Informatie

Functioneel verschil tussen de distale promotor en de Enhancer-regio


Volgens het Wikipedia-artikel over eukaryote promotorregio's is de distale promotor:

Alles verder stroomopwaarts (maar geen versterker of ander regulerend gebied waarvan de invloed onafhankelijk is van positie/oriëntatie)

Wat is het verschil tussen het regulerende gebied en de distale promotor? Heeft het distale promotorgebied een groter effect op de transcriptiesnelheid? Zo ja, is de bepaling voor wat een voldoende groot effect heeft om een ​​distale promotor te zijn subjectief?


3D-nucleaire architectuur en epigenetische herinneringen: regulatoren van fenotypische plasticiteit in ontwikkeling, veroudering en kanker

17.2.1 Enhancer-gebruik in 3D en de regulering van celtypespecifieke genexpressie

Enhancer-elementen coördineren input van ontwikkelings- en oncogene routes, evenals signalen van de lokale chromatinestructuur om de waarschijnlijkheid en variabiliteit van transcriptionele bursts op hun doelgenen te reguleren [17-19]. Het moleculaire mechanisme van interacties tussen versterkers en promotors en de determinanten van de celtype- en differentiatiefase-specifieke kenmerken van dit proces worden net opgehelderd. Wereldwijde analyses van chromatinevezelcontacten hebben dus lange-afstands, celtype-specifieke versterker-promotorinteracties in kaart gebracht [16] - wat suggereert dat stochastische chromatinevezelbewegingen en tijdelijke stabilisatie van chromatinevezelinteracties de basis vormen van transcriptionele regulatie. De frequentie van enhancer-promoter-interacties zou daarom de frequentie en/of duur van productieve transcriptie kunnen reguleren en daardoor de variabiliteit van genexpressie in een celpopulatie kunnen moduleren.

Het is bijvoorbeeld aangetoond dat zeldzame, maar functionele interacties tussen regio's op verschillende chromosomen resulteren in gevarieerde genexpressie, wat een selecteerbare functie binnen een celpopulatie oplevert [20]. Daarentegen wordt stabiele, celtype- en differentiatiestadiumspecifieke transcriptie gereguleerd door de convergentie van meerdere versterkerelementen op specifieke, gedeelde doelgenen in cis. Dit patroon zorgt voor een robuuste activatie van de promotor door de lokale concentratie van factoren te verhogen die de assemblage van het pre-initiatiecomplex en het vrijkomen van Pol II van pauzeren bevorderen. Een intrigerende vorm van versterkerspecificiteit wordt geïllustreerd door de zogenaamde faalveilige of gesplitste versterkers die ruimtelijk gescheiden versterkereenheden zijn, die gelijktijdig actief moeten zijn voor de inductie van genexpressie, wat zorgt voor een strakke en specifieke regulatie van genen die oncogeen zouden kunnen worden als gedereguleerd [21] . Ten slotte is clustering van meerdere versterkerelementen die tientallen of honderden kilobasen beslaan, geëvolueerd in de buurt van cellotbepalende genen om hun stabiele expressie en het behoud van cellulaire fenotypes mogelijk te maken [22]. De subeenheden van deze zogenaamde superenhancers werken samen en werken dynamisch samen met elkaar en met andere enhancers om signalen van meerdere cel-lotbepalende routes te integreren die de verschillende individuele enhancer-subeenheden reguleren, wat resulteert in een combinatorische signaaloutput die de waarschijnlijkheid van transcriptie op hun doelgenen [17] .

Vorming en ontmanteling van superenhancers zijn overgevoelig voor fluctuaties in de niveaus van transcriptionele regulatoren en chromatinefactoren, zoals broomdomein met 4 (BRD4) en het Mediator-complex - een essentiële cofactor die het contact tussen enhancer en promoter reguleert, hermodellering van chromatine en afgifte van Pol II uit pauzeren [23] . Activering van de pro-inflammatoire cytokine-tumornecrosefactor (TNF) leidt bijvoorbeeld tot de herverdeling van het Mediator-complex van superversterkers die het lot van de cel specificeren naar versterkers die inflammatoire genen activeren, wat leidt tot de neerwaartse regulatie van genen die de celidentiteit definiëren [23]. Bovendien worden de locatie en de activiteit van superversterkers ook beïnvloed door de cellulaire micro-omgeving van de stamcelniche [24]. Daarom worden de genomische posities van superversterkers omkeerbaar gereorganiseerd in folliculaire stamcellen wanneer ze zich buiten hun stamcelniche lokaliseren tijdens wondgenezing of onder in vitro kweekomstandigheden.

De waarschijnlijkheid van functionele contacten tussen versterkers en promotors wordt gereguleerd door factoren die fungeren als de moleculaire banden van versterker-promoter-interacties [25-28] , en door beperkingen van de mobiliteit van chromatine, die wordt beïnvloed door de 3D-organisatie van de naburige chromatine-context [ 29] . In overeenstemming met de rol van enhancers bij het definiëren van cellulaire toestanden, verslechteren downregulatie van of mutaties in de moleculaire banden van enhancer-promoter-interacties en chromatine-architecturale eiwitten differentiatie [30], gaan de herprogrammering van gedifferentieerde cellen in een geïnduceerde pluripotente toestand tegen [31] en beïnvloeden tumorcelspecifieke genexpressieprogramma's en overleving [32]. Downregulatie van een lid van het cohesinecomplex, een eiwitcomplex dat de contacten tussen versterker en promotor stabiliseert, verstoort bijvoorbeeld de vorming van intrachromosomale lussen in de 4 oktober locus en met het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) [31]. Bovendien is het binden van het zelf-associatiedomein van een lusfactor, lim-domeinbinding 1 (LDB1), aan de β-globinegenpromoter voldoende om een ​​interactie tot stand te brengen met het globine-locuscontrolegebied en om transcriptie-initiatie te induceren in de afwezigheid van de afstammingsspecifieke transcriptiefactor GATA1 [33] . Andere domeinen van het LDB1-eiwit zijn dan nodig voor de daaropvolgende rekrutering van transcriptiefactoren en chromatine-remodelleringsactiviteiten [34] voor een overgang naar productieve verlenging. Bovendien bevordert de leverspecifieke knock-out van LDB1 de ontwikkeling van leverkanker bij muizen die zijn blootgesteld aan kankerverwekkende stoffen [32]. Ten slotte is ook aangetoond dat enhancer-RNA's (eRNA's) die actieve enhancers markeren de vorming van chromatine-lus tussen enhancers en promoters reguleren door de rekrutering en verbetering van de kinase-activiteit van het Mediator-complex dat Pol II-activiteit reguleert en bindt aan chromatine-remodellerende enzymen en transcriptie factoren die nodig zijn voor efficiënte transcriptie [35]. Mutaties in de mediator-subeenheid 12 (MED12) veroorzaken ontwikkelingsdefecten en maken ook een einde aan eRNA-MED12-interacties, wat het belang van eRNA's bij het vormgeven van celtype-specifieke genexpressiepatronen verder ondersteunt.

Afgezien van de moleculaire banden die chromatinecontacten mediëren, beïnvloedt de organisatie van het genoom in topologisch geassocieerde domeinen (TAD's) ook de waarschijnlijkheid van enhancer-promoterinteracties door beperkingen op te leggen voor chromatinebewegingen (zie ook Hoofdstuk 1) [36] . Belangrijk is dat de grenssterkte van TAD's wordt beïnvloed door de aanwezigheid van chromatine-architecturale eiwitten of genoomorganisatoren, zoals de CCCTC-bindende factor (CTCF) [36]. Bepaalde natuurlijk voorkomende sequentievariaties bij mensen en gemanipuleerde mutaties bij muizen die CTCF-binding aan een TAD-grens voorkomen, zijn causaal verbonden met ontwikkelingsdefecten van ledematen als gevolg van de opkomst van ectopische interacties tussen distale versterkers en genen die de ontwikkeling van ledematen reguleren [29]. Omdat CTCF vaak op een methylatiegevoelige manier aan DNA bindt, kunnen TAD-grenzen ook in tumoren opnieuw worden geprogrammeerd als gevolg van de frequente deregulering van DNA-methylatiepatronen. Veranderde TAD-grenzen zouden op hun beurt de mobiliteit van oncogene superversterkers kunnen dereguleren en de stabiliteit van celtype-specifieke genexpressiepatronen kunnen verstoren [7]. Gezien de nauwe link tussen 3D-genoomorganisatie en transcriptie, zal het dus belangrijk zijn om te bepalen hoe 3D-chromatine-overspraak wordt geherprogrammeerd tijdens overgangen tussen verschillende cellulaire toestanden in ontwikkeling en neoplasie.


Toegangsopties

Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

Alle prijzen zijn NET prijzen.
De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

Alle prijzen zijn NET prijzen.


Materialen en methodes

Enhancer-fusiegenen

Enhancer-sequenties van Drosophila werden geamplificeerd uit genomisch DNA door PCR. We gebruikten Expand Long Template of Expand High Fidelity PCR-systemen van Roche Molecular Biochemicals om het aantal sequentieveranderingen dat tijdens amplificatie werd geïntroduceerd te verminderen. PCR-producten werden vervolgens stroomopwaarts van het GFP-gen gekloond in een geschikte kloneringsvector. We gebruikten pPD95.75 en pPD122.53 (de laatste werd gemodificeerd om het nucleaire lokalisatiesignaal te verwijderen) plasmiden, beide vriendelijke geschenken van A. Fire, om respectievelijk translationele en transcriptionele fusies te genereren. Translationele fusiegenen bevatten versterkerelementen, basale promotor en de eerste paar codons van de Drosophila gen gefuseerd met GFP. In transcriptionele fusies was het enhancer-element het enige segment van vliegen-DNA dat stroomopwaarts van het minimale werd geplaatst pes-10 promotor van C. elegans, waarvan niet eerder werd gemeld dat het alleen een expressiepatroon produceerde. De identiteit van elk construct werd geverifieerd door restrictiedigestie en DNA-sequentiebepaling werd bereid uit meerdere onafhankelijke isolaten en een mengsel werd gebruikt voor injecties. Identieke procedures werden gebruikt bij het bereiden van fusiegenen die vermeende versterkers bevatten van C. briggsae. Nucleotidesequenties van enhancer-elementen, locatie van individuele primers en de gebruikte vectoren worden gegeven in Fig. S1.

Wormstammen, injecties en microscopie

Fusiegenen werden geïnjecteerd volgens standaardprotocollen (Mello et al., 1991) in Bristol N2 of pha-1 (e2123) dieren. Enhancer-bevattende fusiegenen werden altijd geïnjecteerd met 50 ng/μl wanneer pha-1 (e2123) wormen werden gebruikt, deze werden mede geïnjecteerd met a pha-1 reddingsconstructie (Granato et al., 1994) bij 2 ng/μl. Injectiemethoden die worden gebruikt voor: C. briggsae (AF16) waren identiek aan die gebruikt voor C. elegans N2. Meerdere onafhankelijke lijnen werden onderzocht op consistentie van expressiepatronen. We hebben vastgesteld dat fusiegenen geïnjecteerd in pha-1(e2123) en N2-dieren produceren identieke expressiepatronen. We merkten dat dieren uit een aantal transgene lijnen diffuse expressie in de darm vertoonden, voornamelijk in de meest voorste en achterste compartimenten, het PVT-neuron, dat een uitsteeksel heeft zoals beschreven door Aurelio et al. (Aurelio et al., 2002), niet White et al. (White et al., 1986), en in verschillende spiercellen van de keelholte (Fig. 1E). We hebben dit patroon van niet-specifieke expressie waargenomen voor een aantal fusiegenen, waaronder alleen pPD95.75- en pPD122.53-vectoren, in zowel de N2- als de pha-1(e2123) genetische achtergronden. We beschouwen het daarom als het 'achtergrond'-patroon dat is geassocieerd met de GFP-transgenexpressie in de worm die waarschijnlijk wordt veroorzaakt door de promiscue transcriptionele controle in deze weefsels en/of een cryptisch versterkerelement in vector-DNA. Af en toe werd deze 'achtergrond'-expressie ook waargenomen in vulvaspieren en drie rectale epitheelcellen. Alle dieren werden aanvankelijk geëvalueerd onder een dissectiemicroscoop en later in detail onderzocht op een samengestelde Zeiss Axioplan-microscoopbeelden werden vastgelegd met het Open Lab-softwarepakket en verwerkt met Adobe Photoshop.

Expressiepatronen van fusiegenen die weefselspecifieke versterkers van Drosophila in C. elegans. (EEN) Drosophila Gad1::GFPwordt uitgedrukt gliacellen (gl) in het hoofd. (B) Drosophila Cha::GFP wordt uitgedrukt in gliacellen van labiale neuronen (gl) en verschillende faryngeale spiercellen (pha). (C) Drosophila unc-119::GFP wordt uitgedrukt in gliacellen van labiale neuronen (gl), en verschillende dorsale (dhn) en ventrale (vhn) hoofdneuronen evenals in staartneuronen (tn). (NS) Drosophila ey::GFP wordt uitgedrukt in IL1D (L, R) en PVT. (E) Drosophila eya::GFP wordt uitgedrukt in PVT, in de darm en bepaalde spiercellen van de keelholte. (F) Drosophila nompA::GFP komt tot uiting in het hoofd hypoderm (hyp) en in verschillende amphid neuronen (amf). (G) Drosophila Mef2::GFP wordt uitgedrukt in de keelholte (pha) en in een enkele interneuron AVG. (H) Drosophila vooravond::GFP wordt uitgedrukt in maximaal zes gliale (gl) cellen van labiale neuronen.

Expressiepatronen van fusiegenen die weefselspecifieke versterkers van Drosophila in C. elegans. (EEN) Drosophila Gad1::GFPwordt uitgedrukt gliacellen (gl) in het hoofd. (B) Drosophila Cha::GFP wordt uitgedrukt in gliacellen van labiale neuronen (gl) en verschillende faryngeale spiercellen (pha). (C) Drosophila unc-119::GFP wordt uitgedrukt in gliacellen van labiale neuronen (gl), en verschillende dorsale (dhn) en ventrale (vhn) hoofdneuronen evenals in staartneuronen (tn). (NS) Drosophila ey::GFP wordt uitgedrukt in IL1D (L, R) en PVT. (E) Drosophila eya::GFP wordt uitgedrukt in PVT, in de darm en bepaalde spiercellen van de keelholte. (F) Drosophila nompA::GFP komt tot uiting in het hoofd hypoderm (hyp) en in verschillende amphid neuronen (amf). (G) Drosophila Mef2::GFP wordt uitgedrukt in de keelholte (pha) en in een enkele interneuron AVG. (H) Drosophila vooravond::GFP wordt uitgedrukt in maximaal zes gliale (gl) cellen van labiale neuronen.


Unit 4 Mastering Biologie Quiz 7

Acetylering van histonstaarten in chromatine geeft toegang tot DNA voor transcriptie.

Sommige vormen van chromatine-modificatie kunnen worden doorgegeven aan toekomstige generaties cellen.

Methylering van histonstaarten in chromatine kan condensatie van het chromatine bevorderen.

Acetylering van histonstaarten is een omkeerbaar proces.

Een van de mechanismen waarmee eukaryoten genexpressie reguleren, is door modificaties van de chromatinestructuur. Wanneer chromatine wordt gecondenseerd, is DNA niet toegankelijk voor transcriptie. Acetylering van histonstaarten vermindert de aantrekkingskracht tussen naburige nucleosomen, waardoor chromatine een lossere structuur aanneemt en toegang tot het DNA voor transcriptie mogelijk maakt. Als de histonstaarten deacetylering ondergaan, kan chromatine opnieuw condenseren, waardoor DNA opnieuw ontoegankelijk wordt voor transcriptie.

Recent bewijs suggereert dat methylering van histonstaarten ofwel de condensatie ofwel de decondensatie van chromatine kan bevorderen, afhankelijk van waar de methylgroepen zich op de histonen bevinden. Dus methylering kan transcriptie inactiveren of activeren, en demethylering kan het effect van methylering omkeren.


Materialen en methodes

Fylogenetische voetafdruk en sequentieanalyse

Sequentiebepaling en analyse van de IIb-genlocus van mens en muis werden uitgevoerd zoals eerder beschreven.8,23 Gegenereerde sequenties werden ingediend bij de openbare database van GenBank op www.ncbi.nih.gov, en omvatten de volgende toegangsnummers: AF170316, AF169829, AF160252 en AF489555. Deze originele sequentiebestanden gebruiken samen met zowel complete als onvolledige BAC-genomische sequentiebestanden die beschikbaar zijn bij GenBank (toegangsnummers: AC007722, AC003043, AC025326, een muizenchromosoom 11 BAC-kloon-RP11-621L13) en Celera-databases (steigernummer: GA_x5J8B7W82RK: 6500001.6874571 a gedeeltelijk volledige mαIIb locus scaffold), hebben we samengestelde sequenties samengesteld van zowel de menselijke als de muizensequenties, die voor elk een sequentiedomein van 200 kb omvatten. Deze bestanden werden vervolgens gebruikt voor een homologievergelijking van orthologe regio's met behulp van het nucleotidesequentievergelijkingsprogramma, Visual Tools for Alignment (VISTA/AVID [www-gds.lbl.gov/vista]). De lengte van de vergelijking was ingesteld op 100 bp met een minimum van 50% overeenkomst. Specifieke regio's binnen de 200 kb-regio werden vergeleken met behulp van de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).24 Specifieke subregio's werden ook vergeleken met de openbare Expressed Sequence Tag (EST)-database op www.ncbi.nih.govusing BLAST. Een subregio van 10 kb die zich uitstrekt van +7,8 kb binnen het αIIb 3′-intergene domein werd ook geanalyseerd met behulp van GeneMachine-genvoorspellingssoftware die beschikbaar is op //genome.nhgri.nih.gov/genemachine. Dit programma stelt gebruikers in staat om meerdere exon- en genvoorspellingsprogramma's op een geautomatiseerde manier te bevragen en omvat ook BLAST-analyse bij het beoordelen van definitieve voorspellingen. Bovendien werd het Transcript Assembly Program (TAP), beschikbaar op //sapiens.wustl.edu/∼zkan/TAP/, gebruikt om genstructuren af ​​te bakenen met behulp van genomisch uitgelijnde EST-sequenties. Analyse van uitgelijnde geconserveerde sequentiegebieden voor consensus transcriptiefactor-bindingsplaatsen, werd gedaan met behulp van zowel het rVISTA-programma (www.gds.lbl.gov/vista) als de Transcription Element Search Software (TESS) ontwikkeld door de Universiteit van Pennsylvania (PENN) Computational Biology Informatics Laboratory (http://www.cbil.upenn.edu/).

DNase I HS-onderzoeken

Humane erythroleukemie (HEL) en Children's Hospital Research Foundation (CHRF) 288-11-cellen waren de 2 megakaryocytische cellijnen die αIIb tot expressie brengen25,26 die in deze DNase I HS-plaatsstudies werden gebruikt. De fibroblastlijn HeLa27 en de maagcarcinoomcellijn SNU-128 werden bestudeerd als lijnen die geen αIIb tot expressie brengen. HEL-, HeLa- en SNU-1-cellen werden verkregen van American Type Culture Collection (Rockville, MD). CHRF-cellen werden verkregen van Dr. Michael Liebman (University of Cincinnati, OH). HEL-, SNU-1- en HeLa-cellen werden gekweekt in RPMI 1640, 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine en 1-glutamine (Invitrogen, Carlsbad, CA). CHRF-cellen werden gekweekt zoals hierboven maar met 20% FBS. Alle cellijnen werden 24 uur voor elk DNase I HS-experiment gesplitst. Bereiding van celkernen voor behandeling met DNase I was zoals eerder beschreven.29 Kernen van 1 x 108 cellen werden gedurende 10 minuten bij 500G en werden gesuspendeerd in 4,5 ml DNase I-buffer (10 mM Tris [tris(hydroxymethyl)aminomethaan], pH 7,5, 10 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 5 mM natriumbutyraat en 1 mM CaCl2). Porties van 500 L kernen werden toegevoegd aan 500 L DNase I-buffer die DNase I-enzym (Invitrogen) bevat, variërend van 0 tot 3,4 g/ml. De buizen werden voorzichtig gemengd, vervolgens 5 minuten bij 37°C geplaatst en daarna weer op ijs teruggeplaatst. Genomisch DNA werd teruggevonden en verder verteerd met ofwel EcoRI ofBamHI-restrictie-enzymen voor Southern-blot-analyse zoals eerder beschreven.29,30 De probes die voor detectie werden gebruikt, werden geproduceerd via amplificatie met polymerasekettingreactie (PCR). Primers die werden gebruikt om deze probes te genereren, waren de volgende sense/antisense-paren: αIIb exon 1 (P1)7: 5′-CCTGTGGAGGAATCTGAA-3′/5′-TCCTGCTCTCTCCCAATAC-3′ αIIb exon 4 (P2)7: 5′-CAATCGGGGGCAGGGACAC-3′/5′-CAAGCCGTCGCGAGTGGG-3′ en αIIb exon 30 (P3)7: 5'-GAGTACAGTGGGCTTCATGTTCT-3'/5'-CCCTGGCAGTGACTCTCTCGTTCA-3'. Een eerder beschreven genomische λ-kloon met de hαIIb-locus diende als sjabloon voor de reacties

Transgene constructies

De SalIk fragment gebruikt om de . te maken2.5hαIIb transgene dierlijnen werden geïsoleerd uit een λDash (Stratagene, La Jolla, CA) bacteriofaagkloon gesubkloneerd uit P1 (kloon nr. 1147), een hαIIb-bevattende P1-kloon die eerder is beschreven.23 Dit construct strekt zich uit van de λDash-vectorpolylinker SalI-plaats door 2,5 kb van het 5'-flankerende gebied, 17,35 kb coderende exon/intron-sequentie en 2,2 kb van de 3'-flankerende sequentie tot aan de 3'-polylinkerSalI-site en heeft een totale lengte van 22 052 bp. DeEcocamper/AflII restrictiefragment gebruikt om de . te maken7.1hαIIb transgene dierlijnen werden geïsoleerd uit een hylb pWE15 cosmide-kloon. Dit fragment strekt zich uit van een vector pWE15 polylinker EcoRV-plaats via 7,1 kb van het 5'-flankerende gebied tot 2,1 kb stroomafwaarts van het hαIIb-genstopcodon, eindigend op een endogeen AflII-site met een totale lengte van 26 559 bp. Het laatste transgene construct3′+hαIIb is een Ecocamper/PvuI-restrictiefragment, afgeleid van dezelfde cosmide-kloon die hierboven is beschreven. Het is identiek aan de 7.1hαIIbconstruct, behalve dat het 3'-flankerende gebied 5,2 kb langer is, zich uitstrekkend tot een polylinker PvuI-plaats in pWE15 met een totale lengte van 31 759 bp.

Generatie en initiële analyse van transgene dieren

Transgene muizen werden gegenereerd door pronucleaire injecties volgens standaardmethoden bij de PENN Transgenic Mice Core Facility. Positieve grondleggerdieren werden gedetecteerd door polymerasekettingreactie (PCR)-analyse van genomisch DNA van de staart met behulp van meerdere mensspecifieke primerparen voor hαIIb.7 Genomische PF4-primers van muizen22 werden als controle gebruikt. Deze sense/antisense-primerparen waren als volgt: hαIIb-exon 14: 5′-AGGCTCTCTGTCCAGCTAC-3′/5′-GCCATTCCAGCCTCCGTG-3′ enmPF4: 5′-GTCCAGTGGCACCCTCTTGA-3′/5′-AATTGACATTTAGGCAGC-3′.

Positieve stamlijnen met intacte hylb-genen door Southern- en PCR-analyse werden verder gekarakteriseerd op kopieaantal door Southern-blot. Genomisch DNA van de staart werd verteerd met EcoRI en grootte gescheiden op een 0,8% (wt/vol) agarosegel. De procedures voor het bepalen van de Southern-blot en het aantal kopieën waren zoals eerder beschreven

Weefsel en bloedplaatjes RT-PCR-analyse

RNA-isolatie en reverse transcriptase (RT)-PCR-procedures voor alle mRNA-expressieanalyses, evenals een lijst van de 11 onderzochte weefsels, zijn eerder beschreven in onze eerdere transgene onderzoeken.22 1 μg RNA van andere weefsels, RT-PCR werd uitgevoerd met behulp van de SuperScript II Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen) met de volgende sets sense/antisense-primerparen:hαIIb7: 5′-AGGCTCTCTGTCCAGCTAC-3′/5′-G CCATTCCAGCCTCCGTG-3′mαIIb8: 5′-TCAAGACTCCCTGAATCCAACAC-3′/5′-GGGCTCCTCCAGTCTCTTCT-3′mPBP22: 5′-GCCTGCCCACTTCATAACCTC-3′/ 5′-GGGTCCAGGCACGTTTTT-3′mPF422: 5′-GTCCATGTGGCACCCTCTTGA-3′/5′-AATTGACATTTAGGCAGCTGA-3′mHPRT31: 5′-CACAGGACTAGAACACCTGC-3′/5′-GCTGGTGAAAAGGACCTCT-3′mKIAA05538: 5′-GACCCAAAGGTGCTTGTAAT-3′/5′-GAAAAACTACCTCCAGGATGG-3′.

Controle-experimenten omvatten onderzoeken waarbij geen RT werd toegevoegd en andere die werden behandeld met RNase A (Sigma, St. Louis, MO) voorafgaand aan de RT-stap, werden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de in de experimenten waargenomen PCR-banden niet werden gegenereerd via pre-RT-bronnen van DNA .22 Er werden ook controle-experimenten gedaan om te controleren op genomische DNA-contaminatie waarbij het RNA werd behandeld met DNase I (Invitrogen), zoals eerder beschreven.22 De kwantificeringsresultaten van met DNase I behandelde versus met DNase I onbehandelde monsters varieerden niet significant, vandaar, alle hieronder gepresenteerde RT-PCR-gegevens gebruikten onbehandelde RNA-monsters.

Om het niveau van hαIIb-transgen-mRNA-expressie in bloedplaatjes ten opzichte van endogeen mαIIb te kwantificeren, hebben we eerder beschreven methoden gebruikt. waarbij beide genen zich in hun lineaire amplificatiebereik bevonden. Antisense-primers waren 5'-gelabeld met een fluorescerende kleurstof "Cy-5" (Oligos Etc, Wilsonville, OR). Er werden voorbereidende experimenten uitgevoerd om het detecteerbare lineaire bereik van amplificatie voor het natieve m-IIb-gen en het h-IIb-transgen voor elke stamvader te bepalen. Daarna werd een PCR-mengsel van 100 L verdeeld in zes aliquots van 15 L, één voor elke cyclus die 3 cycli onder het middelpunt van het detecteerbare lineaire bereik begon en zich uitstrekte tot 2 cycli daarboven, voordat de PCR werd gestart. PCR werd uitgevoerd bij 94°C gedurende 2 minuten, gevolgd door cycli bij 94°C gedurende 25 seconden, 62°C gedurende 36 seconden, 72°C gedurende 55 seconden in een PTC-100 Programmable Thermal Controller (MJ Research, Waltham, MA ). Voor elke opeenvolgende verandering van een enkele cyclus werd een van de PCR-buisjes voor hαIIb- en mαIIb-reacties uit de thermocycler verwijderd en op ijs geplaatst. Alle monsters werden vervolgens gelopen op een 12-putjes 10% acrylamide Ready Gel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), en banden werden gedetecteerd met een STORM-beeldvormingssysteem roodlichtlaser (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). De gedetecteerde banden werden vervolgens geanalyseerd met behulp van ImageQuant PhosphorImager-software (Molecular Dynamics).22 De log van de signaalintensiteit van elke band werd berekend. Het verschil in logwaarde voor elke band tussen 2 opeenvolgende cycli werd berekend, waarbij het verwachte logverschil 0,3 eenheden was (log102). Die waarden, die binnen een bereik van 0,2- tot 0,4-log verschileenheden/cyclus vielen, werden beschouwd als binnen het lineaire bereik van amplificatie. De onbewerkte signaalintensiteit van die menselijke PCR-banden binnen het lineaire bereik werd genormaliseerd naar die van het muisproduct, ook binnen het lineaire bereik in dezelfde cyclus. De signalen werden verder genormaliseerd voor verschillen in het vermogen van de primer/PCR-omstandigheden om hαIIb en . te amplificeren mαIIb van gelijke molaire hoeveelheden van de geschikte cDNA-controlematrijs zoals eerder beschreven. Deze genormaliseerde waarden werden gebruikt om het transgenexpressieniveau tussen de verschillende grondleggers te vergelijken.

Eiwitdetectie

Bloedplaatjesrijk plasma (PRP) uit bloed van mensen en muizen werd geïsoleerd zoals beschreven.22 Voor deze onderzoeken werd prostaglandine E1 (Sigma) werd toegevoegd tot een eindconcentratie van 1 M voordat de bloedplaatjes bij 800 . werden afgedraaidG gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De pellets werden tweemaal gewassen in bloedplaatjesbuffer (PB 134 mM NaCl, 3 mM KCl, 0,3 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES [N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethaansulfonzuur], 5 mM glucose, 0,1% NaHCO3, pH 6,5) plus 1 mM EGTA (ethyleenglycoltetraazijnzuur) en geresuspendeerd in PB zonder EGTA. De bloedplaatjes werden gelyseerd door tweemaal in te vriezen en te ontdooien. De eiwitconcentratie van elk lysaat werd bepaald door de Pierce BCA Protein Assay-kit volgens de instructies van de fabrikant (Pierce, Rockford, IL). Twintig microgram van het totale bloedplaatjeseiwit werd geëlektroforeerd op een 4% tot 12% gradiënt natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en gekleurd met Coomassie-blauw. Een duplicaat SDS-PAGE-gel werd overgebracht naar een polyvinylideendifluoride (PVDF) Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, Bedford, MA). Het hαIIb-eiwit werd gedetecteerd met behulp van MAB1990 (Chemicon, Temecula, CA), een monoklonaal anti-hαIIb-antilichaam van muizen. Western-blot-signalen werden gevisualiseerd door fosfobeeldvorming van het verbeterde chemiluminescentiesignaal (Perkin-Elmer, Wellesley, MA) op de STORM en gekwantificeerd met behulp van Imagequant PhosphorImager-software. Voor flowcytometrische onderzoeken werden 1 x 107 wildtype en transgene muizenbloedplaatjes en menselijke bloedplaatjes bereid zoals eerder beschreven,32 met behulp van het monoklonale MAB1990-antilichaam32 als het primaire antilichaam en een met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) gelabeld, geiten-antimuis-IgG (Sigma) als het secundaire antilichaam.


Conclusies

Door de sequentie van promotors van weefselspecifieke genen te analyseren, hebben we bevestigd dat weefselspecifieke promotors en versterkers TF-bindingsmotieven delen binnen de loci van hun verwante genen. Bovendien hebben we waargenomen dat regulerende informatie in de promotors van weefselspecifieke genen voorspellend is voor de versterkers die zich op deze genen richten. Voor 73/79 weefsels konden we op betrouwbare wijze onderscheid maken tussen sterk en laag tot expressie gebrachte genen uitsluitend gebaseerd op de aanwezigheid of afwezigheid van vermeende motieven (AUC ≥60%). Hoewel recent vergelijkbare cut-offs zijn gebruikt (bijvoorbeeld [18, 59]), erkennen we dat de helft van de modellen met bescheiden prestaties (AUC ≤80%) een beperkte voorspellende waarde kan hebben. Het is echter belangrijk op te merken dat de gerapporteerde AUC's de ondergrens van de nauwkeurigheid van de classificatie vertegenwoordigen vanwege het feit dat de sterkte van het weefselspecificiteitsversterkersignaal naar verwachting zal variëren tussen de promotors van weefselspecifieke genen. Promoters die alleen zwakke signalen bevatten, zullen inherent de AUC-schattingen van de classificatie verlagen. Om de prestaties van de classifiers bij het voorspellen van weefselspecifieke versterkers verder aan te pakken, hebben we een panel van onafhankelijke computationele en experimentele tests geïntroduceerd, die uiteindelijk onze analyse hebben gevalideerd. Van veel van de TF's die binden aan de motieven die zijn geïdentificeerd als relevant voor elk van deze modellen, is bekend dat ze een fundamentele rol spelen bij de ontwikkeling of het behoud van de normale functie van de overeenkomstige weefsels. We toonden aan dat de motieven die in promotorregio's worden gevonden, kunnen worden gebruikt om enhancers met overeenkomende weefselspecificiteit te voorspellen. De nauwkeurigheid van onze weefselspecifieke voorspellingen van versterkers door op promotor gebaseerde modellen wordt ondersteund door een zeer significante associatie van voorspellingen van versterkers met de genen die het meest tot expressie worden gebracht in een bepaald weefsel, en door een significante overlap van voorspellingen met experimenteel geïdentificeerde weefselspecifieke versterkers.

Belangrijker was dat 58% (7/12) van de voorspellingen van leverversterkers gegenereerd door het promotor-gebaseerde model luciferase-expressie in de lever veroorzaakte na hydrodynamische staartaderinjectie bij muizen, terwijl geen van de vijf negatieve controles dat deed.

Zes van de zeven gevalideerde leverversterkers bevonden zich in introns (voor de genen TBX6, SERINC2, TF, ARAP1, STARD10, en GPRC5C), terwijl de resterende voorspelling in de directe omgeving van GPRC5C. Van deze genen is eerder gemeld dat ze matig tot sterk tot expressie komen in lever en galblaas [60]. Hoewel bijvoorbeeld de specifieke functie van GPRC5C is onbekend, het gen wordt sterk tot expressie gebracht in de lever en er is gesuggereerd dat het een rol speelt bij het signaleren van gebeurtenissen wanneer het wordt geïnduceerd door retinoïnezuur [61]. Naast andere motieven bevatten leverversterkervoorspellingen die luciferase-activiteit vertoonden voorspelde bindingsplaatsen voor 5 tot 11 van de 27 bekende lever-TF's (aanvullend bestand 5). Hoewel elk van de kritische lever-TF's PPARA, PPARG, NR2F2 en HNF4A bindingsplaatsen had in 6/7 (86%) sequenties, had geen enkele TF een bindingsplaats in alle 7 sequenties die luciferase-activiteit vertoonden, wat het vermogen van onze methode benadrukt. om flexibele encryptie van regelgevende sequenties te modelleren. Elk van de 7 sequenties omvatte op zijn beurt bindingsplaatsen voor ten minste 2 van deze 4 TF's en 4/7 (57%) voor alle 4. De 5 leverversterkervoorspellingen die geen significante luciferase-activiteit vertoonden, bevatten bindingsplaatsen voor 4 tot 8 van de 27 bekende lever-TF's. HNF4A had bindingsplaatsen in alle 5 sequenties, PPARA en NR2F2 hadden bindingsplaatsen in 4/5 (80%) sequenties en PPARG in 3/5 (60%). Op één uitzondering na bevatte elk van de sequenties bindingsplaatsen voor ten minste 2 van deze 4 TF's en 3/5 (60%) voor alle 4. Ter vergelijking: 87% van alle sequenties die werden gescoord door het op leverpromotor gebaseerde model bevatte 1 tot 18 van de 27 bekende lever-TF's. HNF4A had bindingsplaatsen in 28% van de sequenties. Slechts 11% van de sequenties had bindingsplaatsen voor ten minste twee TF's onder PPARA, PPARG, NR2F2 en HNF4A, en 7% voor alle vier TF's. Ondanks beperkingen in de nauwkeurigheid van de voorspellingen van de TF-bindingsplaats en ondanks het feit dat veel motieven niet-functioneel kunnen zijn [62], suggereren onze resultaten dat bepaalde combinaties van TF's, in plaats van enkele TF's, nodig zijn om levertranscriptie vast te stellen. Bovendien kan de functie van geteste sequenties onderhevig zijn aan activering of remming door aanvullende cis- en trans-regelgevende elementen. Enhancer-activiteit kan bijvoorbeeld worden geïnduceerd door hormonen of medicijnen onder bepaalde omstandigheden [63] of afhankelijk zijn van aangrenzende functionele elementen die afwezig zijn in het construct dat voor het experiment wordt gebruikt. Dit en andere fenomenen zouden kunnen leiden tot fout-negatieve waarnemingen in de reporter-assays. In elk geval bieden de hier gepresenteerde experimentele gegevens onafhankelijke en robuuste validatie van de voorspellingen van de versterker die zijn verkregen met de op promotor gebaseerde modellen, en bieden ze verdere ondersteuning voor de hypothese dat de specificiteit van interacties tussen versterkers en promotors ten minste gedeeltelijk te wijten is aan de binding van weefselspecifieke TF's.

Onze modellen voorspellen meerdere weefselspecifieke versterkers per locus en per weefsel, evenals meerdere weefsels of activiteitsdomeinen voor de meeste versterkers. This redundancy, which has long been reported (for example, [64–66]), may serve to increase the robustness of the regulatory network [67]. Furthermore, it is likely that apparently redundant enhancers activate gene expression in different cell types and/or under different developmental stages or conditions [68–71]. The genomic distribution of enhancers is also likely to vary depending on the function of their target genes. For example, the loci of transcription factors and developmental genes are known to contain particularly high densities of CNEs, many of which act as distal enhancers [72–77]. More recently, advances in technical approaches, such as chromosome conformation capture and its derivatives, have confirmed these findings independent of sequence conservation [24, 78]. We observed that relatively long loci, such as those of genes expressed in brain tissues, featured more enhancer predictions per locus compared to short loci. However, some compact loci, such as those of genes highly expressed in liver, lung, and heart, contained a relatively large number of enhancer predictions, providing evidence for a particular need for fine-tuning the expression level in these tissues. Furthermore, the level of conservation of enhancer sequences is likely to depend, as other studies suggests (for example, [79, 80]), on their particularly activity, although we found that, for all models, a large proportion of the enhancer predictions is likely to be conserved across mammals.

Finally, our results add further evidence for a significant role of both promoters and enhancers in determining tissue specificity. This role is supported by several examples from the literature [14, 81, 82]. Different enhancer-promoter preferences would provide an additional level of transcriptional control, assisting in establishing the favorable interactions, for instance, between enhancers and their cognate promoters when they are distant, or between enhancers and their cognate promoters within a gene cluster. The intimate coordination of promoters and enhancers in regulating tissue-specific transcription has immediate practical consequences. It makes it possible to describe the complex regulatory landscape of higher eukaryotes, and eventually identify regulatory elements located hundreds of kilobases away from their target gene, based solely on the analysis of proximal regulatory elements. DNA microarrays and, more recently, RNA-seq are currently being used to profile the transcriptomes of a diverse range of cell/tissue types, conditions, and species. As more expression data become available, particularly in the context of large projects such as ENCODE [83] and the 1000 Genome Project [84], it is our belief that the application of approaches such as the one we are proposing here will result in important new insights and improve our understanding of transcriptional regulation. Such projects are also generating a wealth of epigenetics information that can be easily integrated with our models to reveal genomic signatures controlling transcription.


NamiRNAs colocalize with enhancers and eRNAs

Proposed eRNA and NamiRNA dual gene activation model

eRNAs and NamiRNAs work simultaneously to activate target genes in this proposed model. Chromatin looping and high alteration of chromatin structure before replication proximate target genes and enhancers of both NamiRNA and eRNA, inducing an interaction between the enhancers and genes of eRNAs and NamiRNA. NamiRNAs target the enhancer promoters and subsequently activate them, leading to the transcription of eRNAs [3]. NamiRNA forms a complex with nAGO2 and Pol II and activates markers such as H3K27ac, H3K4me3, and H3K4me1 at active enhancers [18, 19]. The enhancer’s activation is recognized by Pol II, which then transcribes eRNAs [3] (Fig. 5). The eRNAs interacting with CBP and p300 [23] elevate chromatin accessibility for TFs via acetylating histones H3 and H4 at the gene promoter [84]. These activities of eRNAs alter enhancer features such as H3K27ac and DNase hypersensitivity and the binding of TFs [85]. For example, knockdown of eRNAs at their respective enhancer and target-promoter areas decreases H3K27ac but increases H3K27me3 levels [43]. These enhance features at genes’ promoter and attract NamiRNAs. The attracted NamiRNAs overlap within the enhancer markers and form a complex with nAGO2 and recruits p300, catalyzing H3K27ac at the promoter region and activating it (Fig. 5). These predict an interactive eRNA-NamiRNA, starting and improving target genes on the same or different chromosomes during chromatin looping [10, 17]. Transcribed eRNAs may orchestrate miRNA expression since eRNAs can solely regulate gene expression [73].

The proposed model of eRNAs and NamiRNAs cooperatively enhancing and activating target genes. NamiRNAs form a complex with AGO2 and p300 they bind to enhancers and activate markers such as H3K27ac and H3K27me3, which attract RNA polymerase to recognize and translate the enhancer. Transcribed RNAs bind to p300 and other proteins to activate enhancer features at the target gene’s promoters. The attracted NamiRNAs then attach to the gene’s promoter and subsequently activate the target gene’s expression

ERNAs and NamiRNAs located on different chromosomes may interact during their activities

NamiRNAs and eRNAs located on different chromosomes may interact and perform similar functions. For example, miR-17 from miR-17HG interacts with NET1e, an eRNA transcribed from a close enhancer of the NET1 gene to induce drug resistance (Table 2). Overexpressed miR-17 knocks down PTEN (its target tumor suppressor), activating other downstream cellular components such as AKT and hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) [86]. Similarly, NET1e interacts with the NET1 to form subsequent resistance to induced compounds and drugs, hence worsening cell survival and increasing tumor growth [87]. And overexpressing NET1e caused drug resistance to the PI3K inhibitor and BCL-2 inhibitor in MCF7 cells via PI3k-Akt pathways [87]. It can be speculated that NET1e can function similarly to miR-17 since both exhibit Akt pathways during their drug resistance activities, indicating an interaction between them (Fig. 6a).

Proposed eRNA and NamiRNA interaction in drug resistance (een) and breast cancer tumorigenesis (B). During drug resistance, overexpressed miR-17 represses PTEN leading to the activation of the PI3K-Akt pathway and HIF-1α. Simultaneously, Net1e increases the expression of NET1 while inhibiting the PI3K inhibitor and BCL-2. NET1 and NET1e interact with miR-17 via the PI3K-Akt pathway to inhibit apoptosis and increase tumor growth, while NET1 causes induced drug resistance (een). In breast cancer, fibroblast growth factor receptor 2 interacts with NET1e, the Estrogen receptor (ER), to regulate BRCA and other cancer genes, which are targets of miR-200b

429. These trigger an interaction between miR-200b

429, ER, NET1e, and ER-associated genes leading to tumor suppression, increased proliferation, and inhibited apoptosis in breast cancer cells

Moreover, NamiRNAs and eRNAs contribute to cancer drug resistance through enhanced drug efflux, altered drug metabolism, and enhanced anti-apoptosis pathways [88]. In tumor suppression and apoptosis, eRNAs originating from p53-bound enhancer regions (p53BERs) are required for p53-dependent cell-cycle arrest NamiRNA miR-17–92 suppresses chromatin regulatory genes (Sin3b, Hbp1, Suv420h1, and Btg1) and the apoptosis regulator (Bim) via similar TFs (such as AGO2 and FOXA1) to regulate cell survival and autonomous proliferation [89]. Another example of eRNA-NamiRNA dual interaction is the proposed model of Net1e and miR-200b

429 in breast cancer. The miR-200b

429 gene produces miR-200b eRNAs from an enhancer located approximately 5.1 kb upstream [90]. miR-200b

429 targets BRCA associated proteins and orchestrates their expression in cancer. Moreover, fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) interacts with NET1e and the estrogen receptor (ER) ER associates with BRCA and other cancer genes that are targets of miR-200b

429. These connect miR-200b

429, miR-200b eRNA, NET1e, and ER-associated genes, leading to breast cancer regulation by controlling tumor suppression, proliferation, and apoptosis (Fig. 6b). The activities and expression of these RNAs can be a predictive factor in monitoring the expression of genes associated with the eRNAs mentioned above in breast cancer. These observations demonstrate that chromatin looping aids the interaction between eRNAs and NamiRNAs, which associates and works hand in hand to regulate cellular activities.

ERNA and NamiRNA action in disease diagnosis

Recently, SEs, enhancers, and eRNAs have been used as factors for analyzing, mapping, and studying a broad range of conditions, including autoimmunity [103], cancer [101], and muscle-related disease such as muscular dystrophies [104]. About 80% of genes in the canonical cancer signaling pathways are associated with specific eRNAs [87] and NamiRNAs in at least one cancer type. A genome-wide association study found eRNAs or SEs near known genetic variants for autoimmune disease risk in autoimmune disease patients, hence serving as biomarkers [103], which makes disease diagnostics easy [22, 109].

Moreover, eRNAs and NamiRNAs explore autophagy, apoptosis, and signaling pathways to regulate diseases. For instance, overexpression of the NamiRNA miR-378/378 enhances autophagy and represses apoptosis by targeting caspase 9, while the opposite reduces autophagy and accumulates abnormal mitochondria, and enhances apoptosis. These miRNAs target the rapamycin (mTOR)/unc-51-like autophagy activating kinase 1 pathway to inhibit apoptosis, and target phosphoinositide-dependent protein kinase 1 to maintain autophagy via Forkhead box class O (FoxO)-mediated transcriptional reinforcement [97]. Alternatively, the knockdown of growth-regulating estrogen receptor binding 1 (GREB1) eRNA enhances apoptosis and represses proliferation in bladder cancer [105]. These small RNA molecules, i.e., NamiRNA and eRNA, are predicted to contribute to cancer drug resistance through enhanced drug efflux, altered drug metabolism, overexpression of target molecules, and enhanced survival anti-apoptosis pathways [88]. Subsequent downregulation of NamiRNAs miR-34, miR-17, and let-7a is associated with sensitivity to drugs commonly used as cancer treatments.

ERNA and NamiRNA activities in therapeutics

NamiRNA and eRNA are the next options in diagnosing, treating, and studying the pathogenesis of diseases that are not associated with current biomarkers [106]. People can exploit these biomarkers regarding the dysregulation of genes and mRNAs in myopathy and other disorders. Concerning this effort, the USA FDA approved its first siRNA drug (patisiran infusion) in 2018 to treat peripheral nerve disease caused by hereditary transthyretin-mediated amyloidosis [107]. Moreover, the drug’s therapeutic mechanism is based on silencing the RNA that causes the disease. eRNAs are now known to play roles in diseases such as myopathy hence eRNA-targeted therapy [108] may be the next option. However, the environmental conditions or manipulation affects the expression and activities of NamiRNAs and eRNAs in diseases. Likewise, epigenetic factors also regulate eRNAs and NamiRNAs. For instance, epigenetic silencing of cell or tissue-specific eRNAs or NamiRNAs (e.g., miR-495 [96], Epstein–Barr virus super-enhancer eRNAs [109], and miR-335 [110]) can induce proliferation. Table 2 presents some diseases and therapeutics involving both eRNA and NamiRNA.


Human DNA methylation data as measured by bisulfite sequencing or Illumina 450k array available for 15 cell lines was obtained from SALK and ENCODE databases. The regulatory regions predicted from chromatin marks were downloaded from ENCODE database [35]. Gene expression data by RNA-Seq, available in 4 cell lines, was imported from SALK database [16]. RPKM (Reads per kilo base per million) values was used for transcripts' expression [36]. Transcription factor binding is based on ChiP-seq or computational predictions [23, 35]. Gene annotation from UCSC Genome database was used [37].

CpG sites in the study

The methylation level of a CpG site was measured as the ratio of the number of methylated cytosines to the total number of sequences on that position in the bisulfite sequencing data. To take into account only the sites with reliable measurement, we only consider the CpG sites covered with more than 4 sequences.

Random region selection

Only the mCpGs in the coding regions and the upstream regions of genes were considered, where the upstream region of a gene was defined as the 10 kb region upstream of the gene transcription start site (TSS). The immediate downstream gene was classified as the target gene for those identified mCpGs. To exclude the effect of differential methylation due to different genomic regions, we selected random regions with similar genomic positions as mCpG sites. For a regulatory region in the upstream region, we selected the corresponding random regions with the same relative distance to the TSS (Figure 7A). Here the relative distance to the TSS was measured as the actual distance normalized by the total length of the coding region and the upstream region of the gene. For a regulatory region in an exon or an intron region, we selected the corresponding random regions with the same relative distance to the nearest boundary of the exon or intron of the target gene. Here the relative distance was normalized by the length of the exon or intron, depending on whether the region of interest is on exon or intron (Figure 7B). 1000 random region selections for each regulatory region were performed in this study.


Bekijk de video: teori fungsional (December 2021).