgende peptide (mN + 5) zal een tweede, frame-shifted epitoop definiëren wanneer het volgende peptide niet overlapt met het direct voorafgaande peptide (N) met 11 residuen of meer. Peptiden worden vervolgens gescheiden in twee groepen: die met N-terminale posities ervoor of erna N, en die met N-terminale posities op of na N + m. Deze gescheiden peptidepools worden vervolgens gebruikt om twee nieuwe PLAtEAU-distributies te genereren, zoals in panel (EEN).

In sommige gevallen kunnen geneste peptidesets elkaar overlappen vanwege de aanwezigheid van meerdere bindingsregisters, gescheiden door een klein aantal residuen. Registerverschuiving verwijst naar het potentiële vermogen van peptiden om MHCII-moleculen te binden met behulp van verschillende ankerresiduen [bijv. CLIP1, CLIP2 en CLIP3 voor HLA-DQ, zoals eerder waargenomen (13)]. Dit effect resulteert in misleidende 'consensus epitopen' die geen rekening houden met de overlappende populaties van geneste peptiden. Om dit te verhelpen, werd het PLAtEAU-script aangepast om bepalende kenmerken van deze overlappende sets vast te leggen en om register-verschoven epitopen te deconvolueren die overlappen met vijf of meer residuen. Eerst werden alle peptiden uitgelijnd met de primaire eiwitsequentie en geordend op de N-terminale residupositie (N) (Figuur 1B). Vervolgens wordt de afstand tot de N-terminus van het volgende peptide (N tot m) berekend. Vanwege de aard van het mengsel van exo- en endoproteasen in het endosoom, is deze afstand typisch één tot twee residuen lang en geeft aanleiding tot verschillende stappen tussen “plateaus” (m = N + 1 of N + 2) als een “step” van 5 of meer residuen naar het volgende peptide (mN + 5) wordt gevonden, wordt het beschouwd als een “jump,” en wanneer het volgende peptide niet overlapt met het direct voorafgaande peptide (N) met 11 residuen of meer, wordt dit beschouwd als een tweede epitoop dat bindt in een verschoven register, zoals te zien is in CLIP1, CLIP2 en CLIP3, eerder genoemd. Wanneer een dergelijk patroon wordt geïdentificeerd, worden de peptiden gescheiden in twee groepen: die met N-terminale posities voor of op N, en die met N-terminale posities op of na N + m. Deze gescheiden peptidepools worden vervolgens gebruikt om twee nieuwe PLAtEAU-distributies te genereren, zoals eerder beschreven.

We hebben verder een methode geïmplementeerd voor het berekenen van een labelvrije relatieve kwantificering van deze consensus-epitopen, vergelijkbaar met de eerder beschreven (13, 17). In wezen berekenen we de som van alle MS1-intensiteitswaarden van de peptiden die zijn gebruikt om een ​​gegeven consensusepitoop te definiëren en door dit aantal te delen door de som van alle MS1-intensiteitswaarden in de specifieke LC–MS/MS-meting, verkrijgen we het relatieve percentage intensiteit van het consensus-epitoop. Deze waarde komt overeen met de mate waarin een bepaald consensusepitoop in één monster wordt vertegenwoordigd en direct kan worden vergeleken tussen verschillende omstandigheden (zie volgende paragrafen).

Benchmarking PLAtEAU met de eerder gerapporteerde HLA-DQ Immunopeptidome (13)

We waren geïnteresseerd in het testen van onze criteria voor peptide-identificatie en kwantificering, evenals de prestaties van PLAtEAU op een samengestelde dataset. Voor dit doel kozen we een recente studie van het HLA-DQ-immunopeptidome (13), uitgevoerd in een vergelijkbare experimentele benadering als de onze. De dataset is opgehaald uit de PRIDE/ProteomeXchange-repository (zie Materialen en methoden). Het bestand met alle peptiden werd verwerkt door het PLAtEAU-algoritme, resulterend in de relatieve consensus-epitoopintensiteiten (tabel S1 in aanvullend materiaal). Onze analyse leverde ongeveer 650 epitopen op in de hele dataset, met een gemiddelde overhanglengte van de N- en C-terminale extensies van minder dan 1,25 residuen (figuren S1 en S2 in aanvullend materiaal). Als paradigmatisch voorbeeld van een geneste peptideanalyse kozen we peptiden afgeleid van CLIP, waarvan werd aangetoond dat ze binden aan DQ-moleculen in ten minste drie verschillende bindingsregisters (CLIP1, CLIP2 en CLIP3), die allemaal zijn opgenomen in het aminozuur sequentie die residuen 81� van de invariante keten (Ii) omspant (Figuur 2A) (13). DQ2.2- en DQ2.5-moleculen binden CLIP1 en CLIP2 (28, 29), en CLIP3 werd verondersteld als een extra bindingsregister voor DQ7.5 (13). PLAtEAU is in staat om de reeks geneste peptiden te deconvolueren en de bindende consensus-epitopen te identificeren die zijn beschreven voor DQ2.2 en DQ2.5. Zoals eerder gemeld (13) blijkt CLIP3 hier het preferentiële epitoop te zijn dat is gebonden aan DQ7.5, en het meest waarschijnlijke bindingsregister zou de aminozuursequentie LMQALPMGALP omvatten (Figuur 2B Tabel S2 in aanvullend materiaal). Ten slotte levert kwantificering van de som van alle CLIP-afgeleide peptiden door PLAtEAU een vergelijkbaar resultaat op als eerder beschreven, met gemiddelde relatieve intensiteiten van 59% (onze studie) versus 52% (13) voor DQ2,5, 5,8 versus 5,7% voor respectievelijk DQ2.2 en 13.7 versus 11.8% voor DQ7.5 (tabel S2 in aanvullend materiaal).

Figuur 2. Analyse van de dataset gepubliceerd in Ref. (13) met het algoritme voor het uitlijnen van antigeen epitoop van het peptidelandschap. (EEN) Van klasse II invariante ketenpeptide (CLIP) afgeleide peptiden die binden aan het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex van klasse II-moleculen. Ter vergelijking: HLA-DR-moleculen binden voornamelijk de peptide die residuen 91� overspant, terwijl HLA-DQ-moleculen drie verschillende overlappende peptiden in het gebied 91� binden. Elk van de drie CLIP-afgeleide epitopen beschreven binding aan HLA-DQ-moleculen wordt getoond, met de bijbehorende kleurlegenda getoond in paneel (B). Verschillende HLA-DQ-allotypen binden bij voorkeur de epitoop(en) die in vetgedrukte letters zijn weergegeven. (B) “Plateaus” kan worden geïdentificeerd op basis van spectrale telling en/of relatieve intensiteiten voor CLIP-afgeleide epitopen van CD74 (Uniprot-toegangscode P04233). In dit specifieke geval worden de gemiddelde relatieve intensiteiten van elk aminozuur weergegeven (zie tabel S2 in aanvullend materiaal). Donkerdere kleuren vertegenwoordigen de kernepitopen en de lichte kleuren vertegenwoordigen uitgebreide gebieden die door peptiden worden bedekt. De Uniprot-invoercode van elke cellijn die in de oorspronkelijke onderzoeken werd gebruikt (tussen haakjes) wordt ook vermeld boven elke “plateau” van de verschillende aandoeningen die zijn geanalyseerd in Ref. (13).

Karakterisering van T2-DR3-cellijnen die stabiel DM-allotypes tot expressie brengen

De T2-DR3-cellijn werd getransduceerd met lentivirale deeltjes die coderen voor HLA-DM. Het constructontwerp maakt de detectie van GFP mogelijk als een surrogaatexpressiemarker voor DM, aangezien beide eiwitten tot expressie worden gebracht vanuit hetzelfde transcript. Cellen werden aanvankelijk gesorteerd op basis van de expressie van GFP (Figuur 3A, paneel linksboven), en vervolgens werden enkele celklonen geïsoleerd. We selecteerden twee klonen op basis van GFP-expressieniveaus, één hoog en één laag. HLA-DM-expressieniveaus werden onafhankelijk bepaald door intracellulaire kleuring van HLA-DM. Daaropvolgende flowcytometrie-analyse stelde ons in staat om de CLIP-oppervlakteweergave te kwantificeren, evenals de HLA-DR-expressieniveaus. Kleuring voor CLIP onthult dat 95% van de DM-negatieve cellen een sterk signaal van MHCII𠄼LIP-complexen aan het oppervlak vertonen, en dat bij HLA-DM-expressie dit signaal aanzienlijk wordt verminderd (Figuur 3A, rechterbovenpaneel), terwijl HLA-DR-expressie blijft bijna ongewijzigd (Figuur 3A, paneel rechtsonder). Deze resultaten bevestigen dat de tot expressie gebrachte HLA-DM-moleculen functionele heterodimeren opleveren en dat expressieniveaus van GFP parallel lopen met de expressieniveaus van HLA-DM. Bovendien is de relatieve hoeveelheid CLIP die wordt verplaatst van DR3-moleculen omgekeerd evenredig met het HLA-DM-expressieniveau en is deze significant verschillend tussen de twee geteste klonen (Tabel 1).

figuur 3. Karakterisering van cellijnen die verschillende niveaus van HLA-DM tot expressie brengen. (EEN) Representatieve flowcytometriehistogrammen van de cellijnen die in deze studie worden gebruikt. De T2-, T2-DR3-cellijn die DM mist, en individuele klonen van T2-DR3-cellijnen die zijn getransduceerd met HLA-DM werden gekweekt onder standaard celkweekomstandigheden. Cellen in de mid-logaritmische exponentiële groeifase werden gekleurd voor de in elk geval aangegeven fluorescerende eiwitten. Gearceerde histogrammen tonen ofwel de niet-getransduceerde cellijn (linksboven, donker) of isotype-controles (lichtgrijs). Kleuringen van de T2-cellijn overlappen in wezen met de niet-getransduceerde cellijnen (GFP) en de isotype-controles (antilichaamvlekken en worden daarom niet getoond). (B) SDS-stabiele dimeertest van de cellijnen weergegeven in paneel (EEN) door Western blot (bovenste paneel) en kwantificering van de verhouding stabiel dimeer versus DRB onder omstandigheden van geen, lage of hoge DM-expressie. Post-nucleaire cellysaten worden verdeeld en opnieuw gesuspendeerd in laadbuffer en ofwel gekookt (links) of 5 minuten bij kamertemperatuur bewaard (rechts). Monsters (20 µg) worden geladen en opgelost in een 10% SDS-PAGE-gel. De gel werd vervolgens geblot en onderzocht op detectie van DRB (links, TAL 1B5 Abcam AB20181) of stabiel gevouwen DR-heterodimeren (rechts, L243 in eigen huis geproduceerd), en het signaal werd in beide gevallen gedetecteerd met behulp van een geiten-anti-muis- HRP (Santa Cruz) en een commercieel op luminol gebaseerd reagens. In beide gevallen werd β-actinedetectie gebruikt als laadcontrole met behulp van een muis-anti-bèta-actine-HRP-antilichaam (AC-15 Abcam AB49900). De getoonde Western-blot is een representatief voorbeeld van een van de drie onafhankelijke experimenten. De kwantificering is het resultaat van N = 3 onafhankelijke experimenten elk twee keer gemeten (ANOVA-test: P < 0,0001).

tafel 1. Flowcytometrie van relevante epitopen van de cellijnen die in deze studie zijn gebruikt.

HLA-DM-functie bevordert de selectie van pMHCII-complexen met hoge kinetische stabiliteit, een kenmerk dat gecorreleerd is aan de aanwezigheid van SDS-stabiele dimeren in PAGE-analyse. In het specifieke geval van T2-DR3 is aangetoond dat dergelijke complexen alleen worden gevormd in aanwezigheid van HLA-DM (30). De expressieniveaus van HLA-DM zijn dus recht evenredig met de vorming van SDS-stabiele dimeren in I-Ab MHCII-moleculen (31). We hebben de aanwezigheid van SDS-stabiele dimeren beoordeeld voor de klonen met geen, lage of hoge HLA-DM-expressieniveaus en onderzocht of HLA-DM-expressie de vorming van de SDS-stabiele dimeren beïnvloedt. Eerst werd de hoeveelheid HLA-DR3 in elke cellijn bepaald (gemeten als HLA-DR3-bètaketensignaal) (Figuur 3B links). Ten tweede werden de hoeveelheden HLA-DR die aanwezig zijn in de SDS-stabiele dimere conformatie geanalyseerd (Figuur 3B rechts). Western-blot-kwantificering met behulp van verhoudingen van SDS-stabiele dimeren (gedetecteerd door L243) en van DRA (met 1B5) stelde ons vervolgens in staat te bevestigen dat de omvang van SDS-stabiele dimeren gevormd onder deze omstandigheden afhing van de relatieve expressieniveaus van HLA-DM ( Figuur 3B laag). Samengevat bevestigen onze resultaten dat het CLIP-epitoop is vervangen door peptiden met hoge affiniteit en dat deze weergave afhankelijk is van de expressieniveaus van HLA-DM.

PLAtEAU vermindert de complexiteit van immunopeptidome-datasets

Het MHCII-immunopeptidome geassocieerd met de eerder beschreven cellijnen werd geïsoleerd na volledige cellysis, immunoaffiniteitszuivering en zuurelutie van de peptiden gebonden aan MHCII-moleculen. Na LC-MS-analyse werden onbewerkte bestanden geanalyseerd met behulp van de MaxQuant-software met de parameters beschreven in Sectie 'Materialen en Methoden', waarbij een FDR van 0,01 werd toegepast en de functie 'match tussen runs'. Zoals afgebeeld in figuur 4A, werden alleen peptiden gevonden in zowel biologische replica's als ten minste twee van de drie technische replica's overwogen voor de PLAtEAU-analyse. Een totaal van 20.644 peptiden van 1.771 unieke peptiden of 517 unieke eiwitten werden geïdentificeerd in alle verschillende monsters en omstandigheden, inclusief mogelijke verontreinigingen en identificaties uit de lokvogeldatabase. Het verwijderen van dergelijke verontreinigingen verminderde het aantal met ongeveer 10%. Filteren op de technische en biologische replicatiecriteria verlaagde deze waarden verder, tot ongeveer een derde van de oorspronkelijke peptide-ID's. Het verwerken van de pool van peptiden die het resultaat zijn van deze filters met het PLAtEAU-algoritme levert een dataset op die bestaat uit 275 totale consensusepitopen van 234 totale eiwitbronnen (Figuur 4A Tabel S3 in Aanvullend Materiaal).

Figuur 4. Experimentele samenvatting van de analyse van het DM-afhankelijke immunopeptidome geassocieerd met HLA-DR3. Cellijnen werden gekweekt in twee onafhankelijke experimenten en oorspronkelijk verdeeld in drie pellets die onafhankelijk werden verwerkt voor elke biologische replica. (EEN) Schema van de gestroomlijnde immunopeptidome-analyse met behulp van peptidelandschap antigeen epitoopuitlijningshulpprogramma (PLAtEAU). Peptide-identificatie met MaxQuant omvat een FDR van 0,01 en maakt identificatie van peptiden door de optie "match tussen runs" over de gehele set replicaten mogelijk (tijdvenster van 0,5 min met een uitlijntijdvenster van 20 min). Bekende verontreinigingen (geïdentificeerd door een interne database in MaxQuant) en identificaties uit de lokvogeldatabase werden eerst verwijderd. De resulterende dataset wordt gebruikt ter vergelijking met onze aanpak. Voor PLAtEAU-analyse hebben we twee extra filters toegepast, één voor technische en één voor biologische replica's. Deze dataset werd geanalyseerd met het PLAtEAU-script en vervolgens verwijderden we de epitopen die werden gedetecteerd in de immunoprecipitatiecontrolemonsters. Het aantal identificaties, peptiden en eiwitbronnen wordt aan de rechterkant weergegeven. Het PLAtEAU-script leverde 275 kernepitopen op uit 234 eiwitbronnen. Deze dataset werd gebruikt voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse. (B) Grootteverdeling en gemiddelde lengtewaarden op basis van het aantal identificaties op het peptide (zwart) en het consensus-epitoopniveau (grijs).

The PLAtEAU peptide alignment strategy does not rely on peptide-binding motifs, nor does it restrict the peptide length beyond the minimum of 11 and the maximum of 30 amino acids. Peptide and consensus epitope size distribution is very similar (Figure 4B). Moreover, the average length of the C-terminus extending beyond the consensus epitope is 1.71 residues, while it is 1.64 residues in the N-terminal direction. Apparently, there is no bias for extensions at the peptide level on either terminus. It is worth noting that we could detect a large set of peptides that must be considered as background binders during the immunoaffinity purification, as they are enriched in the control condition using cell lysates of T2 cells not expressing any HLA-DR molecule (Figure 4A Figure S3A in Supplementary Material).

We further evaluated the effect the biological replicate and immunoprecipitation (IP) controls had on the final curated immu-nopeptidome analyzed. Venn diagrams showing the overlap between biological replicates only including IDs found in two out of three technical replicates are shown in Figure S3 in Supplementary Material. Overall, the number of peptide IDs found for each sample increases upon HLA-DM expression, and, similarly, the overlap between biological replicates increases from 60% to more than 80% upon HLA-DM expression (Figures S3A,B in Supplementary Material). After background removal, samples lacking DM expression exhibit a considerable degree of discrepancy (60% overlap) between biological replicates, in contrast to those expressing DM (approx. 80% at the peptide level and 㺐% at the epitope level). These results suggest a generally more unstable and variable immunopeptidome displayed on the surface of cell lines not expressing DM.

Distinct Abundances of Peptides Within the HLA-DR3 Immunopeptidome Determined by LFQ of PLAtEAU-Derived Epitopes

Another key feature of the PLAtEAU algorithm is that it allows for LFQ of the grouped consensus epitopes. Despite the considerable increase in available datasets from MHCII immunopeptidome studies in recent years, only a handful have made use of LFQ strategies to quantify the extent of presentation of relevant epitopes. The PLAtEAU algorithm offers an improvement compared with previously described approaches by aligning quantified nested peptides and identifying the consensus binding epitopes, which can then be quantified themselves across various samples and conditions. The resulting LFQ values for individual peptides obtained from the MaxQuant output files were plotted as a heatmap (Figure 5A left), as reported previously (13). Removal of background binders and grouping of peptides into consensus epitopes with PLAtEAU (Figure 5A left) yields a reduced heatmap consisting of 275 epitopes. The performance of the strategy is illustrated by the CLIP peptides derived from CD74 (invariant chain) (Figure 5B). In this case, several peptides are found in the samples generated from the T2 cells lines used as IP control and are therefore considered as false positives. In addition, grouping of sets of nested peptides into consensus epitopes (e.g., KPVSKMRMATPLLMQA) makes apparent differences in the relative amount of peptides found for each condition.

Figuur 5. Heat map representation of the T2-DR3 immunopeptidome using MaxQuant peak volumes and the relative intensities retrieved with peptide landscape antigenic epitope alignment utility (PLAtEAU). (EEN) Left side shows the hierarchical clustering based on LFQ relative intensities determined by MaxQuant for each peptide. DML stands for low DM expression and DMH for high DM expression. NoDM samples do not express HLA-DM, and T2 indicates samples obtained from T2 cell lines not expressing HLA-DR3. The black box shaded in gray (background binders) on the left hand heatmap indicates peptides identified in the immunoprecipitation control samples, which were subsequently regarded as false positives. Those peptides are therefore removed from further analysis and do not appear in the epitope heatmap. On the right side, non-background peptides obtained after removal of background binders and grouping into epitopes by the PLAtEAU algorithm are also hierarchically clustered. Numbers on the left sides of the heat maps indicate the counts of the peptides or epitopes. (B) Example of performance of the experimental approach for CD74-derived peptides and their grouping into epitopes shown as heat maps before (left) and after (right) processing the dataset as described earlier. The peptide sequences are shown in one-letter amino acid code. Open boxes indicate the identified consensus epitope, and the gray box shows the background binders identified for peptides derived from this protein. The log2 intensity barscale shown in the left corner is indicative of the color code of al heat maps.

We then analyzed the impact of DM expression levels on the immunopeptidome and the potentially beneficial consequences of grouping peptides into consensus epitopes for quantitative purposes. The fold change in intensities between low DM expression (DML) and high DM expression (DMH) samples was plotted vs. the t-toets P-value for each peptide or each epitope (Figure 6A left and right, respectively). It is worth noting that we took into consideration the same FDR and the artificial between-groups variance [see Ref. (27) for details]. The confidence interval for each dataset is shown for each case as a dotted line. At first sight the distribution of data points clearly changes upon peptide grouping into epitopes. Thus, the volcano plot for the peptide dataset (Figure 6A left) shows most of the data points accumulated close to the x-axis while there is a more sparse distribution in case of the epitopes retrieved after using PLAtEAU (Figure 6A right). Three specific protein entries with either peptides or epitopes highly abundant for each condition (Table 2) illustrate that when comparing abundances at the peptide level, most of the data points lie outside of the interval of confidence, while grouping them into consensus epitopes yields more high confidence hits (Table 3 Figure 6A). In summary, only 52 data points lie within the confidence interval in the case of the analysis of peptides, while 186 can be considered as enriched when analyzing the consensus epitopes (see Tables S4 and S5 in Supplementary Material).

Figuur 6. Quantitative differences in the immunopeptidome of T2-DR3 cell lines depending on the DM expressing levels. (EEN) Volcano plots showing the log2-fold change of intensity of each peptide quantified by MaxQuant or each epitope quantified by peptide landscape antigenic epitope alignment utility vs. the −log(P). In both cases, an FDR of 0.01 and an S0 of 0.2 as correction factor for differences in the means were used. The resulting intervals of confidence are highlighted by dashed lines shown in each graph. Peptides and epitopes from three representative protein entries are shown as colored filled circles: yellow: CD74 blue: CD4 red: integral protein membrane 2. (B) NetPanMHCII was used to predict the core epitope (Seqlogo representation) of the peptides and epitopes enriched for each condition and their relative binding affinity (pie charts). The relative affinities are provided as stated directly from the NetPanMHCII analysis as Strong for strong binders, Weak for weak binders, and N.D. for those cases in which a binding core was not determined. (C) Cellular component GO analysis of the peptides and epitopes enriched for each condition.

tafel 2. Ten most intense peptides or epitopes found by MaxQuant and peptide landscape antigenic epitope alignment utility (PLAtEAU).

tafel 3. Enrichment behavior of peptides and epitopes of three abundant protein entries.

Using NetPanMHCII the binding cores and relative affinities for each peptide or epitope enriched for each condition were determined (Figure 6B, included in Tables S4 and S5 in Supplementary Material). Seqlogos were generated for each set of enriched peptides or epitopes and indicate a clear predominance of Asp in P4 in the core epitopes under all conditions. Binding affinity prediction using NetPanMHCII suggest that increasing DM expression results in lower levels of peptides classified as N.D. and an increase of predicted high-affinity binders. Such an observation is consistent with the expected function of DM as a peptide-exchange catalyst. The GO Term analysis for the peptides or epitopes enriched for each condition was done according to GO-Slim terms and modified as described in Section “Materials and Methods.” Our analysis suggests that increasing DM expression levels reduce the number of protein sources associated with membranes (primarily the plasma membrane), while increase the protein sources annotated in organelles including the Golgi apparatus, endoplasmic reticulum, and endosomal compartments (Figure 6C). It is worth noting that such a trend is more evident at the peptide level, where increased DM expression results in a complete removal of the “membrane” GO term. At the epitope level, on the other hand, such a trend in annotated GO terms is less prominent, and in case of the “membrane” term, it is only slightly reduced (10 to 8%).

Given the importance of DM expression in the display of epitopes related to autoimmunity (19), we inspected whether any autoimmune-related epitopes were found in our dataset, and how DM expression influences their display (Table 4). High expression levels of DM increase three previously reported autoimmune-related epitopes from the cytoplasmic actin 1 (actin B epitope: AEREIVRDIKEKL), the GTP-binding nuclear protein Ran (epitope: APPEVVMDPALAAQYEH), and from the Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1 epitope: LNTILPDARDPAFK) (32�). When HLA-DM expression is relatively low, epitopes from the ubiquitous autoimmune antigens Syntenin-1 (epitope: LEDLKVDKVIQAQTA) and Calsyntenin-1 (epitope: DPPLIALDKDAPLRFA) are overrepresented (34, 35). Finally, several epitopes from autoimmunity-related antigens are overrepresented when HLA-DM is entirely absent, such as the epitope GTKVVLDDKDYFLFR from the mitochondrial heat-shock protein HSPE1 and ITSIVKDSSAARN from Syntenin-1 (33, 34).

Tabel 4. Enrichment behavior of peptides and epitopes of autoimmune-related antigens.


Major histocompatibility complex and sexual selection

De major histocompatibility complex in sexual selection concerns how major histocompatibility complex (MHC) molecules allow for immune system surveillance of the population of protein molecules in a host's cells. In 1976, Yamazaki et al. demonstrated a sexual selection mate choice by male mice for females of a different MHC.

Major histocompatibility complex genes, which control the immune response and effective resistance against pathogens, have been able to maintain an extremely high level of allelic diversity throughout time and throughout different populations. Studies suggest that the MHC is involved in mate choice for many vertebrates through olfactory cues. There are several proposed hypotheses that address how MHC-associated mating preferences could be adaptive and how the MHC has maintained its enormous allelic diversity. [1] [2]

The vast source of genetic variation affecting an organism's fitness stems from the co-evolutionary arms race between hosts and parasites. There are two nonmutually exclusive hypotheses for explaining this. One is that there is selection for the maintenance of a highly diverse set of MHC genes if MHC heterozygotes are more resistant to parasites than homozygotes—this is called heterozygote advantage. The second is that there is selection that undergoes a frequency-dependent cycle—and is called the Red Queen hypothesis.


Antigen Processing and Presentation by MHCs

In order to initiate a specific immune response to an infectious agent, the immune system must be able to wade through the sea of molecules that are associated with pathogenic invasion and isolate particular protein products that will sharpen the efforts of host defense. Implicit to this model of counteraction is the processing of an immunogenic peptide epitope (antigen processing) and its presentation on the surface of a team of cells, referred to as APCs (Antigen Presenting Cells) (antigen presentation). The result of these actions is the induction of a T-cell response that recruits and engages the other molecular participants of the immune response. Antigen processing and presentation refer to the processes that occur within a cell that result in fragmentation (proteolysis) of proteins, association of the fragments with MHC (Major Histocompatibility Complex) molecules, and expression of the peptide-MHC molecules at the cell surface where they can be recognized by the TCR (T-Cell Receptor) on a T-Cell (Ref. 1). The TCR can recognize antigen only in the form of a peptide bound to an MHC molecule on a human cell surface. The antigens recognized by T-cells are peptides that arise from the breakdown of macromolecular structures, the unfolding of individual proteins and their cleavage into short fragments through antigen processing. The peptides must be bound by an MHC molecule and presented at the cell surface. At the core of this immune system element is the MHC. Located on human chromosome 6, the MHC is a highly polymorphic set of genes that encode for molecules essential to self/non-self discrimination and antigen processing and presentation. There are two classes of MHC molecules, MHC-I (MHC-Class I) and MHC-II (MHC-Class II). MHC-I and MHC-II molecules are both transmembrane glycoproteins belonging to the immunoglobulin supergene family. MHC-I molecules are composed of a transmembrane alpha chain associated non-covalently with the Beta2M (Beta2-Microglobulin) chain. MHC-I molecules are specialized for the presentation of peptides derived from endogenous proteins (intracellular antigens) to the TCR of CD8+ T-cells (CD8-expressing T-cells). MHC-II molecules are composed of two non-covalently linked transmembrane chains, called Alphaƒn (33 kD) and Betaƒn(29 kD). They are specialized for the presentation of extracellular antigens to the TCR of CD4+ T-cells (CD4-expressing T-cells) (Ref. 2, 3 & 4).

Endogenous/intracellular antigens are produced by viruses replicating within a nucleated host cell, processed by the proteolytic system acting on host intercellular proteins, and presented by MHC molecules. Intracellular proteins are cut into short peptides in the cell's multifunctional protease complex, the proteasome (Ref. 5). The proteasome is a large proteolytic complex that contains many subunits, including two subunits, LMP2 (Large Multifunctional Protease-2) and LMP7 (Large Multifunctional Protease-7), encoded within the MHC locus. Proteins bound for degradation are targeted to the proteasome by covalent linkage with a small protein known as ubiquitin. The two subunits of the proteasome, LMP2 and LMP7, induce the proteolytic complex to generate peptides that bind especially well to MHC-I molecules. The actual cleaving of protein occurs in the channel of the proteasome molecule. Peptides generated in the cytosol are then transported into the RER (Rough Endoplasmic Reticulum) to enable interaction with MHC molecules (Ref. 6). TAP (Transporters Associated with Antigen Processing) is a transmembrane heterodimeric protein that allows for the crucial step of peptide translocation. TAP trasnsports peptides into the ER (Endoplasmic Reticulum) that are ideally suited for binding with MHC-I molecules. The peptides consist of 8–13 amino acids. MHC-I molecules are tethered to the TAP transporter via a novel protein, tapasin. Peptides are then loaded onto the MHC-I molecule and transported to the cell surface for recognition by CD8+ T-cells (Ref. 7 & 8).

Exogenous/extracellular antigens are internalized by APCs such as macrophages, dendritic cells and B-cells. APCs can phagocytose and/or endocytose antigen, endosomally process it, and present it in association with MHC-II molecules (Ref. 8 & 9). Internalized antigen is processed within three increasingly acidic endosomal environments: early endosomes (pH 6.0–6.5), late endosomes (pH 5.0–6.0) and lysosomes (pH 4.5–5.0). Acid-dependent hydrolytic enzymes degrade antigen into peptides consisting of 13–18 amino acids. Class-II Alpha and Beta chains associate within the RER. A protein known as the Ii (Invariant Chain) binds to the peptide-binding cleft of the MHC-II molecule and thereby prevents its binding with endogenous antigens meant to be targeted to MHC-I molecules only. The Ii seems to provide other important functions for the MHC-II molecule, too. It is involved in the folding of Alpha and Beta chains, the exit of the complex from the ER, and its targeting to the endocytic compartments. The MHC-II-Ii complex is transported to early endosomes. Ii also functions to transport the Class-II heterodimer to the late endosomal compartments: MIICs (MHC-Class II Compartments) where MHC-II molecules are loaded with peptide. Once in the MIIC, Ii is degraded by proteases (Cathepsins) until only a small fragment called CLIP (Class II-associated Invariant Chain Peptide) remains associated with the peptide-binding cleft to prevent premature interaction with partially-processed antigen. In the lysosome, HLA-DM, a vesicle membrane protein, mediates the removal of CLIP and the binding of antigen to MHC-II. The MHC-II-Antigen complex then moves to the plasma membrane where the neutral environment stabilizes it. At the cell surface, antigen is presented to CD4+ T-cells (Ref. 8 & 10).


Abstract

Antibody-mediated modulation of major histocompatibility complex (MHC) molecules, or MHC class I-like molecules, could constitute an effective immunotherapeutic approach. We describe how single-domain antibodies (VHH), specific for the human MHC class I-like molecule CD1d, can modulate the function of CD1d-restricted T cells and how one VHH (1D12) specifically induced strong type I natural killer T (NKT) cell activation. The crystal structure of the VHH1D12-CD1d(α-GalCer)-NKT T-cell receptor (TCR) complex revealed that VHH1D12 simultaneously contacted CD1d and the type I NKT TCR, thereby stabilizing this interaction through intrinsic bispecificity. This led to greatly enhanced type I NKT cell-mediated antitumor activity in in vitro, including multiple myeloma and acute myeloid leukemia patient-derived bone marrow samples, and in vivo models. Our findings underscore the versatility of VHH molecules in targeting composite epitopes, in this case consisting of a complexed monomorphic antigen-presenting molecule and an invariant TCR, and represent a generalizable antitumor approach.


Inhoud

The immune synapse is also known as the supramolecular activation cluster of SMAC. [3] This structure is composed of concentric rings each containing segregated clusters of proteins—often referred to as the bull’s-eye model of the immunological synapse:

  • c-SMAC (central-SMAC) composed of the θ isoform of protein kinase C, [4]CD2, CD4, CD8, CD28, Lck, and Fyn. [5]
  • p-SMAC (peripheral-SMAC) within which the lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) and the cytoskeletal protein talin are clustered. [3]
  • d-SMAC (distal-SMAC) enriched in CD43 and CD45 molecules. [6] [7]

New investigations, however, have shown that a "bull’s eye" is not present in all immunological synapses. For example, different patterns appear in the synapse between a T-cell and a dendritic cell. [8] [9]

This complex as a whole is postulated to have several functions including but not limited to:

  • Regulation of lymphocyte activation [10]
  • Transfer of peptide-MHC complexes from APCs to lymphocytes [10]
  • Directing secretion of cytokines or lytic granules [10]

Recent research has proposed a striking parallel between the immunological synapse and the primary cilium based mainly on similar actin rearrangement, orientation of the centrosome towards the structure and involvement of similar transport molecules (such as IFT20, Rab8, Rab11). This structural and functional homology is the topic of ongoing research. [11] [12]

The initial interaction occurs between LFA-1 present in the p-SMAC of a T-cell, and non-specific adhesion molecules (such as ICAM-1 or ICAM-2) on a target cell. When bound to a target cell, the T-cell can extend pseudopodia and scan the surface of target cell to find a specific peptide:MHC complex. [13] [14]

The process of formation begins when the T-cell receptor (TCR) binds to the peptide:MHC complex on the antigen-presenting cell and initiates signaling activation through formation of microclusters/lipid rafts. Specific signaling pathways lead to polarization of the T-cell by orienting its centrosome toward the site of the immunological synapse. The symmetric centripetal actin flow is the basis of formation of the p-SNAP ring. The accumulation and polarization of actin is triggered by TCR/CD3 interactions with integrins and small GTPases (such as Rac1 or Cdc42). These interactions activate large multi-molecular complexes (containing WAVE (Scar), HSP300, ABL2, SRA1, and NAP1 and others) to associate with Arp2/3, which directly promotes actin polymerization. As actin is accumulated and reorganized, it promotes clustering of TCRs and integrins. The process thereby upregulates itself via positive feedback. [1]

Some parts of this process may differ in CD4+ and CD8+ cells. For example, synapse formation is quick in CD8+ T cells, because for CD8+ T cells it is fundamental to eliminate the pathogen quickly. In CD4+ T cells, however, the whole process of the immunological synapse formation can take up to 6 hours. [13] [1]

In CD8+ T cells, the synapse formation leads to killing of the target cell via secretion of cytolytic enzymes. [1] CD8+ T lymphocytes contain lytic granules – specialized secretory lysosomes filled with perforin, granzymes, lysosomal hydrolases (for example cathepsins B and D, β-hexosaminidase) and other cytolytic effector proteins. Once these proteins are delivered to the target cell, they induce its apoptosis. [15] The effectivity of killing of the target cell depends on the strength of the TCR signal. Even after receiving weak or short-lived signals, the MTOC polarizes towards the immunological synapse, but in that case the lytic granules are not trafficked and therefore the killing effect is missing or poor. [16]

NK cells are known to form synapses with cytolytic effect towards the target cell. In the initiation step, NK cell approaches the target cell, either accidentally or intentionally due to the chemotactic signalling. Firstly, the sialyl Lewis X present on the surface of target cell is recognized by CD2 on NK cell. If the KIR receptors of NK cell find their cognate antigen on the surface of target cell, formation of the lytic synapse is inhibited. [17] If such signal is missing, a tight adhesion via LFA1 and MAC1 is promoted and enhanced by additional signals such as CD226-ligand and CD96-CD155 interactions. [18]

Lytic granules are secretory organelles filled with perforin, granzymes and other cytolytic enzymes. After initiation of the cell-cell contact, the lytic granules of NK cells move around the microtubules towards the centrosome, which also relocalizes towards the site of synapse. Then, the contents of lytic granules is released and via vesicles with SNARE proteins transferred to the target cell. [19]

Inhibitory immunological synapse of NK cells

When an NK cell encounters a self cell, it forms a so-called inhibitory immunological synapse to prevent unwanted cytolysis of target cell. In this process, the killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) containing long cytoplasmic tails with immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs (ITIMs) are clustered in the site of synapse, bind their ligand on the surface of target cell and form the supramolecular inhibitory cluster (SMIC). SMIC then acts to prevent rearrangement of actin, block the recruitment of activatory receptors to the site of synapse and finally, promote detachment from the target cell. This process is essential in protecting NK cells from killing self cells. [17]

Immunological synapses were first discovered by Abraham Kupfer at the National Jewish Medical and Research Center in Denver. Their name was coined by Michael Dustin at NYU who studied them in further detail. Daniel M. Davis and Jack Strominger showed structured immune synapses for a different lymphocyte, the Natural Killer cell, and published this around the same time. [20] Abraham Kupfer first presented his findings during one of the Keystone symposia in 1995, when he showed three-dimensional images of immune cells interacting with one another. Key molecules in the synapse are the T cell receptor and its counterpart the major histocompatibility complex (MHC). Also important are LFA-1, ICAM-1, CD28, and CD80/CD86.


Bekijk de video: 11. 11 в (Januari- 2022).