Informatie

Celvrij DNA extraheren


Heeft iemand enig succes gehad bij het extraheren van celvrij DNA uit plasma zonder dure kits te gebruiken? Ik heb al veel van mijn eigen bloed uitgegeven om standaard fenol/chloroform-methoden te gebruiken met een zeer minimale opbrengst. Ik weet dat het mogelijk is dat, aangezien ik niet zwanger ben en geen kanker heb (hoop ik), mijn bloed om te beginnen misschien niet een grote hoeveelheid celvrij DNA bevat, maar ik ben bang om kostbare experimentele monsters te gaan gebruiken totdat ik ervan overtuigd dat ik een techniek heb die zal werken.

Voor sommige achtergronden is celvrij DNA DNA dat in het plasma circuleert (in tegenstelling tot het merendeel van het DNA dat cellulair is). Dit is een opwindende nieuwe manier geworden om foetaal DNA uit het bloed van een moeder te analyseren zonder een gevaarlijke vruchtwaterpunctie te doen. Er is ook sterk bewijs dat tumor-DNA op deze manier ook in enige overvloed kan worden gevonden (de meeste onderzoeken lijken te zijn met prostaatkanker).

Qiagen heeft een kit te koop om dit DNA te extraheren, maar het is vrij duur en ik zou nog steeds denken dat fenol/chloroform me een hoge (of minder zuivere) opbrengst zou geven. Er is een artikel in Cancer Biomarkers 2013 van Mazurek et al waarin wordt beweerd dat methoden worden vergeleken en een redelijke opbrengst met deze methode wordt aangetoond, maar ik heb het niet gereproduceerd. Heeft iemand hier succes gehad en zo ja, welke aanpassingen heb je gebruikt? Is het gewoon tijd om over te gaan tot het gebruik van monsters waarvan de kans groter is dat ze grotere hoeveelheden celvrij DNA bevatten?


Noteren: Ik heb geen persoonlijke ervaring met dit protocol. Ik stuur dit document door, aan mij doorgegeven door een collega

Er zijn veel kits en methoden beschikbaar die niet afhankelijk zijn van Qiagen. Of anders, als je het ze vriendelijk vraagt, geven ze een flinke korting op hun eerste kit die je van ze koopt als een soort proef (omdat ze geen monsters doen).

Om uw primaire vraag te beantwoorden, voegt u echter eerst een wasmiddel en warmte toe om uw monsters te denatureren vóór fenol-chloroform (Triton/Heat/Fenol)?

Bloedmonsters voor CFDNA-analyse worden verzameld in EDTA-buisjes en niet langer dan 2 uur op/of onder RT (18 °C-22 °C) gehouden voordat het plasma wordt gescheiden. Plasma moet worden gescheiden van volbloedmonsters door dubbele centrifugatie (800 g en 1600 g gedurende 10 min, afzonderlijk), om lysis van leukocyten te vermijden. We geven er de voorkeur aan CFDNA onmiddellijk na plasmascheiding te isoleren om het effect van langdurige opslag te minimaliseren. Anders moeten monsters in kleine porties worden verdeeld en vóór extractie worden bewaard bij -70 °C, omdat fragmentatie van CFDNA kan worden veroorzaakt door herhaalde vries-dooicycli

Voor de THP-methode werd 500 l plasma / serum gemengd met 5 μl Triton X-100 (Sigma-Aldrich, VK) en gedurende 5 minuten bij 98 ° C gedenatureerd. Monsters werden 5 minuten op ijs geplaatst, vervolgens geëxtraheerd met een gelijk volume fenol-chloroform-isoamylalcohol (25:24:1, v:v:v) (Sigma-Aldrich, VK) en 10 minuten gecentrifugeerd bij 14.000 g . De waterige fase werd overnacht geprecipiteerd met 1/10 volume 3 M NaOAc en 2,5 volume 100% ethanol bij -20°C. De DNA-pellet werd gewassen met ethanol, aan de lucht gedroogd en opnieuw gesuspendeerd in 50 l ddH20.

In het THP-protocol werd incubatie bij 98 °C gebruikt om PCR-remmers te inactiveren en eiwitten in plasma/serummonsters te denatureren. Voordat hiervoor werd gekozen, zijn verschillende tijden en temperaturen getest. Omdat we aanzienlijke DNA-verontreiniging in SDS hadden opgemerkt, werd Triton X-100 gebruikt in de stap van het oplossen van eiwitten. Directe conventionele PCR werd met succes uitgevoerd op door warmte gedenatureerde monsters en was in staat om 25 ng/ml DNA te detecteren, wat aangeeft dat deze eenvoudige procedure voldoende eiwitvertering en eliminatie van remmers bood voor PCR-analyse. Het THP-protocol gaf een significant hogere opbrengst aan pure DNA-oplossing voor qPCR-analyse dan de QIAamp-kit. Het THP-protocol toonde een hoge efficiëntie, zelfs met kleine DNA-fragmenten van slechts 100 bp.

Misschien wil je dit lezen: Xue, Xiaoyan, et al. "Het optimaliseren van de opbrengst en bruikbaarheid van circulerend celvrij DNA uit plasma en serum." Kliniek Chimica Acta 404,2 (2009): 100-104.

Een snelle zoekopdracht van Google Scholar bracht ook een paar andere artikelen aan het licht waarin u mogelijk geïnteresseerd bent:

Fleischhacker, Michael, et al. "Methoden voor isolatie van celvrij plasma-DNA hebben een sterke invloed op de DNA-opbrengst." Kliniek Chimica Acta 412,23 (2011): 2085-2088.

UPDATE:

Na het lezen van dit (Fong, Siew Lee, et al. "Vergelijking van 7 methoden voor het extraheren van celvrij DNA uit serummonsters van colorectale kankerpatiënten." Klinische chemie 55,3 (2009): 587-589.) die ongeveer 7 protocollen geeft (helaas zonder enige referentie om de een of andere reden) waar ik op ging jagen, kwam met dit:

DNA werd geëxtraheerd uit 1,0 ml plasma met behulp van de fenol-chloroform-methode met lichte modificaties. Eén ml plasma werd behandeld met 1x SDS/Proteinase K-oplossing (0,5 mg/ml) (1:1), overnacht geïncubeerd bij 56 °C gevolgd door behandeling met fenol-chloroform (4:1) en gecentrifugeerd bij 7000 rpm. De bovenste laag werd overgebracht in verse centrifugebuizen van 15 ml en dezelfde stap werd opnieuw herhaald; DNA werd geprecipiteerd door toevoeging van glycogeen (0,1 µg/ul), ammoniumacetaat (7,5 M) en absolute alcohol. DNA-pellet werd verkregen door te centrifugeren bij 7000 rpm; werd gewassen met 70% alcohol bij 10.000 rpm, gedroogd en uiteindelijk opgelost in TE-buffer bij 56 °C en bewaard bij -20°C tot verder gebruik.

U kunt hier lezen over de bovenstaande methode: Singh, Deepika Misra1 Renu en Monisha Banerjee. "Een eenvoudige en betrouwbare methode om foetaal DNA uit de maternale circulatie te verkrijgen; de nauwkeurigheid en gevoeligheid ervan."

En als het voor u beschikbaar is, is het misschien de moeite waard:

Gahan, Peter B., ed. Circulerende nucleïnezuren in vroege diagnose, prognose en behandeling Monitoring: een inleiding. Vol. 5. Springer, 2014.


Celvrij DNA uit plasma extraheren

  • QIAamp circulerende nucleïnezuurkit: de kit die door veel cfDNA-onderzoeken wordt gebruikt.
  • ZR Serum DNA Kit: het protocol maakt gebruik van ZymoBeads maar met een genomische lysisbuffer, misschien geen goed idee als dit eventuele witte bloedcellen in uw monster lyseert?
  • AnalytikJena's Polymer Mediated Enrichment (PME): voor het verwerken van maximaal 5 ml plasma in minder dan 1 uur.
  • Norgen's 8217s plasma/serum celvrije circulerende DNA-kit: spinkolomverwerking van 10 L tot 400 μL plasma of serum.
  • NucleoSpin plasma XS: spinkolomverwerking van maximaal 240 μL plasma of serum.
  • EpiGenTek's FitAmp-kit: spinkolomverwerking van plasma of serum met behulp van hun gepatenteerde DNA-isolatiebuffer in 12 minuten.
  • Chemagen's Circulating NA kit: spinkolomverwerking verwerking van 1 tot 4 ml plasma of serum.

Een artikel uit 2003 [1] stelde het gebruik van magnetische kralen voor celvrije DNA-extractie voor en vergeleek deze met Qiagen-extractie. Beide methoden gaven reproduceerbaar vergelijkbare resultaten (ik kom hier aan het einde van dit bericht op terug).

Een paper uit 2009 van het Singapore General Hospital [2] vergeleek 7 extractiemethoden. Ze rapporteerden zeer verschillende prestatiekenmerken en hun eigen natriumjodidemethode (protocol beschikbaar op aanvraag), een fenol/choloform-methode en Qiagen QIAamp-methoden presteerden het best.

Barret et al 2011 [3] beoordeelden verschillende verzamelbuisjes (K(3)EDTA- en STREK-buisjes) en bewaarcondities op de opbrengst van cfDNA uit maternaal bloed. Ze gebruikten digitale PCR van korte (cfDNA) en lange (maternale gDNA) PCR-assays om aan te tonen dat het aandeel cfDNA in de loop van de tijd afneemt als gevolg van de toename van maternaal DNA als gevolg van cellyse, maar dat dit "grotendeels kan worden voorkomen" door verzameling in STRCK-buizen. Ze toonden ook aan dat bewaring bij 4°C niet nodig is, maar dat onmiddellijk centrifugeren na bloedafname met name is wanneer monsters niet onmiddellijk kunnen worden verwerkt.

Op kralen gebaseerde celvrije DNA-extractie: Het verwijderen van de centrifugatiestap zou protocollen veel gemakkelijker te gebruiken maken, maar vereist waarschijnlijk zeer gedefinieerde protocollen voor verzameling, opslag en verwerking om gDNA-besmetting door witte bloedcellen te minimaliseren.

LGC publiceerde een paper [6] waarin een methode werd beschreven die ze op de markt brachten om gDNA uit gedroogde bloedvlekken te extraheren. Dit begint met een cellysisstap en is dus niet geschikt voor circulerend DNA, maar de binding aan magnetische kralen is zo'n eenvoudig proces om in het laboratorium uit te voeren. Ik vraag me af of we het kunnen gebruiken voor een directe extractie op basis van kralen uit volbloed ( of urine), zonder centrifugeren?

In de 'Boot Camp'-dia's van Broad (een geweldige introductie tot NGS uit circa 2010) presenteren ze de onderstaande afbeelding van een dubbele SPRI voor maatselectie. Mijn idee is om dit principe aan te passen om al het DNA in een bloedbuis direct op het deksel vast te leggen en te sluiten met een reagens dat een hooggeconcentreerde (2,5x) SPRI-cocktail zou maken. Dit zou rijden alle DNA op de kralen, inclusief alle celvrije en hoogmoleculaire DNA van witte bloedcellen. De buis zou dan op een magneet worden geplaatst die al het DNA in de oplossing opvangt en het mogelijk maakt dat al het andere, cellen, plasma, enz. Na een snelle wasbeurt zou het celvrije DNA bij voorkeur worden geëlueerd met een SPRI-mix met een lage concentratie (0,5x), waardoor DNA met een hoog molecuulgewicht aan de korrels gebonden blijft. De herformulering als onderdeel van een bloedafnamebuisje, vergelijkbaar met DNA Genoteks speekselafnamebuisjes, zou dit een zeer eenvoudig monster kunnen maken om te verzamelen en te verwerken. En het verwijderen van eventuele centrifugatiestappen en het vermogen om celvrij DNA uit het hele monster te verzamelen, zou hopelijk de gevoeligheid verhogen door celvrij DNA-herstel te maximaliseren.


Mariene enzymen en gespecialiseerd metabolisme - Deel B

Soo Y. Ro, Amy C. Rosenzweig, in Methoden in Enzymologie, 2018

6.1 DNA-extractie van mevrouw trichosporium OB3b-cellen op agarplaten

DNA-extractie uit mevrouw trichosporium OB3b is minder efficiënt dan DNA-extractie van veel Type I of Type II methanotrofe bacteriën. Bestaande methoden gebruiken de neutrale lysis/CsCl-methode of een DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen) voor DNA-extracties uit vloeibare culturen (Gu et al., 2016 Smith & Murrell, 2011). Het kweken van vloeibare culturen om meerdere kolonies te genotyperen is echter tijdrovend. In plaats daarvan is een verbeterde methode ontwikkeld om DNA te extraheren uit cellen die op agarplaten groeien met behulp van de MasterPure Complete DNA Purification Kit (Epicentre, Cat. No. MC85200). Deze methode zorgt voor een hogere doorvoer van genotype screening en zorgt voor verhoogde opbrengsten van DNA uit kleinere hoeveelheden cellen. Het MasterPure Complete DNA Purification Kit-protocol is aangepast voor: mevrouw trichosporium OB3b:

Voeg voor elk monster 20 L Proteinase K (NEB, 800 U/mL) toe aan 300 μL 2 × weefsel- en cellysisoplossing.

Sleep een steriele entlus over de agarplaatcultuur totdat de lus is bedekt met cellen (Fig. 5).

Afb. 5 . Hoeveelheid van mevrouw trichosporium OB3b-cellen die nodig zijn voor DNA-extractie, getoond op een inentingslus van 1 L.

Wervel de ent-lus in de lysis-oplossing en resuspendeer volledig door pipetteren.

Incubeer het monster bij 65 ° C 's nachts bij 500 rpm.

Voeg 5 L RNase A (Epicentrum, 5 μg/μL) toe. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C zonder te schudden.

Plaats de monsters gedurende 5 minuten op ijs.

Voeg 150 L MPC eiwitprecipitatiereagens en vortex toe.

Centrifugeer het monster bij 10.000 × G bij 4 ° C gedurende 10 minuten om celresten te pelleteren.

Breng het supernatant over naar een nieuwe buis en voeg 500 L 100% isopropanol op ijs toe. Keer het monster handmatig 30 keer om.

Centrifugeer het monster bij 4 ° C gedurende 30 min bij 20.000 × G DNA te pelleteren.

Was de DNA-pellet met 750 μL 70% ethanol op ijs. Centrifugeer bij 20.000 × G bij 4 ° C gedurende 5 minuten, verwijder de ethanol en herhaal de wasstap nog een keer.

Laat de pellet drogen bij 37°C totdat de resterende ethanol is verdwenen.

Resuspendeer de pellet met 50 L TE-buffer en incubeer 's nachts bij 4 ° C.

De DNA-opbrengst kan variëren van 10 tot 60 g. Aanvullende reinigingsstappen met behulp van silica-spinkolommen (Zymo) kunnen nodig zijn voor andere toepassingen dan eenvoudige Sanger-sequencing.


Een nieuwe methode om de extractie-efficiëntie en zuiverheid van urine- en plasmacelvrij DNA te verbeteren

Deze studie beoordeelde drie commercieel verkrijgbare celvrije DNA-extractiekits (cfDNA) en de impact van een op PEG gebaseerde DNA-opruimingsprocedure (DNApure) op de kwaliteit en opbrengst van cfDNA. Zes normale donorurine- en plasmamonsters en monsters van vier zwangere (PG) vrouwen die mannelijke foetussen droegen, werden geëxtraheerd met de JBS cfDNA-extractiekit (kit J), MagMAX celvrije DNA-extractiekit (kit M) en QIAamp Circulating Nucleic Acid Pakket (pakket Q). Herstel van een PCR-product spike-in, endogeen TP53, en Y-chromosoom-DNA werd gebruikt om de prestaties van de kit te beoordelen. Nucleosomale DNA-profielen varieerden tussen de kits, met prominente multi-nucleosomale pieken aanwezig in urine en plasma-DNA dat alleen door kits J en M werd geïsoleerd. Kit J herstelde significant meer spike-in-DNA in vergelijking met kit M of Q (P<0.001) uit urine en vergelijkbare hoeveelheden uit plasma (P= 0,12). Het toepassen van DNApure op kit M- en Q-geïsoleerd DNA verbeterde de amplificatie-efficiëntie van spike-in-DNA uit urine aanzienlijk (P<0.001) en plasma (P≤0.013). Bovendien isoleerde kit J significant meer Y-chromosoom-DNA uit PG-urine in vergelijking met kit Q (P= 0,05). We concluderen dat DNApure een efficiënte manier is om de opbrengst en zuiverheid van cfDNA te verbeteren en de effecten van pre-analytische biospecimenvariabiliteit op de prestaties van vloeibare biopsietests te minimaliseren.

Verklaring van concurrerende belangen

Selena Lin, Matthew Marshall en Barbara Johnson zijn werknemers van JBS Science, Inc. Selena Lin is een aandeelhouder van JBS Science, Inc. Ying-Hsiu Su heeft financiering ontvangen van JBS Science, Inc. Alle andere auteurs hebben geen conflict met verklaren.


Als cfDNA-fragmentomics het potentieel heeft om te worden vertaald in klinische toepassingen, wat is dan de meest waarschijnlijke toepassing die als eerste naar voren komt?

Florent Moulière: Meer dan een specifieke klinische toepassing, zou cfDNA-fragmentomics eerst kunnen worden gecombineerd met andere "omics" om hun potentieel om cfDNA te analyseren te vergroten. cfDNA-fragmenten van een verscheidenheid aan cellen en weefsels hebben de neiging om ∼25bp korter te zijn dan cfDNA dat is afgeleid van hematopoëtische cellen. Dit is aangetoond in van placenta afgeleid cfDNA tijdens zwangerschap, van transplantatie afgeleid cfDNA en van tumor afgeleid cfDNA. Deze kleine verschuiving heeft al nieuwe analytische strategieën mogelijk gemaakt. Door bijvoorbeeld korte fragmenten te selecteren door middel van in vitro en in silico methoden kunnen we een relatieve verrijking waarnemen voor een specifiek celsignaal (bijv. tumorsignaal in het plasma van een patiënt met kanker). Voor vloeibare biopsie verbetert het uitfilteren van biologische ruis die verband houdt met klonale hematopoëse van onbepaald potentieel, verrijkt in specifieke groottebereiken, het oproepen van mutaties wanneer de tumorfractie laag is (en dus het vals-positieve signaal vermindert). Interessant is dat, aangezien deze benaderingen afhankelijk zijn van de intrinsieke eigenschap van cfDNA-fragmentatie, ze kunnen worden geïmplementeerd ongeacht de gebruikte technologie (bijv. Gerichte sequencing of hybride opname).

Dennis Lo: Ik denk dat veel aspecten van de fragmentatie van cfDNA verband houden met het weefsel van oorsprong van de betreffende cfDNA-moleculen. De snelheden en soorten celdood zijn bijvoorbeeld verschillend voor verschillende weefsels. Bovendien zouden de belangrijkste spelers van cfDNA-fragmentatie (bijv. de soorten en concentraties van nucleasen, chromatinestructuur, moleculen die zouden binden aan DNA-transcriptiefactoren) ook van weefsel tot weefsel verschillen. Diagnostisch gezien zou het vermogen om het weefsel van oorsprong te onderscheiden zeer waardevol zijn bij de detectie van kanker (voor lokalisatie van kanker en detectie van metastasen), niet-invasieve prenatale tests (waarbij het 'foetale' DNA voornamelijk uit de placenta komt), post-transplantatie monitoring (voor het opsporen van DNA afkomstig van het getransplanteerde orgaan).

Ellen Heitzer: Het voordeel van het opnemen van de aanwezigheid van kortere van placenta afgeleide DNA-fragmenten om de foetale DNA-fractie vast te stellen in niet-invasieve prenatale tests (NIPT) is al goed gedocumenteerd. Aangezien er groeiend bewijs is van veel cfDNA-toepassingen bij kankerpatiënten dat de nauwkeurigheid en resolutie kunnen worden verhoogd als de analyses worden beperkt tot vrij kortere DNA-fragmenten, heeft het opnemen van dergelijke op fragmentomics gebaseerde informatie ook een groot klinisch potentieel. Vanwege de hoge relevantie van mutatieanalyses bij patiënten met kanker en de verwarrende impact van klonale hematopoëse-gerelateerde varianten, zou fragmentomische analyse een onderscheid kunnen maken tussen dit soort mutaties. Ten slotte is het vooruitzicht van het gebruik van fragmentomics voor vroege detectie van kanker zeer opwindend en veelbelovend, maar dergelijke toepassingen zullen goed ontworpen onderzoeken met grote aantallen probands vereisen om nauwkeurige gevoeligheid en specificiteit vast te stellen en zullen daarom de komende jaren niet worden gerealiseerd als klinische toepassingen .

Dana Tsui: De meest directe klinische toepassing zou zijn om de gevoeligheid en specificiteit van het detecteren van kanker te verhogen en mogelijk de noodzaak van herhaald testen te vermijden. Het vermogen om weefsel van oorsprong te informeren kan worden gebruikt in een vroege kankerscreeningtest om de locatie van een tumor te identificeren nadat kanker is gedetecteerd. Kennis over de sequentiecontext van cfDNA kan ook de ontwikkeling mogelijk maken van een nieuwe detectiestrategie die de diagnostische prestaties van een op cfDNA gebaseerde test kan verbeteren.


Celvrij DNA extraheren - Biologie

myTXTL ® is een veelzijdig, gebruiksvriendelijk celvrij expressieplatform voor eiwitsynthese, enzymengineering en synthetische biologie in industriële en academische toepassingen. Oorspronkelijk ontwikkeld door Prof. Vincent Noireaux aan de Universiteit van Minnesota, werd deze revolutionaire en krachtige TX-TL-technologie verder verfijnd bij Daicel Arbor Biosciences om meer robuustheid te bieden en betrouwbare, consistente prestaties te leveren. Deze goed gekarakteriseerde techniek is wereldwijd gebruikt in laboratoria voor synthetische biologie voor een breed scala aan toepassingen, waaronder de synthese van giftige eiwitten, snelle enzymengineering en de productie van bacteriofagen.

myTXTL Sigma 70 Master Mix is ​​de perfecte keuze voor productie met hoog rendement van oplosbare en membraaneiwitten, snelle prototyping van gennetwerken met behulp van plasmide-DNA, de constructie van synthetische minimale cellen en om chemische synthese te bestuderen. De myTXTL Linear DNA Expression Kit is ontworpen voor efficiënte synthese met behulp van lineaire DNA-templates zonder de noodzaak van klonen en extra stabilisatoren. Voeg eenvoudig een lineair DNA-sjabloon toe aan de geoptimaliseerde mastermix om de eiwitsynthese te starten. De myTXTL T7 Expression Kit is ontworpen voor maximale robuustheid en betrouwbare prestaties bij het gebruik van T7-promotorgestuurde constructies. Continue co-expressie van T7 RNA-polymerase in de E coli-gebaseerde mastermix stimuleert de eiwitproductie voor elke sjabloon met een T7-promotor. Alle opties passen goed bij geautomatiseerde vloeistofverwerkingssystemen, waardoor het een ideaal platform is voor snelle ontwerp-bouw-testcycli bij het screenen van bibliotheken of het analyseren van genetische onderdelen en gencircuits.

myTXTL verenigt een uiterst gebruiksvriendelijke, veilige GGO-vrije hantering met uitzonderlijke eiwitsynthese-efficiëntie en grote veelzijdigheid, waardoor het evenzeer geschikt is voor geavanceerd onderzoek en studentenonderwijs. Bekijk hieronder ons volledige assortiment myTXTL-producten of neem vandaag nog contact op met onze deskundige wetenschappers om te overleggen welk myTXTL-product het beste is voor uw specifieke toepassing.


Celvrij DNA extraheren - Biologie

Alle door MDPI gepubliceerde artikelen worden direct wereldwijd beschikbaar gesteld onder een open access licentie. Er is geen speciale toestemming nodig om het door MDPI gepubliceerde artikel geheel of gedeeltelijk te hergebruiken, inclusief figuren en tabellen. Voor artikelen die zijn gepubliceerd onder een open access Creative Common CC BY-licentie, mag elk deel van het artikel zonder toestemming worden hergebruikt, op voorwaarde dat het originele artikel duidelijk wordt geciteerd.

Feature Papers vertegenwoordigen het meest geavanceerde onderzoek met een aanzienlijk potentieel voor grote impact in het veld. Feature Papers worden ingediend op individuele uitnodiging of aanbeveling door de wetenschappelijke redacteuren en ondergaan peer review voorafgaand aan publicatie.

De Feature Paper kan ofwel een origineel onderzoeksartikel zijn, een substantiële nieuwe onderzoeksstudie waarbij vaak verschillende technieken of benaderingen betrokken zijn, of een uitgebreid overzichtsdocument met beknopte en nauwkeurige updates over de laatste vooruitgang in het veld dat systematisch de meest opwindende vooruitgang in de wetenschappelijke literatuur. Dit type paper geeft een blik op toekomstige onderzoeksrichtingen of mogelijke toepassingen.

Editor's Choice-artikelen zijn gebaseerd op aanbevelingen van de wetenschappelijke redacteuren van MDPI-tijdschriften van over de hele wereld. Redacteuren selecteren een klein aantal artikelen die recentelijk in het tijdschrift zijn gepubliceerd en waarvan zij denken dat ze bijzonder interessant zijn voor auteurs, of belangrijk zijn op dit gebied. Het doel is om een ​​momentopname te geven van enkele van de meest opwindende werken die in de verschillende onderzoeksgebieden van het tijdschrift zijn gepubliceerd.


Extractie van urinecelvrij DNA met behulp van triamine-gemodificeerde silicadeeltjes voor vloeibare biopsie

De aanwezigheid van ongeveer 200 bp celvrij DNA (cfDNA) in de urine heeft de aandacht getrokken als biomarker voor vloeibare biopsie. Het is momenteel echter alleen nuttig voor diagnoses van kankers waarbij een grote hoeveelheid cfDNA in de urine wordt uitgescheiden. Daarom is de ontwikkeling van een efficiënte methode voor het extraheren van cfDNA dat in kleine hoeveelheden in de urine voorkomt, essentieel voor het diagnosticeren van vele andere ziekten. We onderzochten het effect van deeltjesgrootte, kleine poriegrootte (oppervlakte) en oppervlaktemodificatie van poreuze silicadeeltjes op de efficiëntie van DNA-extractie. Onze waarnemingen suggereerden dat cfDNA kan worden opgevangen door tertiaire amine-gemodificeerde deeltjes en vervolgens van de deeltjes kan worden verwijderd door herhaaldelijk te wassen met natriumbicarbonaat (pH 11). Met behulp van deze methode met 30 mg triamine-gemodificeerde deeltjes zijn we erin geslaagd om een ​​paar honderd nanogram cfDNA te extraheren uit 15 ml urine. Verder konden we detecteren

67 fg/mL cariës-DNA (211 bp) in 15 ml urinemonster, wat suggereert dat deze methode geschikt kan zijn voor de extractie van genetische biomarkers voor op cfDNA gebaseerde vloeibare biopsie.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Resultaten

Ruwe celextracten bereid door behandeling met lysozym en vries-ontdooien (LoFT-celextract)

E. coli cellen die met lysozyme zijn behandeld, zijn kwetsbaar en worden gemakkelijk verstoord door osmotische shock of vries-dooicycli. Dus hebben we deze procedures gecombineerd om sterk geconcentreerde celextracten te bereiden, zoals beschreven in Fig 1A. Eén L-cultuur van E. coli cellen in de late log-fase (OD600 = 1,0-2,0) werd behandeld met lysozym op ijs. De cellen werden vervolgens gewassen met 400 mM sucrose en opnieuw gesuspendeerd in DDW. De cellen werden bevroren in vloeibare stikstof en geleidelijk ontdooid in ijswater, en supernatanten van de behandelde cellen werden verzameld door centrifugeren. Omdat de pellets zeer viskeus waren, werden de supernatanten zorgvuldig verzameld. De resulterende celextracten, verkregen door behandeling met lysozym, osmotische shock en vries-ontdooien (LoFT-celextract), bevatten doorgaans 20-30 mg/ml eiwitten.

(A) Een typisch protocol om het LoFT-celextract voor te bereiden. (B) Coomassie-kleuring na SDS-PAGE, die de expressie van GFP en FtsZ (een homoloog van bacteriële tubuline) toont met behulp van het LoFT-celextractieprotocol. pOR2OR1-sfGFP (gfp onder controle van de OR2-OR1-promotor), pET29-sfGFP (gfp onder controle van de T7-promotor), of pET29-ftsZ (ftsZ onder controle van de T7-promoter) werd het plasmide gemengd met LoFT-celextract en reactiemengsels en 14 uur bij 29°C geïncubeerd. Expressie van FtsZ werd bevestigd met behulp van een FluorTect GreenLys in vitro labelsysteem voor vertalingen (Promega, Fitchburg, WI).

LoFT-celextracten vertoonden efficiënte eiwitexpressie in het CFPS-systeem, in combinatie met andere componenten van het reactiemengsel en plasmide-DNA (Fig. 1B). Doorgaans werd ongeveer 10-20 μM (0,25-0,5 mg/ml) actieve sfGFP gesynthetiseerd na een reactie van 14 uur bij 29 ° C. Zowel T7 RNA-polymerase als endogeen E. coli RNA-polymerase in het LoFT-celextract werkte als transcriptiemachinerie voor CFPS (Fig. 1B). Het FtsZ-eiwit, een bacteriële tubuline-analoog, werd ook gesynthetiseerd door CFPS met behulp van LoFT-celextract (Fig 1B, S1 Fig).

Eiwitexpressieniveaus waren bijna verzadigd na een reactie van 3 uur (S2 Fig). Zowel 3-PGA als creatinefosfaatkinase konden worden gebruikt als energiebronnen (S3 Fig) zoals gerapporteerd in andere CFPS-onderzoeken [25-28,30,31].

Optimale omstandigheden voor vries-dooi na behandeling met lysozym

De bevriezingsomstandigheden en het aantal cycli zijn belangrijke factoren om de eiwitopbrengst tijdens vries-dooi verstoring te maximaliseren. Eerst evalueerden we het effect van vriestemperaturen op de eiwitopbrengst. Celsuspensies werden onmiddellijk voor het invriezen in zes buizen verdeeld. Drie buizen werden gedurende 1 uur in een diepvriezer (bij -80°C) ingevroren, terwijl de andere drie buizen gedurende 15 minuten in vloeibare stikstof (bij -196°C) werden ondergedompeld. Alle buizen werden ontdooid in ijswater en supernatanten (celextracten) werden verzameld na centrifugatie. In termen van eiwitconcentratie vonden we dat bevriezing in vloeibare stikstof, vergeleken met bevriezing bij -80°C, resulteerde in een 1,33-voudig hogere eiwitopbrengst (Fig. 2A).

(A) Effecten van de vriestemperatuur op de eiwitconcentratie (eiwitconc.) na vries-ontdooien. Monsters werden gedurende 1 uur in een diepvriezer (-80°C) ingevroren, ondergedompeld in vloeibare stikstof (Liq. N2) gedurende 15 min, of niet bevroren. (B) Eiwitconcentratie (grijze balken) in de LoFT-celextracten en het volume van het supernatant (Sup.) Na centrifugeren (cirkels) in vergelijking met het aantal vries-dooicycli. Verzamelbare supernatantvolumes werden afgeleid van de viscositeit van celresten na invriezen en ontdooien. Omdat de standaarddeviaties van de verzamelbare oplossing (n = 3) kleiner waren (op de getoonde schaal) dan de cirkelgroottes, worden foutbalken niet aangegeven. Alle monsters in (A) en (B) werden ontdooid door incubatie in ijswater en foutbalken geven standaarddeviatie aan (n = 3).

Ten tweede werd het effect van meerdere vries-dooicycli op de eiwitopbrengst geëvalueerd. Specifiek werden één, twee en drie vries-dooicycli getest. Het aantal cycli had geen invloed op de eiwitconcentraties van de LoFT-celextracten. Echter, meerdere vries-dooicycli verminderden het volume van verzamelbare supernatant na centrifugatie (Fig. 2B). Daarom gaven deze resultaten aan dat een enkele vries-ontdooistap optimaal was voor de bereiding van LoFT-celextracten bij gebruik van DDW als de oplossing voor osmotische shock.

Effect van dubbel gedestilleerd water tot natte celverhouding op eiwitopbrengsten

Vervolgens onderzochten we de relatie tussen eiwitopbrengsten en het DDW-volume dat vóór het invriezen werd toegevoegd. LoFT-celextracten werden bereid met 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 en 5,0 ml DDW per 1 g natte cellen, en hun respectievelijke eiwitconcentraties en totale eiwitopbrengsten werden geëvalueerd.

Kleinere volumes DDW leidden tot hogere eiwitconcentraties in de LoFT-celextracten (S4A Fig). De totale eiwitopbrengsten waren niet gelijk onder de verschillende omstandigheden, en de hoogste opbrengst werd verkregen met 1,5 ml DDW (S4B Fig). De eiwitconcentratie bereikte echter niet de concentratie die vereist is voor CFPS (>20 mg/ml). Deze resultaten suggereren dat 1,0 ml DDW per 1 g cellen de aanbevolen verhouding is, omdat dit volume voldoende eiwitconcentraties geeft voor CFPS terwijl de eiwitopbrengst relatief hoog blijft.

Effect van relatieve middelpuntvliedende kracht op het LoFT-celextract

Relatieve middelpuntvliedende kracht (rcf) is een belangrijke factor voor de bereiding van celextracten voor CFPS. Gewoonlijk worden supernatanten verkregen na centrifugatie bij 30.000 × G gedurende 30-60 min (S30) werden onze LoFT-extracten bereid met behulp van centrifugatie bij 25.000 x G gedurende 60 minuten. Veelgebruikte centrifuges voor buisjes van 1,7 ml genereren echter doorgaans niet meer dan 20.000 × G. Tot op heden hebben verschillende groepen gemeld dat centrifugeren bij 12.000 × G is voldoende om celextracten te verzamelen na gebruik van fysieke verstoringsmethoden [26,30]. Daarom hebben we het effect van rcf op de voorbereiding van LoFT-celextract geëvalueerd. Centrifugatieniveaus werden ingesteld op 12.000 × G en 16.000 × G, snelheden die kunnen worden gegenereerd in typische microcentrifuges. De centrifugatietijd werd aangepast om gelijke niveaus van totale centrifugatiekracht te bereiken (rcf × tijd), vergeleken met 25.000 × G gedurende 60 minuten. Onze resultaten toonden aan dat de opbrengsten en concentraties van geëxtraheerd eiwit vergelijkbaar waren voor alle geteste rcf-omstandigheden (figuur 3). CFPS met behulp van de LoFT-celextracten bereid bij lagere centrifugatiesnelheden vertoonden activiteitsniveaus die vergelijkbaar waren met die waargenomen voor extracten verkregen door centrifugatie bij 25.000 × G gedurende 60 minuten.

Eiwitconcentratie (grijze balken) en niveaus van sfGFP-expressie, van CFPS met behulp van LoFT-celextracten en 3 nM pOR2OR1-sfGFP (cirkels), werden uitgezet tegen centrifugatiekrachten (12.000 × G voor 2,5 uur, 16.000 × G gedurende 94 min, en 25.000 × G gedurende 1 uur) na vries-ontdooien. Foutbalken geven standaarddeviaties aan (n = 3). Expressieniveaus van sfGFP werden genormaliseerd naar de gemiddelde waarde van de celextracten die werden verkregen na centrifugatie bij 25.000 × G gedurende 1 uur (verticale as). GFP-exp. betekent "GFP-expressie".

Essentiële kleine moleculen voor CFPS met behulp van het LoFT-celextract

De methoden om LoFT-celextract te bereiden omvatten niet de verwijdering van kleine moleculen. Onze eerdere onderzoeken naar celextracten zonder additieven bereid door sonicatie gaven aan dat nucleosidetrifosfaten (NTP's) en aminozuren kunnen worden weggelaten uit het CFPS-reactiemengsel [25]. Zo werd het belang van elke component in het CFPS-reactiemengsel geëvalueerd in een weglatingstest (Fig. 4). De componenten in ons reactiemengsel waren matrijs-DNA (GFP-gen onder de OR2-OR1-promotor [27]), NTP's, aminozuren, kaliumglutamaat (GluK), magnesiumacetaat (Mg), 3-fosfoglyceraat (3PGA), HEPES-buffer , PEG8000, maltose, CoA, cAMP, NAD+, tRNA, spermidine en formyldonor. Het weglaten van cAMP, NAD+ en CoA beïnvloedde de efficiëntie van CFPS, zoals eerder elders gemeld [35]. Het belang van tRNA, spermidine, formyldonor en maltose voor CFPS varieerde tussen de verschillende LoFT-celextracten, dus we kunnen het belang van deze chemicaliën niet definitief vaststellen. Op basis van de weglatingstest werd vastgesteld dat andere chemicaliën onmisbaar zijn voor efficiënt CFPS (Fig. 4). Deze resultaten suggereren dat LoFT-celextract meer soorten kleine metabolieten vereist voor CFPS dan celextract zonder additieven dat is bereid door sonicatie [25]. Dit kan het gevolg zijn van lekkage van kleine moleculen tijdens de wasstappen na behandeling met lysozym.

Het belang van elke chemische stof voor GFP-expressie werd geëvalueerd door systematische weglating uit de reactiemengsels. AA geeft het mengsel van 20 aminozuren aan. Het gebruikte sjabloon-DNA was 10 nM pOR2OR1-sfGFP. CFPS werd 14 uur bij 29°C uitgevoerd. In de toestand die wordt aangegeven met "alles", werden geen van de chemicaliën weggelaten. Foutbalken geven standaarddeviaties aan (n = 4).

CFPS van lineaire DNA-fragmenten met behulp van het LoFT-celextract

Voor toepassingen in bottom-up synthetische biologie zou CFPS uit lineair DNA geproduceerd door PCR mogelijk moeten zijn [12]. Eerdere rapporten hebben aangetoond dat de toevoeging van GamS, een remmer van RecBCD-nuclease, het gebruik van lineair DNA als sjabloon voor dit proces mogelijk maakt [36]. We hebben bevestigd dat het GamS-lineaire DNA-systeem ook werkt met LoFT-celextract. Meting van de fluorescentie-intensiteit toonde aan dat LoFT-celextract GFP kan produceren, gecodeerd door een lineair DNA-fragment, op een GamS-afhankelijke manier, maar de CFPS-activiteit was verschillende keren lager in vergelijking met CFPS uitgevoerd met circulaire plasmiden (Fig 5A). Bovendien stopte de eiwitexpressie binnen 1 uur (S5 Fig). GamS-suppletie verminderde enigszins, maar niet effectief, de GFP-expressie in CFPS met behulp van circulaire plasmiden (S6 Fig). De lagere CFPS-activiteit met lineair DNA met het GamS-systeem werd ook gerapporteerd in een eerdere studie met S30 bereid door conventionele fysieke verstoring [12]. GFP-fluorescentie na SDS-PAGE zonder koken ondersteunde deze resultaten (Fig. 5B).

sfGFP werd geproduceerd met behulp van LoFT-celextract en 5 nM lineair DNA (PCR-product) gedurende 1 uur bij 29 ° C, in afwezigheid (−) of aanwezigheid (+) van 4 μM GamS. OR en T7 geven PCR-producten aan van respectievelijk het OR2OR1-sfGFP (van het pOR2OR1-sfGFP-plasmide) en T7-sfGFP (van het pET29-sfGFP-plasmide). Bal. betekent "Promotor". (A) Expressieniveaus van GFP geschat op basis van totale fluorescentieniveaus. Foutbalken geven standaarddeviaties aan (n = 3). (B) GFP-fluorescentie gedetecteerd met SDS-PAGE zonder te koken. Alleen banden die overeenkomen met GFP-fluorescentie worden weergegeven.

Kleine moleculen in het LoFT-celextract kunnen worden uitgewisseld met buffer

De procedure om LoFT-celextract te bereiden vereist geen buffers. Het gebruik van een buffer zou echter wellicht de efficiëntie van het GVB kunnen verbeteren. Om dit punt aan te pakken, hebben we getest of bufferuitwisseling, na bereiding van LoFT-celextract, de CFPS-efficiëntie zou kunnen verbeteren. Nadat kleine moleculen in het LoFT-celextract waren uitgewisseld met CFPS-buffer (5 mM Tris-HCl pH 7,6, 60 mM kaliumglutamaat, 14 mM magnesiumacetaat), werd de activiteit getest met GFP als een reporter. The omission assay revealed that the dependence on added chemicals, for CFPS activity, was quite similar to that of extracts without buffer exchange, with the exception of PEG8000 (Fig 6).

The importance of each chemical for GFP expression was evaluated by systematic omission from the reaction mixtures. AA indicates the mixture of 20 amino acids. pOR2OR1-sfGFP (10 nM) was used as the DNA template. CFPS was performed at 29°C for 14 h. “all” indicates no chemicals were omitted. Expression levels of sfGFP were normalized to the average value of “all.” Error bars indicate standard deviation (n = 4). Expression of sfGFP without GluK and Mg is a result of the exchange buffer (S30 buffer) containing these chemicals.

We also tested the effect of LoFT cell extraction using buffers, instead of DDW, on CFPS. DDW at the last suspension step was replaced with S30 buffer (see Materials & Methods). Because several hundred microliters of cell suspension was used, this replacement slightly decreased protein concentrations after centrifugation. In addition, the supernatant obtained after a single freeze-thaw cycle showed reduced CFPS activity (S7 Fig). Interestingly, CFPS activity was recovered in supernatants that underwent two freeze-thaw cycles (S7 Fig). However, we also found that a single freeze-thaw cycle was sufficient when CFPS buffer was used at a volume of 1.5 times the cell mass.


Phenotypes from cell-free DNA

Cell-free DNA (cfDNA) has the potential to enable non-invasive detection of disease states and progression. Beyond its sequence, cfDNA also represents the nucleosomal landscape of cell(s)-of-origin and captures the dynamics of the epigenome. In this review, we highlight the emergence of cfDNA epigenomic methods that assess disease beyond the scope of mutant tumour genotyping. Detection of tumour mutations is the gold standard for sequencing methods in clinical oncology. However, limitations inherent to mutation targeting in cfDNA, and the possibilities of uncovering molecular mechanisms underlying disease, have made epigenomics of cfDNA an exciting alternative. We discuss the epigenomic information revealed by cfDNA, and how epigenomic methods exploit cfDNA to detect and characterize cancer. Future applications of cfDNA epigenomic methods to act complementarily and orthogonally to current clinical practices has the potential to transform cancer management and improve cancer patient outcomes.

1. Inleiding

Blood is a minimally invasive source for tracking an individual's health status. Most known biomolecules found in blood, such as proteins, DNA, RNA, lipids, and metabolites inform us of some aspect of body function. However, using blood to diagnose and track cancer is still a major challenge. Minimally invasive diagnostics for cancer can greatly reduce pain and suffering of patients, and if cheaper than current methods, could be performed more often in the course of treatment to monitor disease state and inform clinical care. Genomic characterization of cancer either from biopsies or plasma cell-free DNA (cfDNA) has the added potential of providing personalized treatment options.

cfDNA is DNA bound to mononucleosomes and is found circulating extracellularly in the blood. cfDNA was first identified in 1948 [1] in the blood of patients however, the hypothesis that cfDNA acts as a reflection of disease state arose from observations in 1977 [2]. This relationship between cfDNA and disease has been a subject of study ever since. There are multiple possible pathways for the release of DNA fragments from cells, including apoptosis, necrosis, and exosome secretion [3–6]. Processes that increase the release of cfDNA include disease, inflammation, tissue injury, and exercise [7,8]. In healthy individuals, haematopoietic maturation is a major contributor to the normal cfDNA pool. Lui et al. elegantly demonstrated that lymphoid/myeloid tissues are the major contributors to cfDNA by identifying Y-chromosome sequences in plasma of female recipients of bone marrow transplantations from male donors [9]. Multiple studies since then further confirmed that the lymphoid/myeloid tissues mainly contribute to the normal cfDNA pool [10–13]. Tumours, when present, also contribute to cfDNA. Thus, cfDNA is a molecular barcode of cells undergoing turnover and is an attractive target for clinical diagnostics and real-time monitoring of many cancers.

Provided that there are ways to distinguish cfDNA originating at the disease site from cfDNA produced during normal turnover, cfDNA could be used for diagnosis. The major focus of using cfDNA for cancer diagnosis has been the identification of a limited disease-specific panel of mutations. However, mutation detection has a significant limitation: that clonal haematopoiesis contributes to a significant fraction of mutations in cfDNA, including mutations in prominent cancer-associated genes like TP53 and DNMT3A [14]. Moreover, these mutations in cfDNA from the early stages of disease can be indistinguishable from mutations that arise at appreciable rates in healthy tissues [15,16]. This major obstacle has led to the exploration of other orthogonal information in cfDNA that could identify its tissue-of-origin and, in turn, disease states. Epigenomes reflect cellular identity and phenotype, and our ability to connect epigenomes to cellular identity could be used to infer disease phenotypes from cfDNA. Significantly, epigenome-based cfDNA approaches would be orthogonal and complementary to mutation-based cfDNA assays. In this review, we discuss epigenome features that can be characterized in cfDNA, and which provide information on the cfDNA tissue-of-origin.

2. Cell-free DNA contains a map of the chromatin state in the tissue-of-origin

The periodicity of cytoplasmic DNA released during red blood cell maturation in mouse fetal liver led to the hypothesis that there was a regular arrangement of protein protections on the genome [17,18]. This work preceded both the field of apoptosis and the biochemical characterization of the nucleosome and provided the first hint that cfDNA could be a map of chromatin structure. Protein-bound DNA lasts longer than naked DNA in serum [19], where nucleases are abundant, which suggests that cfDNA is probably double-stranded and protein-bound to inhibit degradation by endogenous nucleases in plasma. This is supported by the ability to detect nucleosomes in plasma by sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) and by chromatin immunoprecipitation (ChIP) [20–24].

Apoptosis is one of the processes that could lead to genome fragmentation into small protein-DNA complexes that are found in circulation. Apoptosis involves the upregulation of nucleases that attack the cell's genome. Characteristic of this ‘attack' is DNA fragmentation that results in a laddering of repeat species less than 5 kb [5,25]. The repeating unit in laddering seen in apoptosis corresponds to approximately 150 bp, which parallels the length of DNA wrapped around a nucleosome. Therefore, plasma cfDNA, which is typically in the form of a mononucleosome, informs us about the chromatin structure of cells undergoing turnover. In other words, the ‘epigenome' of the tissue-of-origin can be measured from cfDNA (figure 1).

Figure 1. Cell-free DNA reflects the structural epigenomic information of the cell-of-origin. Schematic of the nucleosomal landscape differences of gene X when it is not expressed (left) and expressed (right) in different cell-types. (een) A non-expressed gene features promoter-proximal DNA methylation (red flags), methylation of nucleosomal histone tails (red flags, H3K27me3), nucleosome occlusion of the promoter (arrow), a lack of transcription factors (TFs) upstream of the promoter, and the absence of RNA polymerase II (RNAPII). (B) At expressed genes, nucleosomes are well-positioned, modifications like H3K4me3 (green flags) are present, RNAPII occupies the promoter, and TFs are bound upstream. At the +1 nucleosome during transcriptional elongation, RNAPII transiently breaks DNA-histone contacts allowing H2A-H2B dimers to exchange (light blue crescent). Nucleases, shown as scissors, are ubiquitously present and preferentially cleave accessible DNA. At gene X, when protein protections of DNA change during chromatin remodelling events, such as transcription, nuclease activity captures the different DNA length protections (see fragment lengths). (C) During cell-turnover, DNA-protein complexes are released into circulation. (NS) Circulating DNA-protein complexes in plasma preserve the epigenomic features of the transcriptional status of the cell-of-origin. These features include fragment lengths (protein-DNA protections), DNA methylation, nucleosome positioning profiles, and nucleosome post-translational modifications. Note the preservation of these transcriptional and non-transcriptional DNA-protein species from in the body to plasma.

3. Structural epigenomics

It has long been known that chromatin structure in cells can be inferred from digestion patterns of nucleases that are sensitive to protein-DNA contacts [26]. Micrococcal nuclease (MNase) has been used to study chromatin structure for decades [27]. Understanding chromatin structure by sequencing fragments protected from MNase digestion has an unexpected parallel in cfDNA. The information derived from fragment length and genome location can inform us of biochemical activity at a genomic locus for MNase and cfDNA. For cfDNA, this can be used to infer transcriptional activity and tissue-of-origin. As we will demonstrate below, the length and genomic location of fragments protected from a nuclease can tell us the locus-specific distribution of nucleosomes, transcription factors (TF), and nucleosomal intermediates formed during transcription (figure 1). The ability to identify locus-specific structures of protein-DNA complexes from sequencing data, termed ‘structural epigenomics', is a general strategy applicable to a wide variety of datasets, including cfDNA sequencing datasets [11].

4. Nucleosome positions reflect genome function

Eukaryotic genomic DNA is packaged with nucleosomes like ‘beads on a string' and consecutive nucleosomes are separated by short linker DNA [28,29]. MNase preferentially degrades linker DNA and is inhibited when it encounters a protein-DNA contact [27,30]. A nucleosome protects 147 bp of DNA, a chromatosome (nucleosome with a linker histone bound) protects 167 bp of DNA, and TFs protect less than 50 bp of DNA. MNase has traditionally been used to map positions of whole nucleosomes in intact nuclei by purifying approximately 147 bp DNA after MNase digestion and subjecting this DNA to massively parallel short-read sequencing [31]. Nucleosome positioning impacts all biochemical processes that occur on the genome and consequently, knowing nucleosome positions enables us to predict biochemical activities that occurred in the cells that resulted in these protections [32]. A striking example of a distinct nucleosome organization is found in active genes. There is a depletion of nucleosomes at active promoters and nucleosomes are well-ordered upstream and downstream of active promoters. cfDNA contains information on nucleosome positioning and high-quality nucleosome maps were obtained from deep, whole-genome cfDNA sequencing from the plasma of healthy donors [12,33–35].

Nucleosome density inferred from cfDNA of healthy individuals had the same features as that of lymphoid cell lines: genes highly expressed in lymphoid cell lines featured nucleosome depletion at promoters and ordered nucleosome positions upstream and downstream of the promoter in cfDNA (figure 1). By contrast, genes that were not expressed in these cell lines showed significant nucleosome density over the promoters and lack of ordering over gene bodies in cfDNA [12,35]. These observations strongly validated the lymphoid/myeloid origin of cfDNA in healthy humans.

Quantitative scores were developed based on these striking observations to connect nucleosome profiles to gene activity in the cfDNA tissue-of-origin. Snyder et al. showed that stronger periodicity of nucleosomes in the gene body (the region between the transcription start site (TSS) and TSS+5000 bp) correlated with higher gene expression in lymphoid/myeloid tissues for healthy donors [12]. However, in cfDNA from donors with cancer, the correlation of nucleosome periodicity at gene bodies with gene expression of lymphoid/myeloid tissues was much weaker, suggesting other cell types contributing to the cfDNA pool. This was confirmed by the fact that the correlation of periodicity with gene expression of other cell types increased for donors with cancer [12]. Thus, nucleosome periodicity could inform the gene expression of the cfDNA tissue(s)-of-origin.

Ulz et al. noted that overall nucleosome density was lower in 2 kb upstream and downstream of the TSS (which they termed ‘2 K-TSS') and lowest at the promoter itself (usually termed the ‘nucleosome depleted region', NDR) in expressed genes in both MNase-seq of a lymphoblastoid cell line and the cfDNA sequencing data from healthy donors [35]. They developed a model that used the nucleosome occupancy at 2 K-TSS and NDR to predict gene expression. In a person with cancer, tumour-contributed cfDNA would have a depletion of nucleosomes at active genes, but this depletion may be masked by high nucleosome occupancy in cfDNA from lymphoid/myeloid tissues. Ulz et al. circumvented this problem by focusing on regions in the genome that featured copy-number gains in cfDNA of donors with cancer. These genomic regions would have a higher representation in tumour cfDNA if the tumour was the source of these copy number gains. Their simulations suggested that at least 75% of cfDNA at a given TSS must be released from tumour cells to infer expression status using their method. In the regions of copy number gain, they demonstrated significant changes in nucleosome occupancy at 2 K-TSS and NDR that correlated with increased expression of these genes in the tumour as assessed by RNA-seq of matched tumour biopsy samples. Thus, promoter and gene-body depletion of cfDNA fragments are indicative of gene activity in the tissue-of-origin of cfDNA.

5. Subnucleosomes in cell-free DNA inform expression state of genes

Transcription also results in the formation of subnucleosomes proximal to the promoter and identification of subnucleosomes could serve as a proxy for measuring gene activity. In eukaryotic cells, transcription occurs on a chromatin template. Because RNA polymerase II (RNAPII) needs to unwind the DNA strands to make RNA, every protein-DNA contact in its path needs to be disrupted. In vitro, nucleosomes present a substantial barrier to transcription elongation [36,37], resulting in specific stalls by RNAPII at sites of strong histone-DNA contacts. In cells, we can map the positions where RNAPII stalls with base pair-resolution maps of the 3′ ends of nascent transcripts [38–41]. These maps have shown that the first nucleosome downstream of TSS (+1 nucleosome) presents a strong barrier to RNAPII in cells.

The effect of RNAPII stalling on the +1 nucleosome could be understood by mapping intermediate nucleosome states during transcription elongation. With sequencing library protocols that capture all fragment lengths combined with paired-end sequencing, the full spectrum of fragments generated by MNase treatment of nuclei can be uncovered [11,42–44]. Fragments between 50 and 147 bp are too short to be protected by a whole nucleosome, but too long to be TF footprints. These intermediate-length protections represent a discrete loss of contacts asymmetrically from either side of the nucleosome as it unwraps during transcription and remodelling (figure 1). Correlating a base-pair resolution map of RNAPII with the high-resolution distribution of nucleosomal intermediates at the +1 nucleosome revealed that nucleosome unwrapping occurs in a stepwise manner—first, the contacts to the H2A-H2B dimer proximal to the promoter are lost. Then as RNAPII elongates through the nucleosome, contacts to the H2A-H2B dimer distal to the promoter are lost [11]. Cryo-electron microscopy of unwrapped nucleosomes and of RNAPII transcribing nucleosome templates yielded structures that matched the in vivo structures inferred from paired-end sequencing [45–47]. These observations highlight the ability of genomic sequencing of short DNA fragments to detect transcription-dependent substructures of nucleosomes in cells.

cfDNA is highly nicked and nicked DNA is lost in standard double-stranded library preparation protocols. Inspired by methods used in Neanderthal genome sequencing projects, Snyder et al. used a single-stranded library protocol (SSP) that captures both nicked and non-nicked fragments [12,48]. Surprisingly, they found an abundance of fragments less than nucleosomal size, ranging from approximately 40 bp onwards. These short fragments resemble subnucleosomes observed in MNase sequencing data from Drosophila cells [11]. When the subnucleosomal cfDNA fragments were mapped at +1 nucleosome positions of genes expressed in lymphoid/myeloid tissues, the same asymmetric unwrapping intermediates that were seen in Drosophila cells could also be observed in the cfDNA data [11]. Thus, it seems that the long residence time of RNAPII near the +1 nucleosome results in long-lived nucleosomal intermediate states that are mappable both by MNase, and by the endogenous nucleases that give rise to cfDNA.

In Drosophila cells, it was found that the amount of the subnucleosomal particles relative to nucleosomal particles at the +1 nucleosome of a gene correlated with the extent to which that gene was transcribed [11]. Therefore, it was hypothesized that the amount of these intermediates relative to whole nucleosomes (subnucleosome enrichment) at the +1 nucleosome of genes in cfDNA would correlate with the composite expression profile of cells giving rise to cfDNA. Indeed, in a healthy donor, cfDNA subnucleosome enrichment correlated much better with expression profiles of lymphoid/myeloid tissue types compared to other tissue types. However, in donors with cancer, the subnucleosome enrichment corresponding to lymphoid/myeloid tissues weakened substantially, enabling robust differentiation of healthy and cancer plasma cfDNA [11]. Thus, subnucleosomes in cfDNA represent relics of transcription in cfDNA tissues-of-origin that can inform us about the transcriptional programmes active at disease sites.

6. Chromatin structure correlations across megabases

The observation that nucleosome dynamics are reflected by shorter protections in cfDNA can be extended to much larger length scales than single nucleosomes, which allows maximal use of low depth cfDNA sequencing data. Using a machine learning model, Cristiano et al. were able to observe similar ‘fragmentation profiles' at megabase scales between cfDNA from healthy donors and the DNA released by MNase treatment of healthy lymphocytes [49]. Fragmentation profile is a measure similar to subnucleosome enrichment: a ratio of small fragments (100–150 bp) to large cfDNA fragments (151–220 bp). A significant difference in fragmentation profiles was observed between cfDNA from healthy donors and donors with cancer, enabling detection of cancer with low-depth whole-genome cfDNA sequencing. This method works presumably because fragmentation profiles at large length scales differentiate active domains of the chromosome from inactive domains. A tumour is expected to have significantly different active chromatin domains at the megabase scale compared to lymphoid/myeloid tissues.

A similar hypothesis is that the strength of correlation of cfDNA length profiles between genomic loci is proportional to the correlation of contacts made by the loci to the rest of the chromosome [50,51]. The correlation matrix of contact probability for a cell type can be obtained by Hi-C [52]. The Hi-C method involves crosslinking cells, fragmenting the genome into large pieces with the crosslinks intact, and then ligating the cross-linked fragments. Sequencing of the ligated contacts reveals chromatin contacts genome-wide. Regions of the genome with similar activity share similar contact profiles across the chromosome. Liu et al. showed that the strength of correlation of healthy cfDNA length profiles between different genomic regions is proportional to the strength of correlation of Hi-C contacts between different genomic regions as measured in lymphoblastoid cells. Furthermore, this correlation of cfDNA length profiles between different regions of a chromosome could be modelled as a combination of Hi-C maps of different tissue types to uncover tissue contributions to cfDNA in tumour samples with high (greater than 30%) tumour fractions [50]. Thus, cfDNA profiles could be used to infer chromosome contacts in the tissue(s)-of-origin.

7. Distinct cell-free DNA patterns at transcription factor binding sites

TF binding sites at promoters, enhancers, and insulators show enrichment of short protections (less than 50 bp) and depletion of nucleosomes in MNase-seq experiments [11,42,43,53–55]. Binding of many TFs also results in the ordering of nucleosomes around the TF binding sites [56]. Thus, protected TF binding sites represent a discrete class of genomic loci that show distinctive chromatin structural profiles in nuclease-protection assays. The enrichment of short fragments in cfDNA using SSP enabled Snyder et al. to observe similar enrichment of short protections and ordered nucleosome arrays at TF binding sites in cfDNA datasets from healthy plasma. They also observed an enrichment of short fragments in cfDNA at promoters that was proportional to expression levels of a lymphoid cell line, demonstrating the ability to possibly identify transcriptional complexes at a promoter from cfDNA [12].

Ulz et al. found that mononucleosome depletion observed in cfDNA at known TF-binding sites (TFBSs) is a good proxy for inferring TF binding [57]. This enables inference of TF binding from cfDNA sequenced using standard double stranded protocols that do not enrich for short fragments. They selected a set of TFs which are lineage-specific, for example, Androgen Receptor (prostate), Even-Skipped Homeobox 2 (colon), Forkhead box A1 (breast), and for each of them, profiled 1000 binding sites that were concordant across tissue samples [58]. Using plasma from patients with prostate, breast, and colon cancer, they showed that nucleosome depletion levels at binding sites of tumour-specific TFs are significantly higher compared to healthy cohorts and the reverse was true at binding sites for haematopoietic lineage-specific TFs such as LYL1, and EVI1. In addition, they also showed that nucleosome depletion levels at specific TFBSs were predictive of tumour subtypes. For instance, they found a significant reduction in nucleosome depletion at Androgen Receptor-binding sites when comparing samples from before and after a patient's prostate adenocarcinoma became androgen-independent. Thus, TF binding can be inferred from cfDNA either directly through short fragment protections when using SSP or indirectly via nucleosome depletion at TFBSs when using standard double-stranded library protocols and tissue-specific TFBSs enable identification of tissues that contribute to cfDNA.

8. Cell-free DNA fragment length

As we have discussed above, cfDNA length reflects the structure of chromatin in cells of origin and can be explicitly modelled as such. Beyond trying to understand cfDNA profiles in terms of chromatin structure, there have been several useful observations about the use of cfDNA length in biomarker development, for which we can only speculate the underlying molecular details. At its most general, the size of cfDNA fragments is used to delineate between baseline homeostasis and other biological phenomena that give rise to cfDNA. cfDNA has already been directly applied in the clinic for pre-natal testing. In plasma, fetal cfDNA is shorter than maternal cfDNA [13,59,60], which enables detection of aneuploidy or recessive disorders in the fetus non-invasively. Urine cfDNA features short periodic fragments that resemble subnucleosomes [51]. In individuals with cancer, circulating tumour DNA resides in the shorter cfDNA fraction [61–63]. The frequency of shorter, non-tumour cfDNAs is typically low and thus size selection for shorter fragments could dramatically increase the sensitivity of detection for mutant tumour cfDNA. Mutation targeting and identification of copy number variation and/or single copy number alterations is achieved with a higher sensitivity if the shorter cfDNA fraction is profiled [61,62]. This is a consequence of mutant tumour cfDNA being diluted less with non-tumour cfDNA in the shorter fraction. In the light of these observations, one prediction is that shorter cfDNA is a product of a specific mechanism that occurs at a higher frequency in fetal cells, cells that give rise to cfDNA in urine, and cancer cells relative to normal lymphoid/myeloid cell turnover.

9. Cell-free DNA chromatin immunoprecipitation uses cell type-specific genome-wide patterns of histone modifications to identify tissues of origin

Several studies in the early 2000s used ELISA to capture and calculate the concentration of nucleosomes in plasma [20,22–24,64,65]. Specifically, nucleosomes were captured in an antibody ‘sandwich', which used an antibody for a histone and an antibody for double-stranded DNA. This approach was an alternative means to assess cell death using plasma from cancer patients. In a notable study, cancer patients exhibited a statistically significant increase in nucleosome concentration compared to healthy individuals [20]. These findings suggest that nucleosome concentration could act as a biomarker for a disease state and/or discriminate between individuals with disease and those who are healthy. However, this application lacks specific genomic information to identify the tissue-of-origin and specify the disease state.

Beyond differences in overall nucleosome concentrations among physiological states, an intriguing question is if post-translational modifications (PTMs) of nucleosomal histones in plasma can be used to differentiate healthy individuals and those with disease (figure 1). PTMs of nucleosomal histones and DNA differ in euchromatic regions versus heterochromatic regions [66,67]. PTMs range from small chemical groups to larger proteins, such as ubiquitin, that are added to specific amino acids of proteins. For example, tri-methylation of histone 3 lysine 27 (H3K27me3) or H3K9me3 are found at heterochromatic regions where gene activity is repressed or ‘silent'. By contrast, H3K4me3 or H3K36me3 are associated with euchromatic regions where genes are active [68,69].

The link between cancer and chromatin regulation is well documented [70]. The majority of oncogenic mutations occur in genes of chromatin modifiers [71–73], which include a number of tumour-suppressor genes, such as SIRT1 [74]. Genomic instability is a hallmark of cancer and a consequence of alterations in heterochromatin that disrupt silencing [75,76]. Deligezer et al. analysed histone PTMs on circulating nucleosomes in plasma [22]. In light of the evidence for deregulation of repressive PTMs associated with gene silencing in cancer, histone methylation, specifically H3K9me1, was first assessed on circulating nucleosomes from myeloma patient plasma samples. Follow-up papers identified a reduction in repressive chromatin marks (H3K9me3, H4K20me3 and H3K27me3) in patients with colorectal cancer and metastatic prostate cancer [22,23]. However, these studies did not use high-throughput sequencing technology that would provide information on the genomic locations of histone PTMs an aspect that is important to consider when delineating between different physiological states (i.e. disease and non-disease states) that produce changes in PTM levels in circulating nucleosomes.

A recent study sought to assess circulating post-translationally modified nucleosomes in a variety of physiological states using a combination of ChIP and next-generation sequencing [21]. The authors created a workflow to isolate modified circulating nucleosomes from plasma and performed high-throughput sequencing of the associated DNA (cfChIP-seq). Modified nucleosomes containing PTMs associated with active genes or cis-regulatory elements (i.e. enhancers) were specifically targeted: H3K4me1/2/3 and H3K36me3. H3K4me3 cfChIP-seq signal was used as a proxy for active genes and recapitulated earlier findings that cell-type specific gene activation programmes belonged to mainly blood lineages in a healthy individual. Furthermore, the cfChIP-seq signals reflected previously identified ChIP-seq signals for PTMs in these lineages.

This analysis was extended to profile patients with a variety of physiological insults, including surgery and cancer. cfChIP-seq detected differences in gene expression in individuals with cancer compared to healthy individuals. In response to surgical interventions, changes in tissue-specific cfChIP-signatures were detectable in the blood of patients supporting tissue-of-origin specificity. Combinations of PTMs were also assessed for complementary information to further profile tissue-type specific gene activity from non-coding regions. The authors observed changes in H3K4me2 (found at putative enhancer elements) and H3K36me3 (found within the body of transcribed genes) that correlated with differential gene activity unique to cancer tumours. Overall, the ability to identify the tissue-of-origin based on enrichment of circulating nucleosome PTMs associated with transcription at specific regions of the genome is exciting. cfChIP-sequencing provides an additional layer of information about an individual's underlying physiological state derived from the blood.

10. Cell-free DNA methylation patterns identify tissues of origin

Methylation of cytosines in the CpG dinucleotide context is associated with cellular identity [77] and can be identified on cfDNA [78,79]. Deamination of cytosine to uracil using sodium bisulfite or using an antibody specific to CpG methylation to pulldown methylated DNA are the two main methods used to map CpG methylation genome wide. Often promoter hypermethylation of a gene is associated with silencing [79]. DNA methylation profiles are stable and cell-type specific, and differentially methylated regions (DMRs) have been extensively used in quantification of subpopulations in DNA extracted from heterogeneous cell populations [80,81]. Accomando et al. showed that cell-types in leucocytes can be quantified using methylation status at as few as 20 CpG loci [82]. Many genomic locations exhibit highly cell-type specific DNA methylation, which has been instrumental in developing computational methods to delineate the contribution of tissues to cfDNA. CpG islands, a region 300–3000 bp in length and rich in G + C content, are usually hypomethylated, but aberrant methylation of these regions is associated with diseases like cancer [83]. Some CpG islands share high methylation levels across tumour types, while others are tumour specific [84]. Promoter hypermethylation of tumour suppressor genes is especially a striking feature of tumours particularly during carcinogenesis [85,86]. Targeted amplification of candidate promoter regions has been used to find that cfDNA from cancer patients exhibit hypermethylation in contrast to healthy donors [87–89]. Using methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP-seq) optimized for low DNA amounts, Shen et al. detected numerous DMRs in cfDNA from individuals with cancer that are specific to tumour tissue-of-origin [90]. In particular, they showed that plasma DMRs in individuals with colorectal cancer closely matched solid tumour-derived DMRs. Thus, tissue-specific methylation patterns and hypermethylation of tumour suppressor genes can be used as signatures to detect cancer as well as identify cfDNA tissue(s)-of-origin [91].

11. Conclusion/future perspectives

The remarkable observation in 1970 that hinted at a relationship between cytoplasmic DNA and the chromatin structure of the cell-of-origin now underlies the conceptual paradigm of cfDNA epigenomics [18]. As there is an increasing awareness of the limitations associated with detecting and identifying diseases, such as cancer, solely based on mutant genotypes, the emergence of cfDNA approaches based on epigenomics provides a valuable alternative (figure 2). Chromatin remodellers, chromatin-modifying complexes and DNA methyltransferases are frequently dysregulated in cancer highlighting the relationship between chromatin regulation and oncogenesis [92–97]. Furthermore, simulations show that using hundreds of features throughout the genome (which would be the case for epigenomic features) improves the limit of detection of disease states from cfDNA compared to a few features (which would be the case when looking for tumour mutations) [49,90]. Combining epigenomic assessments with mutation-based targeting may better guide personalized treatment of cancer patients rather than solely relying on one method.

Figure 2. Clinical applications for cancer patients using epigenomic features of cell-free DNA.

Early detection of cancer still remains a challenge for all cfDNA-based methods. An early cancer diagnosis increases a patient's chance for curative treatment. However, tumour shedding of DNA into the blood is at a lower concentration in early stages than what is observed in advanced cancer stages. Most methods described above have been used on samples of advanced cancer patients indicating a much-needed effort to examine their use and sensitivity for early detection. However, significant in-roads are being made. A recent multi-centre, randomized study used cfDNA methylation analysis to prospectively assess the largest cohort (N = 6689, 4207 healthy and 2482 cancer) to date for early detection and localization of more than 50 types of cancers [91]. With 99.3% specificity, the sensitivity increased as cancer stage increased (Stage I: 18%—Stage IV: 93%), with tissue-of-origin predicting cancer in 96% of samples with an accuracy of 93%. These are promising results for the future development of a cancer screening test for the general population. With improvements over time, cfDNA epigenomic methods described in this review can be combined with current clinical practices to improve detection of cancer in patients.

Obtaining molecular signatures of cancer based on epigenomic features highlights the variety of information contained in the blood of an individual. The studies we reviewed here represent an orthogonal network of disease-specific epigenomic information that is rich for exploitation. Combined with current clinical molecular diagnostics, the timely emergence of epigenomic cfDNA methods herald a chance to revolutionize disease management, specifically cancer. One can envision the successful implementation of these approaches to help guide personalized medicine at different stages of disease beginning with diagnosis and throughout the course of treatment. Beyond biomarkers, diverse epigenomic cfDNA methodologies also provide the opportunity to directly investigate the molecular mechanisms underlying pathology in humans.


Bekijk de video: DNS uzbūve. Gēni, hromosomas (Januari- 2022).