Informatie

Kan de eiwitstructuur worden bepaald door röntgendiffractie in een enkel beeld?


Ik lees over het gebruik van röntgenkristallografie om de eiwitstructuur te bepalen. Volgens mijn boek worden gegevens verzameld onder 30-360 hoeken (afhankelijk van de symmetrie van het eiwit). Een illustratie wordt gegeven met concentrische ringen gelabeld met afstanden - hoe verder de punten weg zijn, hoe hoger de resolutie.

Is de afbeelding een composiet (waarbij de hoek van het puntpunt vanuit het midden gelijk is aan de hoek van de aflezing) of is er een afzonderlijke afbeelding gemaakt bij elke hoek? Zijn er nog andere redenen waarom er meer afbeeldingen nodig zouden zijn?

Bedankt.


Je kunt een structuur niet oplossen met een enkel frame, zelfs niet met perfecte diffractie.

De reden dat je afbeeldingen nodig hebt over een groot aantal hoeken, is omdat het diffractiepatroon ook in drie dimensies is, in de zogenaamde "reciprocale ruimte". Er is minimaal een rotatie van 180° van het kristal nodig om de hele reciproke ruimtebol met het detectievlak te vegen, hoewel symmetrie in de kristalstructuur dit verder kan verminderen (sommige van mijn eiwitten hadden slechts 90° nodig, ik denk dat hexagonale eenheidscellen met 6-voudige symmetrie kan leven met 30°). Omdat kristallen echte dingen zijn (lees: niet ideaal, dubbel zo voor eiwitkristallen), wordt de sweep uitgebreid om wat redundantie te krijgen.


Waarschijnlijk niet. Hoewel men uitstekende diffractiegegevens kan krijgen van een kristal van hoge kwaliteit, zou het buitengewoon moeilijk zijn om het faseprobleem op te lossen. De extra hoeken helpen de oplossingen te beperken.


Niet door een enkel eiwit te analyseren. Er wordt gewerkt met röntgenlasers.

Je moet een gelijktijdige afbeelding maken van miljoenen eiwitten en dat gebruiken om een ​​structuur te krijgen. Het is niet helemaal primetime. Dat doen mensen ook met elektronenbundels in elektronenmicroscopen.

Deze methoden zullen 3D-modellen van de moleculen reconstrueren, soms in toestanden die niet met kristallografie kunnen worden verkregen. Voorbeelden zijn de structuur van het kernporiëncomplex van vele megadalton en de f-actinevezel. De klassieke studie is een 3D-model van bacteriorodopsine, de eerste membraaneiwitstructuur die een moleculaire resolutie had (dit was echter een kristallijn monster).

Hoewel het in principe veel eenvoudiger klinkt - neem een ​​puur monster van je eiwit, of complex en bevries het en zap het met een röntgen- of elektronenstraal, het is veel meer werk om het beeld te reconstrueren en kan net zo lang of langer duren dan een röntgenstructuur krijgen. De resolutie is meestal ook slecht omdat het kristal de coherentie zal versterken, dat wil zeggen dat alle eiwitten op dezelfde manier zijn uitgelijnd en bijna dezelfde 3D-vorm in een kristal hebben.


Kan de eiwitstructuur worden bepaald door röntgendiffractie in een enkel beeld?

Ja. Met behulp van een techniek die Laue-diffractie wordt genoemd, is het mogelijk om voldoende gegevens uit een enkel beeld te verkrijgen om een ​​eiwitkristalstructuur op te lossen. Een voorbeeld is de in de tijd opgeloste studie van het dissociëren van carbonmonoxymyoglobine door fotolyse (DOI: 10.1107/S090904959501661X). Dit is niet de standaardtechniek met één golflengte die gewoonlijk wordt gebruikt, maar maakt gebruik van "witte" röntgenstralen met een reeks golflengten die alleen beschikbaar zijn bij synchrotronstralen. De gebruikersfaciliteit van BioCARS biedt bijvoorbeeld infrastructuur voor tijdsopgeloste kristallografie. Het wordt ook gebruikt in "diffractie vóór vernietiging" bij het werken met vrije elektronenlasers, zie bijvoorbeeld Nature Methods 8, pagina 283 (2011).

De rest van het antwoord gaat over conventionele kristallografie met één golflengte.

Is de afbeelding een composiet (waarbij de hoek van het puntpunt vanuit het midden gelijk is aan de hoek van de aflezing) of is het een afzonderlijke afbeelding die onder elke hoek is genomen

De gewenste structurele informatie (3D-elektronendichtheid in de reële ruimte) is een Fourier-transformatie van de diffractiegegevens (3D-reciproke ruimte). Het woord "beeld" is jargon voor een enkel diffractiebeeld, d.w.z. de diffractievlekken die u waarneemt wanneer u een röntgenstraal in een bepaalde richting op een kristal richt. Als u een andere oriëntatie gebruikt, krijgt u meer gegevens (en meet u ook enkele plekken meerdere keren).

Zijn er nog andere redenen waarom er meer afbeeldingen nodig zouden zijn?

Hoe meer diffractiebeelden worden verzameld, hoe hoger de volledigheid en redundantie van de gegevens. Volledigheid verwijst naar het hebben van elke diffractieplek minstens één keer gemeten. Redundantie verwijst naar hoe vaak een plek gemiddeld is gemeten, en toenemende redundantie verhoogt de kwaliteit van de meting door middeling.


Kan de eiwitstructuur worden bepaald door röntgendiffractie in een enkel beeld? - Biologie

Momentopname van experimentele gegevens

wwPDB-validatie   3D-rapport Volledig rapport

De eerste eiwitkristalstructuur bepaald op basis van röntgenpoederdiffractiegegevens met hoge resolutie: een variant van T3R3 humaan insuline-zinkcomplex geproduceerd door malen.

(2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr56: 1549-1553

  • PubMed: 11092920  Zoeken op PubMed
  • DOI: 10.1107/s0907444900013901
  • Primaire bronvermelding van gerelateerde structuren:  
    1FU2, 1FUB
  • PubMed Samenvatting: 

Röntgendiffractieanalyse van eiwitstructuur wordt vaak beperkt door de beschikbaarheid van geschikte kristallen. De afwezigheid van eenkristallen hoeft echter geen onoverkomelijk obstakel te zijn bij eiwitkristallografie, net zo min als in de materiaalkunde, waar poederdiffractietechnieken zich zo hebben ontwikkeld dat complexe oxide-, zeoliet- en kleine organische moleculaire structuren vaak uit poeder kunnen worden opgelost. gegevens alleen.

Röntgendiffractieanalyse van eiwitstructuur wordt vaak beperkt door de beschikbaarheid van geschikte kristallen. De afwezigheid van eenkristallen hoeft echter geen onoverkomelijk obstakel te zijn bij eiwitkristallografie, net zo min als in de materiaalkunde, waar poederdiffractietechnieken zich zo hebben ontwikkeld dat complexe oxide-, zeoliet- en kleine organische moleculaire structuren vaak uit poeder kunnen worden opgelost. gegevens alleen. Hier wordt dat feit aangetoond met de structuuroplossing en verfijning van een nieuwe variant van het T(3)R(3) Zn-humaan insulinecomplex, geproduceerd door mechanisch malen van een polykristallijn monster. Synchrotron-röntgenpoederdiffractiegegevens met hoge resolutie werden gebruikt om deze kristalstructuur op te lossen door moleculaire vervanging aangepast voor Rietveld-verfijning. Een volledige Rietveld-verfijning van het eiwit met 1630 atomen werd bereikt door 7981 stereochemische beperkingen te combineren met een poederdiffractiepatroon van 4800 stappen (d(min) = 3,24 A) en leverde de residuen R(wp) = 3,73%, R(p) = 2,84%, R(F)(2) = 8,25%. Er werd vastgesteld dat de door malen veroorzaakte faseverandering gepaard gaat met rotaties van 9,5 en 17,2 graden van de twee T(3)R(3)-complexen waaruit de kristalstructuur bestaat. Het materiaal keert na 2-3 d terug om de oorspronkelijke T(3)R(3)-kristalstructuur te herstellen. Een Rietveld-verfijning van dit 815-atoomeiwit door 3886 stereochemische beperkingen te combineren met een poederdiffractiepatroon van 6000 stappen (d(min) = 3,06 A) leverde de residuen op R(wp) = 3,46%, R(p) = 2,64%, R(F)(2) = 7,10%. Het aangetoonde vermogen om een ​​eiwitkristalstructuur op te lossen en te verfijnen uit poederdiffractiegegevens suggereert dat deze benadering bijvoorbeeld kan worden gebruikt om structurele veranderingen te onderzoeken in een reeks eiwitderivaten waarvan de structuur van één lid bekend is van een enkelkristal studie.


ORIGINEEL ONDERZOEK artikel

Emma V. Beale 1† , David G. Waterman 2,3*† , Corey Hecksel 4† , Jason van Rooyen 4 , James B. Gilchrist 4 , James M. Parkhurst 1 , Felix de Haas 5 , Bart Buijsse 5 , Gwyndaf Evans 1* en Peijun Zhang 4,6,7*
  • 1 Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, Didcot, Verenigd Koninkrijk
  • 2 STFC Rutherford Appleton Laboratory, Didcot, Verenigd Koninkrijk
  • 3 CCP4, onderzoekscomplex in Harwell, Rutherford Appleton Laboratory, Didcot, Verenigd Koninkrijk
  • 4 Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, Didcot, Verenigd Koninkrijk
  • 5 Materialen en structurele analyse, Thermo Fisher Scientific, Eindhoven, Nederland
  • 6 Afdeling Structurele Biologie, Wellcome Centre for Human Genetics, University of Oxford, Oxford, Verenigd Koninkrijk
  • 7 Afdeling Structurele Biologie, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, Verenigde Staten

MicroED is onlangs naar voren gekomen als een krachtige methode voor de analyse van biologische structuren met atomaire resolutie. Deze techniek is grotendeels beperkt tot eiwit nanokristallen die groeien als naalden of platen van slechts een paar honderd nanometer dik. Bovendien maakt traditionele microED-gegevensverwerking gebruik van gevestigde röntgenkristallografiesoftware die niet is geoptimaliseerd voor het verwerken van samengestelde effecten die uniek zijn voor elektronendiffractiegegevens. Hier presenteren we een geïntegreerde workflow voor microED, van monstervoorbereiding door cryo-gerichte ionenbundelfrezen, via gegevensverzameling met een standaard Ceta-D-detector, tot gegevensverwerking met behulp van de DIALS-softwaresuite, waardoor routinematige bepaling van de atomaire structuur van eiwitkristallen mogelijk wordt. van elke grootte en vorm met behulp van microED. We demonstreren de effectiviteit van de workflow door de structuur van proteïnase K te bepalen tot een resolutie van 2,0 Å en laten het voordeel zien van het gebruik van eiwitkristallamellen ten opzichte van nanokristallen.


De vorm van een eiwit wordt bepaald door zijn aminozuursequentie

Bedenk uit hoofdstuk 2 dat er 20 soorten aminozuren in eiwitten zitten, elk met verschillende chemische eigenschappen. Een eiwitmolecuul wordt gemaakt van een lange keten van deze aminozuren, elk gekoppeld aan zijn buur via een covalente peptidebinding (Figuur 3-1). Eiwitten worden daarom ook wel polypeptiden. Elk type eiwit heeft een unieke volgorde van aminozuren, precies hetzelfde van het ene molecuul tot het andere. Er zijn vele duizenden verschillende eiwitten bekend, elk met zijn eigen specifieke aminozuurvolgorde.

Afbeelding 3-1

Een peptidebinding. Deze covalente binding wordt gevormd wanneer het koolstofatoom van de carboxylgroep van één aminozuur elektronen deelt met het stikstofatoom (blauw) uit de aminogroep van een tweede aminozuur. Zoals aangegeven gaat bij deze condensatie een molecuul water verloren (meer.)

De zich herhalende sequentie van atomen langs de kern van de polypeptideketen wordt de polypeptideruggengraat genoemd. Aan deze zich herhalende keten zijn die delen van de aminozuren gehecht die niet betrokken zijn bij het maken van een peptidebinding en die elk aminozuur zijn unieke eigenschappen geven: de 20 verschillende aminozuurzijketens (Figuur 3-2). Sommige van deze zijketens zijn niet-polair en hydrofoob (“watervrezend”), andere zijn negatief of positief geladen, sommige zijn reactief, enzovoort. Hun atomaire structuren worden weergegeven in deelvenster 3-1 en een korte lijst met afkortingen wordt gegeven in figuur 3-3.

Afbeelding 3-2

De structurele componenten van een eiwit. Een eiwit bestaat uit een ruggengraat van een polypeptide met aangehechte zijketens. Elk type eiwit verschilt in volgorde en aantal aminozuren, daarom is het de volgorde van de chemisch verschillende zijketens (meer.)

Paneel 3-1

De 20 aminozuren die in eiwitten worden gevonden.

Afbeelding 3-3

De 20 aminozuren die in eiwitten worden gevonden. Zowel drieletterige als eenletterige afkortingen worden vermeld. Zoals getoond, zijn er gelijke aantallen polaire en niet-polaire zijketens. Voor hun atomaire structuren, zie Paneel 3-1 (pp. 132�).

Zoals besproken in hoofdstuk 2 gedragen atomen zich bijna alsof ze harde bollen zijn met een bepaalde straal (hun van der Waals straal). De eis dat geen twee atomen elkaar overlappen, beperkt de mogelijke bindingshoeken in een polypeptideketen in hoge mate (Figuur 3-4). Deze beperking en andere sterische interacties beperken de verscheidenheid aan driedimensionale rangschikkingen van atomen (of conformaties) die mogelijk zijn. Toch kan een lange flexibele keten, zoals een eiwit, zich op enorm veel manieren vouwen.

Afbeelding 3-4

Sterische beperkingen op de bindingshoeken in een polypeptideketen. (A) Elk aminozuur draagt ​​drie bindingen bij (rood) naar de ruggengraat van de keten. De peptidebinding is vlak (grijze schaduw) en laat geen rotatie toe. Daarentegen kan rotatie optreden over (meer.)

Het vouwen van een eiwitketen wordt echter verder beperkt door veel verschillende sets van zwakke niet-covalente bindingen die zich vormen tussen het ene deel van de keten en het andere. Deze omvatten atomen in de ruggengraat van het polypeptide, evenals atomen in de zijketens van aminozuren. De zwakke bindingen zijn van drie soorten: waterstofbruggen, Ionische bindingen, en van der Waals attracties, zoals uitgelegd in hoofdstuk 2 (zie p. 57). Individuele niet-covalente bindingen zijn 30� keer zwakker dan de typische covalente bindingen die biologische moleculen creëren. Maar veel zwakke bindingen kunnen parallel werken om twee regio's van een polypeptideketen stevig bij elkaar te houden. De stabiliteit van elke gevouwen vorm wordt daarom bepaald door de gecombineerde sterkte van grote aantallen van dergelijke niet-covalente bindingen (Figuur 3-5).

Afbeelding 3-5

Drie soorten niet-covalente bindingen die eiwitten helpen vouwen. Hoewel een enkele van deze bindingen vrij zwak is, vormen veel van hen vaak samen om een ​​sterke binding te creëren, zoals in het getoonde voorbeeld. Net als in de vorige afbeelding wordt R gebruikt als een algemene (meer.)

Een vierde zwakke kracht speelt ook een centrale rol bij het bepalen van de vorm van een eiwit. Zoals beschreven in hoofdstuk 2, hebben hydrofobe moleculen, inclusief de niet-polaire zijketens van bepaalde aminozuren, de neiging om in een waterige omgeving samengeperst te worden om hun verstorende effect op het waterstofgebonden netwerk van watermoleculen te minimaliseren (zie p. 58 en Paneel 2-2, blz. 112�). Daarom is een belangrijke factor die de vouwing van een eiwit bepaalt, de verdeling van de polaire en niet-polaire aminozuren. De niet-polaire (hydrofobe) zijketens in een eiwit dat tot aminozuren als fenylalanine, leucine, valine en tryptofaan behoort, hebben de neiging om te clusteren in het binnenste van het molecuul (net zoals hydrofobe oliedruppels samensmelten in water om één grote druppel te vormen) . Hierdoor kunnen ze contact met het water dat hen in een cel omringt, vermijden. Daarentegen hebben polaire zijketens, zoals die van arginine, glutamine en histidine, de neiging om zich aan de buitenkant van het molecuul te rangschikken, waar ze waterstofbruggen kunnen vormen met water en met andere polaire moleculen (Figuur 3-6). Wanneer polaire aminozuren in het eiwit worden begraven, zijn ze gewoonlijk waterstofgebonden aan andere polaire aminozuren of aan de ruggengraat van het polypeptide (Figuur 3-7).

Afbeelding 3-6

Hoe een eiwit vouwt tot een compacte conformatie. De polaire aminozuurzijketens hebben de neiging zich aan de buitenkant van het eiwit te verzamelen, waar ze kunnen interageren met water. De niet-polaire aminozuurzijketens zijn aan de binnenkant begraven om een ​​dicht opeengepakt hydrofoob (meer.)

Afbeelding 3-7

Waterstofbindingen in een eiwitmolecuul. Grote aantallen waterstofbruggen vormen zich tussen aangrenzende gebieden van de gevouwen polypeptideketen en helpen de driedimensionale vorm ervan te stabiliseren. Het afgebeelde eiwit is een deel van het enzym lysozym, en de waterstof (meer.)


Kan de eiwitstructuur worden bepaald door röntgendiffractie in een enkel beeld? - Biologie

1 Om een ​​voorbeeld te noemen: uitgaande van een eenheidscel met 100'8197' assen in een goed geordend eiwitkristal en een voorkeursminimumafstand van vijf pixels tussen aangrenzende Bragg-pieken, is de maximaal haalbare resolutie voor een enkele quad ongeveer 3,5'8197& #197 als de directe straal gecentreerd is op de detector. Voor hetzelfde kristal zou het betegelen van vier quads, zoals hier gepresenteerd, de maximale resolutie waarmee Bragg-vlekken kunnen worden geïdentificeerd, verhogen tot voorbij 1,0 Å, opnieuw uitgaande van een centrale directe straal.

Dankbetuigingen

We danken Wolfgang Kabsch voor een programma om te corrigeren voor elliptische vervormingen en voor discussies over gegevensverwerking. Wij danken Kay Diederichs en Sven Hovm'246ller voor de discussies over gegevensverwerking. We danken Henning Stahlberg en Kenneth Goldie voor hun steun en discussies. Wij danken Rishi Matadeen, Sacha de Carlo, Thorsten Blum en Igor Nederlof voor hulp bij monstervoorbereiding en data-acquisitie. We danken Robbie Joosten en Garib Murshudov voor de discussies over modelverfijning. Wij danken ASI (Amsterdam Scientific Instruments) voor ondersteuning met detectoren, uitlezing en software. Wij danken Jan Visser en Bas van der Heijden (NIKHEF, Amsterdam) voor vroege ondersteuning, ontwerp en testen.

Referenties

Abrahams, J.P. (1993). Jnt CCP4/ESF'8211EACBM Newsl. Eiwit Kristallogr. 28 , 39󈞕. Google geleerde
Arndt, A.W. 'Wonacott, A.J. (1977). De rotatiemethode in kristallografie. Amsterdam: Noord-Holland. Google geleerde
Broennimann, C., Eikenberry, EF, Henrich, B., Horisberger, R., Huelsen, G., Pohl, E., Schmitt, B., Schulze-Briese, C., Suzuki, M., Tomizaki, T. , Toyokawa, H. 'Wagner, A. (2006). J. Synchrotron Rad. 13 , 120�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Brø252nger, A.T. (1997). Methoden Enzymol. 277 , 366�. CrossRef PubMed CAS Web of Science Google Scholar
Cowley, JM & Moodie, A.F. (1957). Acta Cryst. 10 , 609�. CrossRef IUCr-tijdschriften Web of Science Google Scholar
Cowtan, K. (2006). Acta Cryst. NS 62 , 1002�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Cruz, MJ de la, Hattne, J., Shi, D., Seidler, P., Rodriguez, J., Reyes, FE, Sawaya, MR, Cascio, D., Weiss, SC, Kim, SK, Hinck, CS , Hinck, AP, Calero, G., Eisenberg, D. & Gonen, T. (2017). Natuurmethoden , 14 , 399�. Web of Science PubMed Google Scholar
Cusack, S., Belrhali, H., Bram, A., Burghammer, M., Perrakis, A. Riekel, C. (1998). Natuur structuur. Biol. 5 , 634�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Dauter, Z. (1999). Acta Cryst. NS 55 , 1703�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
De la Mora, E., Carmichael, I. Garman, E.F. (2011). J. Synchrotron Rad. 18 , 346'8211357. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Diederichs, K. & Karplus, P.A. (1997). Natuur structuur. Biol. 4 , 269�. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google Scholar
Diederichs, K. & Karplus, P.A. (2013). Acta Cryst. NS 69 , 1215�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Dorset, D.L. (1995). Structurele elektronenkristallografie. New York: Plenum Press. Google geleerde
Dorset, D.L., Tivol, W.F. & Turner, J.N. (1992). Acta Cryst. EEN 48 , 562�. CrossRef Web of Science IUCr-tijdschriften Google Scholar
Emsley, P., Lohkamp, ​​B., Scott, W.G. & Cowtan, K. (2010). Acta Cryst. NS 66 , 486�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Evans, P. (2006). Acta Cryst. NS 62 , 72󈞾. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Evans, P.R. & Murshudov, G. N. (2013). Acta Cryst. NS 69 , 1204�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Faruqi, A.R. & McMullan, G. (2011). Q. Rev. Biophys. 44 , 357�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Gemmi, M., Galanis, A.S., Karavassili, F., Das, P.P., Calamiotou, M., Gantis, A., Kollia, M., Margiolaki, I. Nicolopoulos, S. (2013). Microsc. Anaal. 27 , 24󈞉. Google geleerde
Genderen, E. van (2015). Doctoraal proefschrift. Universiteit Leiden, Nederland. https://openaccess.leidenuniv.nl/handle/1887/36598. Google geleerde
Genderen, E. van, Clabbers, MTB, Das, PP, Stewart, A., Nederlof, I., Barentsen, KC, Portillo, Q., Pannu, NS, Nicolopoulos, S., Gruene, T. & Abrahams , JP (2016). Acta Cryst. EEN 72 , 236�. Web of Science CSD CrossRef IUCr Journals Google Scholar
Georgieva, D.G., Jansen, J., Sikharulidze, I., Jiang, L., Zandbergen, H.W. & Abrahams, J.P. (2011). J. Instrument. 6 , C01033. Web of Science CrossRef Google Scholar
Georgieva, D.G., Kuil, M.E., Oosterkamp, ​​T.H., Zandbergen, H.W. & Abrahams, J.P. (2007). Acta Cryst. NS 63 , 564�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Glaeser, R.M. 'Downing, K.H. (1993). Ultramicroscopie , 52 , 478�. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google Scholar
Gonen, T., Cheng, Y., Sliz, P., Hiroaki, Y., Fujiyoshi, Y., Harrison, SC & Walz, T. (2005). Natuur (Londen) , 438 , 633�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Gorelik, T.E., van de Streek, J., Kilbinger, A.F.M., Brunklaus, G. & Kolb, U. (2012). Acta Cryst. B 68 , 171�. Web of Science CSD CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Gruene, T., Sheldrick, G.M., Zlatopolskiy, B.D., Kozhushkov, S.I. de Meijere, A. (2014). Z. Natuurforsch. B , 69 , 945�. Web of Science CSD CrossRef CAS Google Scholar
Guo, P., Shin, J., Greenaway, AG, Min, JG, Su, J., Choi, HJ, Liu, L., Cox, PA, Hong, SB, Wright, PA & Zou, X. (2015). Natuur (Londen) , 524 , 74󈞺. Web of Science CSD CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Hasegawa, K., Hirata, K., Shimizu, T., Shimizu, N., Hikima, T., Baba, S., Kumasaka, T. 'Yamamoto, M. (2009). J. Appl. kristal. 42 , 1165�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Hattne, J., Reyes, F.E., Nannenga, B.L., Shi, D., de la Cruz, M.J., Leslie, A.G.W. & Gonen, T. (2015). Acta Cryst. EEN 71 , 353�. Web of Science CrossRef IUCr-tijdschriften Google Scholar
Hattne, J., Shi, D., de la Cruz, M.J., Reyes, F.E. Gonen, T. (2016). J. Appl. kristal. 49 , 1029�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Henderson, R. (1995). Q. Rev. Biophys. 28 , 171�. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google Scholar
Jansen, J., Tang, D., Zandbergen, H.W. Schenk, H. (1998). Acta Cryst. EEN 54 , 91�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Johnson, I., Bergamaschi, A., Buitenhuis, J., Dinapoli, R., Greiffenberg, D., Henrich, B., Ikonen, T., Meier, G., Menzel, A., Mozzanica, A., Radicci, V., Satapathy, DK, Schmitt, B. & Shi, X. (2012). J. Synchrotron Rad. 19 , 1001�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Joosten, R.P., Long, F., Murshudov, G.N. 'Perrakis, A. (2014). IUCrJ , 1 , 213�. Web of Science CrossRef CAS PubMed IUCr Journals Google Scholar
Kabsch, W. (2010). Acta Cryst. NS 66 , 125�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Kleywegt, G.J. (1996). Acta Cryst. NS 52 , 842�. CrossRef CAS Web of Science IUCr-tijdschriften Google Scholar
Kolb, U., Gorelik, T.E., Kübel, C., Otten, M.T. Hubert, D. (2007). Ultramicroscopie , 107 , 507�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Kolb, U., Gorelik, T.E., Mugnaioli, E. & Stewart, A. (2010). Polym. ds. 50 , 385�. Web of Science CrossRef CAS Google Scholar
Kolb, U., Gorelik, T.E. 'Otten, M.T. (2008). Ultramicroscopie , 108 , 763�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Llopart, X., Ballabriga, R., Campbell, M., Tlustos, L. 'Wong, W. (2007). nucl. Instrument. Methoden Fys. Onderzoek EEN , 581 , 485�. Web of Science CrossRef CAS Google Scholar
Llopart, X., Campbell, M., Dinapoli, R., San Segundo, D. 'Pernigotti, E. (2002). IEEE Trans. nucl. Wetenschap. 49 , 2279�. Web of Science CrossRef Google Scholar
Luebben, J. & Gruene, T. (2015). Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS , 112 , 8999�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C. Lees, R.J. (2007). J. Appl. kristal. 40 , 658�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
McMullan, G., Cattermole, D.M., Chen, S., Henderson, R., Llopart, X., Summerfield, C., Tlustos, L. & Faruqi, A.R. (2007). Ultramicroscopie , 107 , 401�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
McMullan, G., Chen, S., Henderson, R. & Faruqi, A.R. (2009). Ultramicroscopie , 109 , 1126�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Mugnaioli, E., Gorelik, TE & Kolb, U. (2009). Ultramicroscopie , 109 , 758'8211765. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Murshudov, G.N., Skub'225k, P., Lebedev, A.A., Pannu, N.S., Steiner, R.A., Nicholls, R.A., Winn, M.D., Long, F. & Vagin, A.A. (2011). Acta Cryst. NS 67 , 355'8211367. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Nannenga, B.L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F.E. Gonen, T. (2014). Elife , 3 , e03600. Web of Science CrossRef PubMed Google Scholar
Nannenga, B.L., Shi, D., Leslie, A.G.W. & Gonen, T. (2014). Natuurmethoden , 11 , 927�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Nederlof, I., van Genderen, E., Li, Y.-W. & Abrahams, J.P. (2013). Acta Cryst. NS 69 , 1223�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Owen, R.L., Rudiño-Piñera, E. & Garman, E.F. (2006). Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS , 103 , 4912�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Palatinus, L., Brázda, P., Boullay, P., Perez, O., Klementov'225, M., Petit, S., Eigner, V., Zaarour, M. & Mintova, S. (2017). Wetenschap , 355 , 166�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Palatinus, L., Corr'234a, CA, Steciuk, G., Jacob, D., Roussel, P., Boullay, P., Klementov'225, M., Gemmi, M., Kope'269ek, J., Domeneghetti, MC, C'225mara, F. '38 Pet'345'237'269ek, V. (2015). Acta Cryst. B 71 , 740'8211751. Web of Science CrossRef IUCr-tijdschriften Google Scholar
Palatinus, L., Pet'345'237'269ek, V. '38 Corr'234a, C.A. (2015). Acta Cryst. EEN 71 , 235�. Web of Science CrossRef IUCr-tijdschriften Google Scholar
Raunser, S. 'Walz, T. (2009). Ann. Rev. Biophys. 38 , 89�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Rodriguez, JA & Gonen, T. (2016). Methoden Enzymol. 579 , 369�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Sharma, P., Verma, N., Singh, PK, Korpole, S. Ashish (2016). Wetenschap. Rep. 6 , 22475. Google Scholar
Shi, D., Nannenga, B.L., Iadanza, M.G. & Gonen, T. (2013). Elife , 2 , e01345. Web of Science CrossRef PubMed Google Scholar
Stahlberg, H., Biyani, N. Engel, A. (2015). Boog. Biochem. Biofysica. 581 , 68󈞹. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Stevenson, H.P. et al. (2014). Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS , 111 , 8470�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Stevenson, H.P. et al. (2016). Acta Cryst. NS 72 , 603�. Web of Science CrossRef IUCr-tijdschriften Google Scholar
Subramanian, G., Basu, S., Liu, H., Zuo, JM & Spence, JCH (2015). Ultramicroscopie , 148 , 87󈟉. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Unwin, PNT & Henderson, R. (1975). J. Mol. Biol. 94 , 425�. CrossRef PubMed CAS Web of Science Google Scholar
Vainshtein, BK (1964). Structuuranalyse door elektronendiffractie . Oxford: Pergamon. Google geleerde
Vincent, R. & Midgley, P.A. (1994). Ultramicroscopie , 53 , 271�. CrossRef CAS Web of Science Google Scholar
Visser, J., van der Heijden, B., Weijers, S.J.A., de Vries, R. & Visschers, J.L. (2011). nucl. Instrument. Methoden Fys. Onderzoek EEN , 633 , S22–S25. Web of Science CrossRef CAS Google Scholar
Wan, W., Zon, J., Su, J., Hovm'246ller, S. 'Zou, X. (2013). J. Appl. kristal. 46 , 1863�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Weirich, T.E., Ramlau, R., Simon, A., Hovm'246ller, S. 'Zou, X. (1996). Natuur (Londen) , 382 , 144�. CrossRef CAS Web of Science Google Scholar
Weirich, T.E., Zou, X.D., Ramlau, R., Simon, A., Cascarano, G.L., Giacovazzo, C. & Hovmöller, S. (2000). Acta Cryst. EEN 56 , 29󈞏. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Winn, M.D. et al. (2011). Acta Cryst. NS 67 , 235�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Tijdschriften Google Scholar
Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M. & Toyoshima, C. (2015). Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS , 112 , 3368�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Yun, Y., Zou, X., Hovmöller, S. & Wan, W. (2015). IUCrJ , 2 , 267�. Web of Science CrossRef CAS PubMed IUCr Journals Google Scholar
Zhang, D., Oleynikov, P., Hovm'246ller, S. 'Zou, X. (2010). Z. Kristallogr. 225 , 94�. Web of Science CrossRef CAS Google Scholar
Zou, X., Hovm'246ller, S. 'Oleynikov, P. (2011). Electron Crystallo­grafie . Oxford Universiteit krant. Google geleerde

Dit is een open-access artikel dat wordt gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution (CC-BY)-licentie, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie in elk medium toestaat, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteurs en bron worden vermeld.


Structurele biologie omvat technieken en principes van moleculaire biologie, biochemie en biofysica als middel om de moleculaire structuur en dynamiek van biologisch relevante moleculen op te helderen. Recente vooruitgang in instrumentatie heeft een nieuwe impuls gegeven aan de structurele biologie, aangezien complexe biologische moleculen nu met ongekend gemak en efficiëntie kunnen worden geanalyseerd. De driedimensionale structuur van eiwitten en eiwitcomplexen biedt geweldige inzichten in de wetten van het leven en de mechanismen van ziekten, en maakt daardoor een rationeel ontwerp van nieuwe diagnostische en therapeutische middelen mogelijk. Er zijn drie belangrijke onderzoekstechnieken voor structurele biologie: monokristallijne röntgendiffractie (SC-XRD), nucleaire magnetische resonantie (NMR) en cryo-elektronenmicroscopie (Cryo-EM). Er is echter geen methode voor alle doeleinden, aangezien ze alle drie unieke voordelen en beperkingen bieden.

Figuur 1. Drie belangrijke onderzoekstechnieken voor structurele biologie. Volgens de statistieken van PDB (https://www.rcsb.org/), meer dan 120.000 eiwitstructuren opgelost door SC-XRD, goed voor bijna 90% van het totaal. En er zijn ongeveer 12.000 eiwitstructuren verkregen door NMR. Hoewel het totale aantal door Cryo-EM opgeloste eiwitstructuren niet vergelijkbaar is met dat van de eerste twee technieken, is de explosieve groei van structuren uit deze techniek de laatste jaren opmerkelijk.

Röntgenkristallografie maakt gebruik van röntgenstraling om de positie en rangschikking van atomen in een kristal te bepalen. De meest klassieke methode van röntgenkristallografie is eenkristalröntgendiffractie, waarbij kristalatomen ervoor zorgen dat de invallende röntgenbundel verstrooide bundels produceert. Wanneer de verstrooide bundels op de detector landen, produceren deze bundels een spikkeldiffractiepatroon. Terwijl het kristal geleidelijk wordt geroteerd, kunnen de hoek en intensiteit van deze afgebogen bundels worden gemeten, en vervolgens wordt een driedimensionaal beeld van de elektronendichtheid in het kristal gegenereerd. Op basis van deze elektronendichtheid kunnen de gemiddelde positie van atomen in het kristal, chemische bindingen, kristalbarrières en verschillende informatie worden bepaald. Voor een enkel kristal met voldoende zuiverheid, homogeniteit en regelmaat kunnen de röntgendiffractiegegevens de gemiddelde hoek en lengte van de chemische binding bepalen tot op respectievelijk enkele tienden van een graad en binnen enkele duizendsten van een angstrom.

Fig. 2. De fysica en wiskundige principes van röntgenkristallografie om een ​​structuur op te lossen

De eenkristalröntgendiffractietechniek werd voorgesteld en ontwikkeld in 1912, en het is het belangrijkste en nuttigste hulpmiddel geworden voor het bepalen van de eiwitstructuur, aangezien de eiwitstructuur van myoglobine voor het eerst werd bepaald in 1958. Tegenwoordig zijn er meer dan 140.000 eiwitstructuren zijn gedeponeerd in de eiwitdatabank (https://www.rcsb.org/), waarvan bijna 90% wordt opgelost met behulp van eenkristal-röntgendiffractietechniek, wat de voordelen suggereert bij het bestuderen van de structuur van biologische macromolecuulkristallen.

Het proces van monokristallijne röntgendiffractietechniek kan grofweg in vier stappen worden verdeeld. De eerste stap is het verkrijgen van hoogwaardige enkele kristallen van het doeleiwit, dat eiwitkristallisatie wordt genoemd. Wanneer de oplossing van het opgeloste eiwit oververzadiging bereikt, bevordert het eiwitaggregatie en nucleatie. Ultimately, individual protein molecules arrange themselves in a repeating series of unit cells by adopting a uniform orientation. Qualified crystals need to be of sufficient size (normally larger than 50 μm in all dimension) and quality (regular structure, no cracks or twins). Obtaining single crystals of high-quality is the limiting step to solve a structure with this method.

After obtaining a single crystal, a diffraction experiment is required. The crystal is immobilized in an intense X-ray beam, producing a diffraction pattern, which is recorded as the diffraction data (angle and intensity of the diffracted X-rays). As the crystal is gradually rotated, the previous reflections disappear and new reflections emerge. The diffraction intensity at each spot is recorded from each direction of the crystal.

Subsequently, the diffraction data obtained from the diffraction pattern are combined with various methods of structural analysis and data fitting to analyze the electron density distribution in the three-dimensional space within the unit cell.

In the last step, based on the electron density map, a model of atomic arrangement in the crystal can be produced and refined.

Fig.3. The process of single crystal X-ray diffraction technique

This method may yield high atomic resolution and is not limited by the molecular weight of the sample. It is suitable for water-soluble proteins, membrane proteins as well as macromolecular complexes. When manipulated properly, it becomes a powerful tool to deliver reliable structural data of biological macromolecules and determine the position and structure of the active center, and helps understand how the protein recognizes and binds ligand molecules at the atomic level.

However, the single crystal X-ray diffraction method also has several disadvantages. First, the sample must be crystallizable, but crystallization of biological macromolecules with large molecular weight can be difficult, particularly, membrane proteins are more challenging to crystallize because of its large size and poor solubilization. Second, an organized single crystal must be obtained to allow appropriate diffraction. Finally, the obtained three-dimensional structure of biological sample only represents a static form of the tested molecule (one of many possibilities), rather than a dynamic one.

The second method is nuclear magnetic resonance (NMR). Nuclei are charged, fast spinning particles, which are similar to outer electrons. The gyromagnetic ratios of different atomic nuclei are different and therefore have different resonance frequencies. The movement of the nucleus is not isolated--it interacts with the surrounding atoms both intra- and inter-molecularly. Therefore, through nuclear magnetic resonance spectroscopy, structural information of a given molecule can be obtained. Taking protein as an example, its secondary structure, such as α-helix, β-sheet, turn, circular, and curl, reflect the different arrangement of the main chain atoms of protein molecules three-dimensionally. The spacing of the atomic nuclei in different secondary domains, the interaction between nuclei, and the dynamic characteristics of polypeptide segments all directly reflect the three-dimensional structure of proteins. These nuclear features all contribute to spectroscopic behaviors of the analyzed sample, thus providing characteristic NMR signals. Interpretation of these signals by computer-aided methods leads to deciphering of the three-dimensional structure.

Fig.4. Nuclear spin

Since the first observation of condensed-state NMR signals in 1946, NMR technology has experienced a rapid development for over 70 years, and its application has been extended from the area of physics such as nuclear magnetic moment determination to chemistry, medicine, material science, life science and many others. Notably, in the 1980s, NMR technology was applied in the structural analysis of protein creatively, thus promoting the application of NMR in biological field. Although the amount of three-dimensional structure data of proteins obtained by NMR technology is not comparable to that of single crystal X-ray diffraction, the unique advantages of NMR technology have been widely noticed: NMR is able to provide information on a kinetic basis, such that the internal movement of proteins over multiple time scales and their binding mechanism to ligands can therefore be solved.

There are four main steps in an NMR experiment: sample preparation, data acquisition, spectral processing, and structural analysis. NMR analysis is performed on aqueous samples of protein with high purity, high stability, and high concentration. A sample volume ranging from 300 to 600 μL with a concentration range of 0.1-3 mM. The use of stable isotopes 15N, 13C and 2H for protein labeling can effectively increase signal intensity and resolution. Selective labeling of certain amino acids or chemical groups of proteins can greatly reduce signal overlap. Multidimensional NMR experiments are utilized to acquire information about the protein. The spectral processing is then performed to determine the atoms of the protein corresponding to each spectral peak on different NMR spectra. Finally, a series of spatially structured information such as NOE and J coupling constants are used to calculate the spatial structure using distance geometric or molecular dynamics methods.

Fig.5. The process of nuclear magnetic resonance technology

The most important feature of the NMR method is that the three-dimensional structure of macromolecules in the natural state can be measured directly in solution, and NMR may provide unique information about dynamics and intermolecular interactions. The resolution of the macromolecular three-dimensional structure can be as low as sub nanometer.

However, the NMR spectrum of biomolecules with large molecular weight is very complicated and difficult to interpret, thereby limiting the application of NMR in analyzing large biomolecules. Additionally, this technique requires relatively large amounts of pure samples (on the order of several mg) to achieve a reasonable signal to noise level.

The third approach is the cryo-electron microscopy (Cryo-EM) technique, which includes three different methods: single particle analysis, electron tomography and electron crystallography. The essential mechanism of Cryo-EM is electron scattering. The basic principle is described as follows. Samples are prepared through cryopreservation prior to analysis. The coherent electrons are used as a light source to measure the sample. After the electron beam passes through the sample and the nearby ice layer, the lens system converts the scattered signal into a magnified image recorded on the detector. And signal processing is performed to obtain the three-dimensional structure of the sample.

Electron microscopy three-dimensional reconstruction technology was first discovered in 1968. The three-dimensional structure of T4 phage tail was reconstructed by electron micrographs. And then the general concept and methods of three-dimensional reconstruction of electron microscopy were proposed. For reducing the radiation damage, cryogenic electron microscopy was created in 1974. After more than 30 years of development, Cryo-EM has become a powerful tool for studying the structure of biological macromolecules. In recent years, the Cryo-EM technology has made revolutionary progress, particularly in the single particle analysis. Since 2013, with the tremendous advances in electron detector and image processing, Cryo-EM single particle analysis has progressed so rapidly that the resolution of Cryo-EM is now comparable to single crystal X-ray diffraction. At present, Cryo-EM is becoming a powerful tool for determining high resolution structure of biological macromolecules.

Before using the Cryo-EM to observe the sample, negative staining EM can be utilized for rapid screening of homogeneous sample. The Cryo-EM single particle analysis technique begins with the sample vitrification. During this process, the protein solution is instantly cooled, so that the water molecules do not crystallize, forming an amorphous solid. The frozen sample is then screened and data is collected in the system. A series of two-dimensional images can be taken during this period. Next, based on plenty of two-dimensional images acquired, particle alignment and classification are carried out. In the end, the data is processed by reconstruction software to generate a three-dimensional structural model.

Fig.6. The process of Cryo-EM single particle analysis technique

Compared to single crystal X-ray diffraction, the rapid freeze treatment of the sample maintains its closer-to-native state. Moreover, this method requires only a small amount of sample (about 0.1 mg), is more forgiven on sample purity, and does not need the protein to crystalize.

The main defect in this technique is that the particles are detected in unknown orientations. High levels of noise, due to the use of limited electron doses to minimize radiation damage, especially at high resolution, tends to complicate the determination of these orientations, and this is particularly a concern for smaller particles. Hence, structure determination of biological macromolecules by Cryo-EM was limited to large complexes or low-resolution models over the last few years.

Fig.7. Cryo-electron microscopy

In summary, each technology has its own advantages in certain applications such that one method might be used extensively in some cases but rarely in others. Thus, understanding the nature of the analysis is the key in method selection. Not only will the inappropriate selection of method produce compromised results, it may also cause significant delays of the project, and result in financial losses. For more information, please see Table 1.


Abstract

Single-crystal X-ray diffraction analysis was performed on a magnetically oriented microcrystal array (MOMA a composite in which microcrystals are oriented three-dimensionally in a polymer matrix) to demonstrate its potential to determine protein structure from a powder sample. Recrystallized hen egg-white lysozyme was pulverized to prepare a microcrystalline powder as a model system from which a MOMA was prepared. The microcrystalline powder was suspended in an ultraviolet (UV)-curable monomer and rotated nonuniformly in a static magnetic field (8 T), and then, the crystalline alignment was consolidated by UV light irradiation. The obtained sample was subjected to conventional single-crystal X-ray diffraction measurement. The structure determined for the MOMA was found to belong to the space group P212121 with unit-cell dimensions een = 51.26, B = 59.79, and C = 29.95 Å, in agreement with the structure of the single crystal from which the MOMA was prepared. The protein structure was refined at the highest resolution of 3.0 Å, which agreed with that determined with an independently grown single crystal under comparable conditions. The fabrication method presented here provides a powerful means of determining the structure of proteins that do not crystallize to sizes suitable for conventional single-crystal X-ray analyses.


Abstract

We demonstrate that ion-beam milling of frozen, hydrated protein crystals to thin lamella preserves the crystal lattice to near-atomic resolution. This provides a vehicle for protein structure determination, bridging the crystal size gap between the nanometer scale of conventional electron diffraction and micron scale of synchrotron microfocus beamlines. The demonstration that atomic information can be retained suggests that milling could provide such detail on sections cut from vitrified cells.

Despite the explosive growth in cryoelectron microscopy (cryo-EM) following the “resolution revolution” (1), X-ray methods were responsible for nearly 20-fold as many macromolecular structure depositions as single-particle cryo-EM in 2017, and diffraction remains the favored method for genuine atomic resolution analysis. Crystal growth is often a bottleneck for such analyses, and it can sometimes be difficult to grow crystals of sufficient size for analysis at conventional synchrotron macromolecular crystallography (sMX) beamlines. This has led to the development of microfocus beamlines that can routinely analyze crystals down to ∼5 μm (2). However, it is unknown how often crystallographic analyses fail due to the failure to recognize smaller crystals. The next generation of synchrotron beamlines may reduce the size requirement to around 1 μm, and the potential for structure determination from submicron crystals has been demonstrated by application of X-ray free electron laser (XFEL) sources, which achieve a brightness ∼10 8 -fold greater than a typical synchrotron beamline (3). XFEL sources also sometimes mitigate, by achieving “diffraction before destruction,” the radiation damage problem that limits the collection of synchrotron X-ray data (4, 5).

Electron diffraction (ED) can provide high-resolution structure determination from 3D crystals (6 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –12). Electrons have potential advantages over X-rays for the analysis of very small crystals: Their interaction with matter is sufficiently strong for a measurable signal to be obtained from a typical laboratory instrument the experiment is performed in a vacuum, thereby reducing background scatter and the useful data obtained before radiation damage occurs are much greater (6, 13, 14). However, the strong interaction with matter is also a limitation for ED, since the beam is absorbed very strongly by a few hundred nanometers of crystal. Furthermore, it has often been held that kinematic theories of diffraction, upon which X-ray analysis rests, are useless for crystals of such thickness (15, 16). For protein crystals, due to the large size of the unit cell, many diffracted beams are stimulated simultaneously and, through conservation of energy, the amplitude of each is greatly reduced, mitigating the effects of multiple scattering. Although dynamical effects have been observed with thicker protein crystals (6), the utility of the kinematic theory for thin crystals is shown in our study below, where systematic absences, which would be polluted by multiple scattering, are maintained. Indeed, in recent years, the power of ED to analyze nanometer-sized crystals has been amply demonstrated (6, 12, 17) however, there remains a significant range of size, from a few hundred nanometers to a few microns, that is accessible only using XFEL radiation, which is both hard to access and extremely expensive.

Micromachining using a focused ion beam (FIB milling) has been established in physical science applications for many years (18), and, although far from routine, cryo-FIB milling is now increasingly applied in the life sciences, for instance, to create thin lamella milled from frozen, hydrated cells to reveal cellular architecture (19). Cryo-FIB milling has been shown to preserve the structure of frozen, hydrated biological samples better than mechanical cryosectioning, although how far the preservation of order extends has not been established (19).


Methoden:

Protein expression and purification

HCA II was expressed in BL21 DE3 pLysS E coli cells that were transformed with an expression plasmid based on pET31F1 coding for protein with UniProt accession code P00918 45 . The cells were grown in shaker incubators at 180 rpm and 37 °C in LB media supplemented with 0.1 mg/ml ampicillin. Once the cells reached an optical density of

1 at 600 nm, protein expression was induced with the addition of 1 mM isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG) and 1 mM ZnSO4. Protein expression was allowed to continue for 3 h. At this point, the cells were harvested by centrifugation in a JLA 8.1 rotor (Beckman) at

6800 × g for 20 min and frozen at −20 °C. Cells were resuspended in buffer A (0.2 M Na2SO4, 100 mM Tris, pH 9.0) and lysed by addition of lysozyme while stirring in the cold room for 3–4 h. The cell lysate was centrifuged in a JA-25.50 rotor (Beckman) at

18,000 × g for 60 min at 4 °C, and the supernatant containing the soluble cellular fraction was loaded onto affinity resin (para-aminomethylbenzensulfonamide, Sigma Aldrich A0796). Unbound protein and nucleic acids were removed by repeated wash steps with buffer A, followed by buffer B (0.2 M Na2SO4, 100 mM Tris, pH 7.0). Bound HCA II was eluted with 50 mM Tris, pH 7.8, and 0.4 M NaN3. The eluted protein was concentrated with Amicon Ultra concentration devices (10 kDa molecular weight cutoff), purified, and buffer-exchanged by size-exclusion chromatography on HiLoad 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare Life Sciences) in 50 mM Tris, pH 8.5. Fractions were collected and analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis to assess protein purity and homogeneity prior to crystallization. Eluted fractions containing HCA II were pooled and concentrated to

20 mg/ml by using Amicon Ultra Centrifugal Filter Units (Merck) with a molecular weight cutoff of 10 kDa.

Crystallization

Crystals of HCA II were grown in sitting-drop vapor-diffusion setups using microbridges (Hampton Research) and 24-well Linbro crystallization plates (Hampton Research). The drops were prepared by mixing 10 μl of protein solution (20 mg/ml) with 10 μl of precipitant solution (2.8 M (NH4)2SO4, 0.1 M Tris, pH 8.5), and were equilibrated against 1 ml of reservoir solution of the precipitant. Plates were incubated at 20 °C, and crystals appeared in 2–3 days. Crystals were harvested by crushing and repeated pipetting into 1.5 ml Eppendorf tubes to collect slurries of small crystals in mother liquor and stored at 20 °C until cryo-grid preparation.

Sample preparation

Complexes of HCA II with inhibitor AZM (Sigma Aldrich, A6011) were prepared by soaking the crystal slurries with inhibitor solubilized in dimethyl sulfoxide (DMSO) for 20 min, with a final concentration of 0.5 mM HCA II and 4.5 mM AZM. Grids were prepared by pipetting 3 μl on a QUANTIFOIL 1.2/1.3 (300 mesh) Cu holy carbon TEM grid. Excess liquid was removed via pressure-assisted backside blotting using Preassis 46 . The grid was vitrified manually by flash-cooling in liquid ethane. The sample was transferred to a Gatan 914 cryo-transfer holder.

Data acquisition

Microcrystal electron-diffraction data were collected on a JEOL JEM-2100 (LaB6 filament) TEM operated at 200 kV equipped with a Timepix hybrid pixel detector (Amsterdam Scientific Instruments). Grids were screened for suitable microcrystals in defocused diffraction mode, and diffraction data were collected from an area of 1.5 μm diameter defined by a selected-area aperture using the Instamatic software interface 40 . The effective sample-to-detector distance was 1481.74 mm. Data were collected using continuous rotation with an angular increment of 0.68° and an exposure time of 1.5 s per frame. Individual crystal datasets were typically collected over a tilt range of on average 10–30°, with an acquisition time of 22–66 s per crystal dataset. The total range of tilt angles covered during data collection from several crystals was −60 to +60°. The electron dose rate applied during data collection was approximately 0.1 e − /Å 2 /s, and the total exposure dose for each crystal dataset was within 2.0–6.0 e − /Å 2 .

Data processing

Data were integrated using XDS 47 with the Laue group constrained to 2/m. Reflections from different crystal datasets were merged in XSCALE 47 using a weighted average of the unit-cell parameters obtained from individual crystal processing (see Supplementary Tables 1 and 2). Selection criteria for including data were based on merging statistics and correlation coefficients between individual datasets as reported by XSCALE. A cutoff value of 0.7 was used for the ligand-bound HCA II data for the native HCA II data, a cutoff of 0.6 was used. Data were truncated at approximately II ≥ 1.0 and CC1/2 ≥ 0.4 with a correlation significant at the 0.1% level 48 (see Supplementary Tables 3 and 4). Data were merged and converted into MTZ format using AIMLESS 49 .

Structure solution

A search model of the apo structure with the metal cofactor, ligands, and water removed was generated from a high-resolution X-ray model (PDB ID 3hs4 29 ) using Sculptor 50 . The structure was solved using maximum-likelihood molecular replacement in Phaser 36 using the MicroED reflection intensities. For both native and ligand-bound data, a well-contrasting single solution was found with LLG = 1871, TFZ = 18.6, and LLG = 2494, TFZ = 19.6, respectively.

Model building and refinements

Starting electrostatic potential maps were generated from the molecular replacement solution using rigid-body refinement in phenix.refine 51 . The starting model and maps were used for remodeling several side chains and manually placing the metal cofactor Zn 2+ using Coot 37 . After restrained reciprocal space refinement in phenix.refine, the resulting map was inspected for any difference potential, indicating the presence of the bound inhibitor. The AZM ligand was imported in Coot using the get monomer command, and we used the find ligands command to fit the ligand using the precalculated mFo–DFc difference potential map at 2.8σ.

Furthermore, upon inspection of the map, a clear blob of difference potential was observed in the solvent region, appropriate for accommodating a single DMSO molecule that was used as solvent to solubilize the ligand. The DMSO molecule was manually fitted using the get monomer command in Coot. Its position is in agreement with the neutron structure (PDB ID 4g0c) 30 where the space is occupied by three waters, and with a glycerol (GOL) solvent molecule occupying the same region in the high-resolution X-ray model (PDB ID 3hs4) 29 .

The HCA II:AZM model was then completed, automatically placing water molecules, and using restrained reciprocal space refinement in phenix.refine 51 . All refinement steps were preformed using a test set representing 5% of all reflections, atomic scattering factors for electrons, automatic weighting of the experimental data to stereochemistry and atomic displacement parameter terms, and group B-factor refinement per residue 51 .

Validation

The geometry of the native and ligand-bound structural models was validated using MolProbity 52 (Table 1). A simulated annealing (SA) composite omit map was calculated using phenix.composite_omit_map 51 by sequentially omitting 5% fractions of the structure. No missing reflections were filled in for map calculations. The MicroED model of the native structure shows a backbone Cα root-mean-square (r.m.s.) deviation of 0.23 Å with a structure from joint refinement against neutron and X-ray diffraction data (PBD ID 3tmj) 27 , and 0.22 Å with an X-ray structure of native HCA II (PBD ID 3ks3) 53 . The inhibitor-bound MicroED model shows a backbone Cα r.m.s. deviation of 0.29 Å with a previously determined model from joint X-ray and neutron refinement (PDB ID 4g0c 30 ), and of 0.22 Å with a high-resolution X-ray model of the same inhibitor-bound complex (PDB ID 3hs4) 29 , that was used as search model for molecular replacement. Root-mean-square deviation values between structural models were calculated by the secondary-structure matching (SSM) tool 54 .

Figuren

Figures 2–4 were prepared using the PyMOL Molecular Graphics System, version 2.2.3 Schrödinger, LLC.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.


Docking of X-Ray Crystallographic Structures Within Cryo-EM Maps

In the past decade, the most widely accepted combinatorial approach of X-ray crystallography and cryo-EM technique has been the practice of docking X-ray crystallographic atomic models into a cryo-EM map at low resolution. 5 This practice started in 1990s when crystal structures were attempted to be docked into low-resolution cryo-EM maps of icosahedral viruses or cytoskeletal helical filaments. 6 In the past two decades, several dozen docking software packages have been developed but only a few are still being actively developed today. The docking methods can be classified mainly into two categories: rigid-body docking and flexible docking. Rigid-body docking is used to find the optimal orientation and position of sub-component atomic crystallographic structures in the cryo-EM map. The most popular docking software packages include Situs, 7 EMfit, 8 and UCSF Chimera docking utility. 9 In cases where some minor conformational differences exist between the crystal structure of an individual component and its counterpart in the cryo-EM map, flexible docking algorithms, such as normal mode analysis and molecular dynamic simulation, are used by introducing conformational changes to the X-ray structure to fit into the cryo-EM map while maintaining the stereo-chemistry of the atomic models. Some flexible docking software packages include Situs, Flex-EM, 10 MDFF, 11 iMODFIT 12 and more recently Rosetta. 13

The docking can be quite useful in defining the protein location and protein–protein interface within a complex and new interaction modes that are not revealed by X-ray crystallography. If the cryo-EM density is of good enough quality, the docking can be quite precise even at lower resolution. In a recent example, the crystal structure of Ryanodine receptor 1's SPRY2 domain (∼50 kDa) was docked as a rigid body into a 10 Å resolution cryo-EM map of the entire complex (∼1.5 MDa) (Fig. 2). 14 The best scored result by the Colores program of Situs turned out to define the domain's location and orientation quite precisely to agree with the same domain in the high resolution structure of the complex in a 3.8 Å structure solved more recently by single particle cryo-EM. 15 The RMSD between the Cα atoms of the docked SPRY2 model and the high resolution atomic model of the complex was only 2.1 Angstrom. This underscores both the quality of the low-resolution cryo-EM map and the robustness of the docking algorithm.

Docking of atomic models into the 3D cryo-EM map of Ryanodine receptor 1 complex at 10 Angstrom resolution. The 3D EM map of the Ryanodine receptor 1 (EMD-5041) is shown in semi-transparent rendering in two orthogonal views. The atomic model of a ryanodine receptor monomer (grey) is docked in the map. The atomic model of SPRY2 domain docked in the map with rigid docking algorithm is shown in red color. Its equivalent domain in the atomic model of the full-length protein is shown in blue color. The atomic models of the two SPRY2 domain are in very similar orientation and location.

In our study, elucidating the architecture of yeast RNA exosome complex, docking of atomic models into low-resolution EM 3D reconstruction maps was critical for us to uncover new mechanistic insights of the complex's function. We solved a 3D reconstruction of the yeast exosome complex comprising ten subunits using single particle EM at about 18 Angstrom resolution, in which we were able to dock homologous atomic models of the nine-subunit human core complex and bacterial RNase III protein determined by X-ray crystallography. 16 This allowed us to reveal the mode of interaction between the Rrp44 subunit and the core complex. In a later study, we docked the crystal structure of RNA-bound yeast exosome 10-mer 17 into a 3D EM reconstruction of the complex in conformations induced by different lengths of RNA substrates with high fidelity. 18 Alternatively, we revealed a different conformation of the exosome bound by RNAs with short 3′-ss tails and built atomic models by docking available crystal structures of the core complex and Rrp44 separately in the 3D EM reconstruction. The two docking results allowed us to reveal distinct pathways of RNA substrate recruitment and processing within the complex. Interestingly, the most recent near-atomic-resolution structure of the apo-exosome complex (PDBID: 5G06) 19 verified the interfaces between the subunits calculated from the previous docking models in the low-resolution cryo-EM map of the apo-exosome complex.


Protein Mapping

Mapping of the location and expression level of proteins in specific cells, tissues, and organs aids in the functional study of the proteome. Spatial distribution of proteins is key to protein function, with improper localization or expression triggering various disease states. Mapping projects such as the Human Protein Atlas provide a proteomic resource for biomarker discovery and aid in the understanding of disease pathology. Mapping of the interactome helps define the molecular interactions that occur on a cellular level, assisting in the understanding of protein function and providing valuable potential drug targets for disease.