Informatie

Tweewaardige kationbinding aan calmoduline


Ik heb een natieve PAGE uitgevoerd met 4 reactiemengsels. Aan elk had ik een gelijk volume EDTA (1 µl/1 mM) toegevoegd om eventuele tweewaardige ionen af ​​te scheiden en een gelijk volume calmoduline (5 µl/0,5 mg/ml). Ik voegde respectievelijk 2 µl calcium (2 mM), magnesium (2 mM) en mangaan (2 mM) ionen toe aan drie reactiemengsels en had een controle die tot een gelijk volume was aangevuld met Tris-HCl. Alle reactiemengsels werden aangevuld tot 10 µl met Tris-HCl. Hier liep ik tegen een probleem aan met de waterbaden en de reacties waren niet te incuberen bij 37 graden Celsius.

Nadat ik aan elk de laadbuffer had toegevoegd, voegde ik de 4 reactiemengsels toe aan de polyacrylamidegel en elektroforese gedurende 45 minuten bij 150 V. Hierna plaatste ik de gel gedurende 20 minuten in Coomassie Blue-kleuring.

Na het ontkleuringsproces bekeek ik de gel om te ontdekken dat de calmoduline in de 4 banen dezelfde afstand had gemigreerd. Ik had verwacht dat de EDTA-controle het verst op de gel zou migreren, waarbij Ca2+ en Mn2+ vergelijkbare afstanden zouden afleggen vanwege hun vergelijkbare ionische stralen; waardoor het een goede vervanging is voor de binding aan het calmoduline. Ik wist niet zeker hoe ver de Mg2+ zou reizen, omdat ik dacht dat het een lagere affiniteit voor het calmoduline zou hebben vanwege zijn binding aan het N-uiteinde in plaats van aan het C-uiteinde. Ik vroeg me echter af of dit verwaarloosbaar was in de afwezigheid van Ca2+, hoewel ik het nu niet zeker weet vanwege de resultaten van de gel.

Ik vroeg me af welke fouten in het experimentele ontwerp of proces hierin kunnen hebben geresulteerd? En als het experiment correct werd uitgevoerd, welke resultaten zouden dan worden verwacht?

De eerste afbeelding is het resultaat dat ik verwachtte. De tweede zijn de resultaten van mijn gelelektroforese.


De verandering in gelmigratieafstand is te wijten aan de conformationele veranderingen als gevolg van de binding van het ion, en heeft niets (detecteerbaar) te maken met de ionische straal van het ion.

De linker afbeelding toont calmoduline zonder gebonden ligand, en de rechter afbeelding toont het met calcium en peptide eraan gebonden.

Zoals u duidelijk kunt zien, is het ongebonden calmoduline aanzienlijk dunner en kan het daarom sneller door de gel migreren. De verandering in lading op het eiwit als gevolg van kationbinding in natieve PAGE kan ook het resultaat beïnvloeden.

Aangezien de conformatieverandering van calmoduline wordt versterkt door zowel een peptide als calciumkationen, evenals de fosforyleringstoestand ervan, zou het redelijk zijn om de bijdragen van deze factoren aan uw resultaat te onderzoeken. Het kan ook nuttig zijn om de originele krant opnieuw te lezen om te zien wat u de eerste keer hebt gemist.


Calmoduline

Calmoduline, of calcium-gemoduleerd eiwit, is een calciumbindend eiwit dat wordt aangetroffen in het cytoplasma van alle eukaryote cellen. Het interageert met veel andere eiwitten in de cel en werkt als een regulator of een effectormolecuul in een breed scala aan cellulaire functies. Deze functies omvatten zaken die zo divers zijn als regulering van de celcyclus, intracellulaire signalering, bevruchting en spiercontractie. Calmoduline zit in een familie van eiwitten samen met troponine C, een ander essentieel calciumbindend eiwit dat betrokken is bij spiercontractie. Calmoduline is een essentieel eiwitmutaties voor een van de voor calmoduline coderende genen of schade aan de calmoduline-bindingsplaatsen blijkt vaak dodelijk.


Inhoud

Calmoduline is een klein, sterk geconserveerd eiwit dat 148 aminozuren lang is (16,7'160 KDa). Het eiwit heeft twee ongeveer symmetrische bolvormige domeinen die elk een paar EF-handmotieven bevatten (de N- en C-domein) gescheiden door een flexibel linkergebied voor in totaal vier Ca2+-bindingsplaatsen. Γ] Elk handmotief stelt calmoduline in staat om intracellulaire calciumniveaus te detecteren door één Ca2+-ion te binden. Calciumion-bindende regio's worden gevonden op de volgende posities in de volgorde van aminozuren: 21-32, 57-68, 94-105 en 130-141 elk gebied waaraan calcium bindt is precies 12 aminozuren lang. Deze regio's bevinden zich tussen twee alfa-helices in de EF-handmotieven, de eerste twee regio's (21-32 en 57-68) bevinden zich aan de ene kant van de linkerregio, de andere twee (94-105 en 130-141) bevinden zich aan de andere kant. Β]

Belang van flexibiliteit in calmoduline

Calmoduline bindt zo'n grote verscheidenheid aan doeleiwitten, waardoor het vooral belangrijk is dat het flexibel is. Hoewel de flexibiliteit van calmoduline duidelijker is wanneer het aan een doeleiwit is gebonden, hebben NMR-onderzoeken aangetoond dat het linkergebied van calmoduline flexibel is, zelfs wanneer het niet aan een doeleiwit is gebonden. Een ander belangrijk kenmerk van calmoduline dat het in staat stelt om een ​​grote verscheidenheid aan doeleiwitten te binden, is de generieke vorm van de niet-polaire groeven in de bindingsplaatsen. Omdat de niet-polaire groeven generiek zijn, vereisen ze niet dat de doeleiwitten een specifieke sequentie van aminozuren hebben, waardoor een grotere verscheidenheid aan doeleiwitten kan worden gebonden. Samen maken deze twee structurele kenmerken van calmoduline het mogelijk om op flexibele wijze doeleiwitten met verschillende vormen en aminozuursequenties te binden. Γ] Calmoduline bindt bijvoorbeeld zowel NMDA-receptoren als kaliumkanalen die in lengte ongeveer 50 aminozuurresiduen verschillen. Δ'93 Ε'93

Overeenkomst met troponine C

De structuur van calmoduline lijkt sterk op de structuur van troponine C (een ander calciumbindend eiwit). Ze zijn allebei lid van de EFh-superfamilie. Troponine C heeft, net als calmoduline, twee bolvormige domeinen die zijn verbonden door een linkergebied. Ζ] Troponine C en calmoduline verschillen echter in de lengte van het linkergebied het linkergebied van calmoduline is kleiner dan dat van troponine C. Ζ] Deze opmerkelijk vergelijkbare structuren zijn een voorbeeld van hoe het EF-handmotief is sterk geconserveerd in calciumbindende eiwitten. Hoewel ze vergelijkbare structuren hebben, zijn hun functies heel verschillend. Troponine C heeft een zeer specifieke functie (om een ​​conformationele verandering in troponine I teweeg te brengen) die uiteindelijk een samentrekking van de skeletspieren veroorzaakt. Calmoduline is geëvolueerd om een ​​grotere verscheidenheid aan doeleiwitten te binden, waardoor het een rol kan spelen bij veel fysiologische gebeurtenissen. Γ'93 Ζ'93


Tweewaardige kationbinding aan erytrocytenspectrine

Artikelweergaven zijn de COUNTER-conforme som van full-text artikeldownloads sinds november 2008 (zowel PDF als HTML) bij alle instellingen en individuen. Deze statistieken worden regelmatig bijgewerkt om het gebruik in de aanloop naar de afgelopen dagen weer te geven.

Citaties zijn het aantal andere artikelen waarin dit artikel wordt geciteerd, berekend door Crossref en dagelijks bijgewerkt. Vind meer informatie over Crossref citatietellingen.

De Altmetric Attention Score is een kwantitatieve maat voor de aandacht die een onderzoeksartikel online heeft gekregen. Als u op het donutpictogram klikt, wordt een pagina op altmetric.com geladen met aanvullende details over de score en de aanwezigheid op sociale media voor het betreffende artikel. Vind meer informatie over de Altmetric Attention Score en hoe de score wordt berekend.

Opmerking: In plaats van een samenvatting is dit de eerste pagina van het artikel.


Het gebruik van ESI-MS om de binding van tweewaardige kationen aan calmoduline te onderzoeken

  • APA
  • Auteur
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standaard
  • RIS
  • Vancouver

Onderzoeksoutput : Bijdrage aan tijdschrift › Artikel › peer-review

T1 - Het gebruik van ESI-MS om de binding van tweewaardige kationen aan calmoduline te onderzoeken

N2 - Eiwitten zijn geëvolueerd met verschillende plaatsen voor het binden van bepaalde metaalionen. Hierdoor kunnen metalloproteïnen een groot aantal gespecialiseerde taken uitvoeren met conformaties op maat gemaakt door de combinatie van de primaire sequentie en het effect daarop van het geligeerde metaalion. Hier onderzoeken we de selectiviteit van het calciumtrigger-eiwit calmoduline voor tweewaardige metaalionen. Dit alomtegenwoordige en zeer overvloedige eiwit bestaat in evenwicht tussen zijn apo- en zijn holo-vorm waarin vier calciumionen zijn gebonden. Onder zijn vele functies moduleert calmoduline de calciumconcentratie die aanwezig is in cellen, maar deze functionele eigenschap maakt het een doelwit voor concurrentie van andere metaalionen. We bestuderen de concurrentie van vier andere tweewaardige kationen voor de calciumbindingsplaatsen in calmoduline met behulp van elektrospray-ionisatiemassaspectrometrie (ESI-MS). We hebben gekozen voor twee andere groep II-kationen Mg(2+), Sr(2+), en twee zware metalen Cd(2+), Pb(2+). Het gemak waarmee elk van deze metalen bindt aan apo en aan holo CaM[4Ca] wordt beschreven. We vinden dat elk metaalion verschillende eigenschappen heeft met betrekking tot calmodulinebinding en competitie met calcium. De volgorde van affiniteit voor apo CaM is Ca(2+) >> Sr(2+) ongeveer Mg(2+) > Pb(2+) ongeveer Cd(2+). In aanwezigheid van calcium verandert de affiniteit in Pb(2+) > Ca(2+) > Cd(2+) > Sr(2+) > Mg(2+). Zodra er complexen zijn gevormd tussen de metaalionen en het eiwit (CaM:[xM]), onderzoeken we of de structurele verandering die calciumligatie moet vergezellen om doelbinding mogelijk te maken, plaatsvindt voor een bepaald CaM:[xM]-systeem. We gebruiken een doelpeptide van 20 residuen, dat de CaM-bindingsplaats vormt binnen het enzym neuronale stikstofoxidesynthase. Ons eerdere werk (Shirran et al. 2005) [1] heeft de specifieke selectiviteit van dit systeem voor CaM:4Ca(2+) aangetoond. We vinden dat samen met Ca(2+) alleen Pb(2+) complexen vormt van de vorm CaM:4M(2+):nNOS. Dit werk toont de affiniteit voor calcium aan boven alle andere metalen, maar waarschuwt ook voor het vermogen van lood om calcium schijnbaar gemakkelijk te vervangen.

AB - Eiwitten zijn geëvolueerd met verschillende plaatsen voor het binden van bepaalde metaalionen. Hierdoor kunnen metalloproteïnen een groot aantal gespecialiseerde taken uitvoeren met conformaties op maat gemaakt door de combinatie van de primaire sequentie en het effect daarop van het geligeerde metaalion. Hier onderzoeken we de selectiviteit van het calciumtrigger-eiwit calmoduline voor tweewaardige metaalionen. Dit alomtegenwoordige en zeer overvloedige eiwit bestaat in evenwicht tussen zijn apo- en zijn holo-vorm waarin vier calciumionen zijn gebonden. Onder zijn vele functies moduleert calmoduline de calciumconcentratie die aanwezig is in cellen, maar deze functionele eigenschap maakt het een doelwit voor concurrentie van andere metaalionen. We bestuderen de concurrentie van vier andere tweewaardige kationen voor de calciumbindingsplaatsen in calmoduline met behulp van elektrospray-ionisatiemassaspectrometrie (ESI-MS). We hebben gekozen voor twee andere groep II-kationen Mg(2+), Sr(2+), en twee zware metalen Cd(2+), Pb(2+). Het gemak waarmee elk van deze metalen bindt aan apo en aan holo CaM[4Ca] wordt beschreven. We vinden dat elk metaalion verschillende eigenschappen heeft met betrekking tot calmodulinebinding en competitie met calcium. De volgorde van affiniteit voor apo CaM is Ca(2+) >> Sr(2+) ongeveer Mg(2+) > Pb(2+) ongeveer Cd(2+). In aanwezigheid van calcium verandert de affiniteit in Pb(2+) > Ca(2+) > Cd(2+) > Sr(2+) > Mg(2+). Zodra er complexen zijn gevormd tussen de metaalionen en het eiwit (CaM:[xM]), onderzoeken we of de structurele verandering die calciumligatie moet vergezellen om doelbinding mogelijk te maken, plaatsvindt voor een bepaald CaM:[xM]-systeem. We gebruiken een doelpeptide van 20 residuen, dat de CaM-bindingsplaats vormt binnen het enzym neuronale stikstofoxidesynthase. Ons eerdere werk (Shirran et al. 2005) [1] heeft de specifieke selectiviteit van dit systeem voor CaM:4Ca(2+) aangetoond. We vinden dat samen met Ca(2+) alleen Pb(2+) complexen vormt van de vorm CaM:4M(2+):nNOS. Dit werk toont de affiniteit voor calcium aan boven alle andere metalen, maar waarschuwt ook voor het vermogen van lood om calcium schijnbaar gemakkelijk te vervangen.


Tweewaardige kationbinding aan calmoduline - Biologie

Geoffrey Hoops (Butler Universiteit)

Beschrijving

Tuberculose is tegenwoordig wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak, veroorzaakt door de bacterie Mycobaterium tuberculosis. Meerdere enzymen, waaronder esterase Rv0045c van M. tuberculosis, helpen bij de persistentie van de ziekte. Ik onderzocht de remming van Rv0045c door tweewaardige metalen en de structurele componenten van Rv0045c die verantwoordelijk zijn voor de regulatie ervan. Stabiele kinetische testen werden uitgevoerd met behulp van fluorogene estersubstraten om het effect van tweewaardige metaalkationen op Rv0045c-katalyse te analyseren. Op basis van de resultaten van de kinetische gegevens lijken diverse tweewaardige metalen te dienen als allosterische remmers van Rv0045c, aangezien de KM-waarde stabiel bleef tijdens de tests ondanks de aanwezigheid van tweewaardige metalen, terwijl de kcat-waarde drastisch afnam. De volgende metalen remden Rv0045c met verschillende specificiteiten zoals gemeten door IC50-waarden: koper (Cu2+ 105.9M), zink (Zn2+ 105.6M), nikkel (Ni2+ 104.6M) en kobalt (Co2+ 10-3.5M) . Verwijdering van de 6X His-tag door trombine-enzym slaagde er niet in het remmende effect van de tweewaardige metaalionen te verwijderen, wat aangeeft dat de affiniteitszuiveringstag niet de tweewaardige metaalbindingsplaats is. In een poging om de allosterische bindingsplaats van deze tweewaardige metaalkationen te lokaliseren, veranderde ik potentiële aminozuurbindingsresiduen in alanine via plaatsgerichte mutagenese. De metaalremmingskinetiek van wildtype Rv0045c werd vergeleken met negen Rv0045c-varianten. Een ander residu met significant potentieel voor binding, werd gemuteerd tot glutamine in plaats van alanine, om de eiwitstructuur en functie te behouden ter vergelijking met WT.

Dit document is momenteel niet beschikbaar hier.

Deel

Bindingsplaats van tweewaardige overgangsmetaalkationen op Esterase Rv0045c van Mycobacterium tuberculosis

Tuberculose is tegenwoordig wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak, veroorzaakt door de bacterie Mycobaterium tuberculosis. Meerdere enzymen, waaronder esterase Rv0045c van M. tuberculosis, helpen bij de persistentie van de ziekte. Ik onderzocht de remming van Rv0045c door tweewaardige metalen en de structurele componenten van Rv0045c die verantwoordelijk zijn voor de regulatie ervan. Stabiele kinetische testen werden uitgevoerd met behulp van fluorogene estersubstraten om het effect van tweewaardige metaalkationen op Rv0045c-katalyse te analyseren. Op basis van de resultaten van de kinetische gegevens lijken diverse tweewaardige metalen te dienen als allosterische remmers van Rv0045c, aangezien de KM-waarde stabiel bleef tijdens de tests ondanks de aanwezigheid van tweewaardige metalen, terwijl de kcat-waarde drastisch afnam. De volgende metalen remden Rv0045c met verschillende specificiteiten zoals gemeten door IC50-waarden: koper (Cu2+ 105.9M), zink (Zn2+ 105.6M), nikkel (Ni2+ 104.6M) en kobalt (Co2+ 10-3.5M) . Verwijdering van de 6X His-tag door trombine-enzym slaagde er niet in het remmende effect van de tweewaardige metaalionen te verwijderen, wat aangeeft dat de affiniteitszuiveringstag niet de tweewaardige metaalbindingsplaats is. In een poging om de allosterische bindingsplaats van deze tweewaardige metaalkationen te lokaliseren, veranderde ik potentiële aminozuurbindingsresiduen in alanine via plaatsgerichte mutagenese. De metaalremmingskinetiek van wildtype Rv0045c werd vergeleken met negen Rv0045c-varianten. Een ander residu met significant potentieel voor binding, werd gemuteerd tot glutamine in plaats van alanine, om de eiwitstructuur en functie te behouden ter vergelijking met WT.


V. Aminozuur-gated NSCC's

Ionische geleiding geactiveerd door aminozuren, met name door glutamaat en glycine, zijn van cruciaal belang voor synaptische transmissie en andere complexe fysiologische verschijnselen bij dieren ( Dingledine et al., 1999 ). Door aminozuur geactiveerde conductanties worden gemedieerd door ionotrope glutamaatreceptoren. Na binding van glutamaat of glycine vormen ionotrope glutamaatreceptoren (iGluR's) kationkanalen met variabele selectiviteit, conductantie, kinetiek en farmacologie ( Dingledine et al., 1999 ). Genen met overeenkomsten met die coderen voor dierlijke ionotrope glutamaatreceptoren zijn gevonden in planten (Lam et al., 1998 ). Twintig glutamaatreceptorachtige genen (genaamd GLRs Fig. 5) zijn te vinden in het genoom van Arabidopsis thaliana en zijn onderverdeeld in drie subgroepen op basis van sequentieovereenkomst ( Lacombe et al., 2001 Chiu et al., 2002 ). de familie van GLR genen in planten vertoont een grote afwijking van zijn dierlijke tegenhanger, met name in het poriegebied (Davenport, 2002). Omdat functionele analyse ontbreekt, is het nog steeds onbekend welk type kanaal wordt gecodeerd door GLR's, maar op basis van algemene homologie met hun dierlijke tegenhangers wordt aangenomen dat GLR's een subklasse zijn van ligand-gated NSCC (Davenport, 2002).

Bij dieren zijn veel iGluR's NSCC's. Sommigen van hen vormen Ca2+-permeabele NSCC's met eigenschappen die vergelijkbaar zijn met constitutieve VI-NSCC's van hogere planten. Dennison & Spalding (2000) rapporteerden dat extracellulaire toediening van glutamaat tijdelijke verhogingen van [Ca 2+] veroorzaaktecyt in Arabidopsis zaailingen. Lanthaniden remden dit effect, evenals verwijdering van bad Ca2+, wat suggereert dat Ca2+ het cytosol binnenging via glutamaat-geactiveerde kationkanalen. Met hetzelfde experimentele systeem, Dubos et al. (2003) hebben ontdekt dat toevoeging van glycine ook [Ca 2+] kan verhogencyt. Ze toonden ook aan dat glycine synergetische effecten heeft wanneer het gelijktijdig met glutamaat wordt toegevoegd, waarschijnlijk omdat het de affiniteit van glutamaatbinding aan de receptor verhoogt. Demidchik et al. (2004 ) verkregen gegevens over protoplasten geïsoleerd uit verschillende wortelweefsels en toonden aan dat vergelijkbare hoeveelheden glutamaat grotere verhogingen van [Ca2+] induceerden.cyt in volwassen epidermale en corticale cellen vergeleken met cellen uit diepere weefsels. Deze auteurs hebben ook de eerste elektrofysiologische karakterisering van glutamaat-geactiveerde stromen in planten uitgevoerd en ontdekten dat de waarschijnlijkheid om glutamaat-geactiveerde conductanties waar te nemen laag is en toeneemt met toenemende glutamaatconcentraties. De geregistreerde door glutamaat geactiveerde conductanties waren niet-selectief voor monovalente kationen, Ca2+-permeabel, spanningsonafhankelijk en onthulden onmiddellijke activeringskinetiek. Kanaalactiviteit was gevoelig voor kinine en lanthaniden, wat lijkt op de farmacologie van constitutieve VI-NSCC's.

De functionaliteit van plantaardige ionotrope glutamaatreceptoren is in twijfel getrokken, met name met betrekking tot de beschikbaarheid van ligand in het extracellulaire compartiment. Verschillende onderzoeken hebben echter aangetoond dat apoplastische concentraties van glutamaat en glycine kunnen variëren van 0,01 tot 1 m mm (Lohaus et al., 1995 , 2001 Lohaus & Heldt, 1997 ). Dergelijke concentraties zijn hoog genoeg om ionotrope glutamaatreceptoren te activeren, en apoplastisch glutamaat en glycine zouden daarom kunnen functioneren bij de opname van Ca2+ door planten en/of signalering.

Ondanks het ontbreken van elektrofysiologische karakterisering, zijn effecten van exogene aminozuren op plantencelfysiologie en fenotypische eigenschappen van glr knock-outmutanten zijn de afgelopen 5 jaar het onderwerp geweest van intensief onderzoek. Een aantal onderzoeken heeft aangetoond dat blootstelling aan extracellulair glutamaat Ca2+-afhankelijke fysiologische processen wijzigt, zoals depolymerisatie van microtubuli, celverlenging en reacties op aluminium (Sivaguru et al., 2003 ), wortelvertakking ( Walch-Liu et al., 2006) en suikerdetectie (Dubos et al., 2005 ). Verlies van functie mutaties in Oryza sativa GLR3.1 (Li et al., 2006 ) en Bij GLR3.2 (Kim et al., 2001 Turano et al., 2002) toonden hun betrokkenheid bij Ca2+-accumulatie en Ca2+-gemedieerde reacties, bijvoorbeeld stressreacties, geprogrammeerde celdood, celdeling en differentiatie. Bij GLR 1.1 kan betrokken zijn bij zaadkieming en ABA-gemedieerde processen (Kang & Turano, 2003 Kang et al., 2004 ). Overexpressie van een radijs GLR (Kang et al., 2006 ) in Arabidopsis verbeterde door glutamaat geactiveerde tijdelijke [Ca 2+ ]cyt verhoging en veranderde Ca2+-gemedieerde mechanismen zoals necrose, groei en ontwikkeling. Bovendien resulteerde het in een verhoogde weerstand tegen een schimmelpathogeen, mogelijk vanwege de opwaartse regulatie van op jasmonzuur reagerende defensinegenen. Sterk bewijs dat GLR3.3 Ca2+-permeabele kanalen vormt, is recentelijk verkregen door Qi et al. (2006). Depolarisatie en verhoging van [Ca 2+ ]cyt geïnduceerd door glutamaat werden voorkomen in glr3.3 knock-out mutanten. Interessant is dat, naast glutamaat, is aangetoond dat vijf andere aminozuren (glycine, alanine, serine, asparagine en cysteïne) en glutathion (g-glutamyl-cysteinyl-Gly) agonisten zijn van de GLR3.3-geïnduceerde reacties. Over het algemeen suggereren deze gegevens sterk dat glutamaat fysiologische effecten veroorzaakt door een toename van [Ca 2+ ]cyt gekatalyseerd door iGluRs. Sommige van deze effecten, bijvoorbeeld veranderde ABA-signalering, kunnen ook worden gemedieerd door ROS, omdat een toename van [Ca 2+ ]cyt activeert membraangebonden NADPH-oxidasen (Sagi & Fluhr, 2001).


Bronnen:

Bertini, Grijs, Steifel, Valentijn. Biologische anorganische chemie, vijfde editie, W.H. Freeman en Co., New York, 2010.

&ldquoCalmodulin.&rdquo Wikipedia: The Free Encyclopedia. Wikimedia Foundation, Inc. 29 juli 2016. Web. 7 september 2016.

Kuboniwa, H., N. Tjandra, S. Grzesiek, H. Ren, C. B. Klee en A. Bax. &ldquoOplossingsstructuur van calciumvrij calmoduline.&rdquo Natuur Structurele Biologie 2, nee. 9 (september 1995): 768 & ndash76. (VOB-code 1CFD)

Babu, Y. Sudhakar, Charles E. Bugg en William J. Cook. &ldquoStructuur van Calmodulin Verfijnd op 2.2 Å Resolution.&rdquo Tijdschrift voor Moleculaire Biologie 204, nee. 1 (5 november 1988): 191&ndash204. doi:10.1016/0022-2836(88)90608-0. (VOB-code 3CLN)


Abstract

Melatonine is gesuggereerd als een fysiologische antagonist van calmoduline. In dit werk hebben we melatoninebindingsplaatsen gekarakteriseerd in Xenopus laevis oöcyt membranen. Binding van [125I]melatonine door X. laevis eicelmembranen voldoen aan alle criteria voor binding aan een receptorplaats. Binding was afhankelijk van tijd, temperatuur en membraanconcentratie en was stabiel, omkeerbaar, verzadigbaar en specifiek. De bindingsplaats werd ook farmacologisch gekarakteriseerd. Stoichiometrische studies toonden een bindingsplaats met hoge affiniteit met een KNS van 1,18 nM. Deze gegevens komen nauw overeen met gegevens verkregen uit kinetische studies (KNS= 0,12 nM). In competitiestudies hebben we een bindingsplaats met lage affiniteit waargenomen (KNS=63,41 µM). Bovendien werd de bindingsplaats gekarakteriseerd als calmoduline. Binding was dus afhankelijk van calcium en werd op een concentratieafhankelijke manier geblokkeerd door anti-CaM-antilichamen. Calmodulineremmer chloorpromazine remde ook de binding van de tracer. Uit deze resultaten wordt gesuggereerd dat membraangebonden calmoduline werkt als een melatoninebindingsplaats in Xenopus laevis eicellen, waar het cellulaire activiteiten zou kunnen koppelen aan ritmische circulerende niveaus van melatonine. Deze hypothese correleert met de eerdere bevindingen die melatonine beschrijven als een fysiologische antagonist van calmoduline. - Romero, M.P., Garcı'a-Pergan˜eda, A., Guerrero, J.M., Osuna, C. Membraangebonden calmoduline in Xenopus laevis eicellen als nieuwe bindingsplaats voor melatonine. FASEB J. 12, 1401–1408 (1998)

Afkortingen

Melatonine (N-acetyl-5-methoxytryptamine), 2 het belangrijkste endocriene product van de pijnappelklier, speelt een belangrijke rol bij de regulatie van circadiane ritmen en bij veel fysiologische functies bij zoogdieren (1). Dit indoleamine vertoont een circadiaans secretoir ritme dat omgevingsinformatie aan het organisme doorgeeft. Er zijn vier werkingsmechanismen beschreven voor melatonine: binding aan membraanreceptoren (2, 3) en mogelijk aan nucleaire (4, 5) bindingsplaatsen, als opruimer van vrije zuurstofradicalen (6), of binding aan Ca2+-bindende eiwitten zoals calmoduline (Ca2+/CaM) (7) of proteïnekinase C (8).

CaM is een sterk geconserveerd Ca2+-bindend eiwit van 17 kDa dat in alle eukaryote cellen wordt aangetroffen. Het is een multifunctioneel, alomtegenwoordig molecuul (9) dat veel Ca2+-gereguleerde enzymsystemen en cellulaire processen bemiddelt wanneer het wordt gecomplexeerd met dit tweewaardige kation (10-13). Van CaM is aangetoond dat het essentieel is voor de voortgang van de celcyclus in veel eukaryote organismen. Het is dus bekend dat CaM belangrijk is bij het beheersen van de progressie op drie punten in de celcyclus: de initiatie van DNA-synthese (G1/S-grens), de initiatie van mitose (G2/M) en bij de metafase/anafase-overgang van mitose om chromosoomsegregatie en de voltooiing van mitose mogelijk te maken (14). Beschikbare gegevens suggereren dat CaM ook gentranscriptie moduleert via CaM-afhankelijke proteïnekinasen (15), evenals DNA-replicatie door de controle van de activiteiten van DNA-polymerasen (16, 17).

Door Ca2+ geïnduceerde conformatieverandering kan CaM een interactie aangaan met enzymen, peptiden en farmacologische middelen zoals de fenothiazinen. Benítez-King et al. (18) en Antón-Tay et al. (19) hebben aangetoond dat melatonine met hoge affiniteit aan CaM bindt, en dit zou het mechanisme kunnen zijn waardoor melatonine veel intracellulaire Ca2+-functies moduleert, zoals herschikkingen van het cytoskelet (20), cellulaire CaM-niveaus en CaM-afhankelijke fosfodiësterase-activiteit (21) , Ca2+ /Mg2+ ATPase (22), CaM-afhankelijke proteïnekinase II (23) of, zoals eerder gerapporteerd door onze groep, stikstofoxidesynthase-activiteit (24-26). Via CaM kan melatonine de Ca2+-signalering direct beïnvloeden door interactie met doelenzymen zoals adenylaatcyclase en fosfodiësterase, evenals met structurele eiwitten.

De ontwikkeling van 2-[125I]iodomelatonine ([125I]melatonine), een melatoninereceptoragonist met hoge affiniteit, als radioligand heeft het mogelijk gemaakt de distributie en farmacologische kenmerken van melatoninebindingsplaatsen in verschillende weefsels van een aantal soorten (27-29). Het bestaan ​​van een melatoninereceptor in Xenopus laevis dermale melanoforen is welbekend. Het vermogen van het hormoon om melanine-aggregatie in deze cellen te veroorzaken, is een van de vroegst beschreven acties van melatonine (voor een overzicht, zie ref 30). Bovendien, gekweekte Xenopus dermale melanoforen werden onlangs gebruikt om met succes een melatoninereceptor-cDNA met hoge affiniteit te klonen (31).

Hier demonstreren we de aanwezigheid van een bindingsplaats met hoge affiniteit voor melatonine in Xenopus laevis oöcyt membranen. De binding van melatonine aan membranen was afhankelijk van tijd, temperatuur en membraanconcentratie en was stabiel, omkeerbaar, verzadigbaar en specifiek. Bovendien was de binding afhankelijk van calcium en werd de bindingsplaats gekarakteriseerd als calmoduline. Melatoninebinding aan membranen werd geblokkeerd door anti-CaM-antilichamen. Deze resultaten ondersteunen het bewijs van melatonine-specifieke binding aan CaM in biologische systemen en benadrukken het belang van calmoduline als een modulator van hormoonwerking (32).


Doelherkenning door calmoduline: ontleden van de kinetiek en affiniteit van interactie met behulp van korte peptidesequenties

De interactie tussen calmoduline (CaM) en peptide M13, zijn doelbindingssequentie van myosine-lichte-ketenkinase van de skeletspier, omvat voornamelijk twee sets van interacties, tussen de N-terminale doelresiduen en het C-domein van calmoduline, en tussen de C- terminale doelwitresiduen en het N-domein van calmoduline (Ikura M et al., 1992, Wetenschap 256:632-638). Met behulp van korte synthetische peptiden gebaseerd op de twee helften van de doelsequentie, zijn de interacties met calmoduline en zijn afzonderlijke C-domein bestudeerd door middel van fluorescentie- en CD-spectroscopie, calciumbinding en kinetische technieken. Peptide WF10 (residuen 1-10 van M13) bindt aan CaM met KNS ≈︁ 1 μM peptide FW10 (residuen 9-18 van M13, met Phe-17 → Trp-substitutie) bindt aan CaM met KNS ≈︁ 100 uM. Het effect van peptide WF10 op calciumbinding aan calmoduline produceert een bifasische verzadigingscurve, met een duidelijke verbetering van de affiniteit voor de binding van twee calciumionen aan het C-domein, waardoor een stabiel halfverzadigd complex wordt gevormd, Ca2-CaM-peptide, en bevestigt het functionele belang van de interactie van deze sequentie met het C-domein. Stopped-flow studies tonen aan dat de EGTA-geïnduceerde dissociatie van WF10 van Ca4-CaM verloopt via een omkeerbaar relaxatiemechanisme vanuit een kinetische tussentoestand, waarbij ook sprake is van halve verzadiging van CaM, en hetzelfde mechanisme is duidelijk voor het volledige doelpeptide. Interactie van de N-terminale doelwitresiduen met het C-domein is energetisch de belangrijkste component, maar interactie van calmoduline met de hele doelwitsequentie is noodzakelijk om de volledige coöperatieve interactie van de twee aangrenzende elementen van de doelwitsequentie met zowel N- en C-domeinen van calmoduline. De interactie van calmoduline met de M13-sequentie kan dus zowel op structurele als kinetische basis worden ontleed in gedeeltelijke reacties waarbij tussenproducten betrokken zijn die verschillende gebieden van de doelsequentie omvatten. We stellen een algemeen mechanisme voor voor de calciumregulatie van calmoduline-afhankelijke enzymactivering, waarbij een intermediair complex betrokken is dat wordt gevormd door interactie van het calmoduline C-domein en het overeenkomstige deel van de doelsequentie. Deze intermediaire soort kan functioneren om de algehele calciumgevoeligheid van activering te reguleren en om de affiniteit van de calmoduline-doelwitinteractie te bepalen.


Bekijk de video: CAMKII (November 2021).