Informatie

Hoe ontwerp je een siRNA-experiment?


Ik ga binnenkort een siRNA-experiment ondernemen, maar ik heb er alleen maar over gelezen. Ik wil ingaan op de rol die een enzym speelt bij het verwerken van een eiwit.

Van wat ik begrijp, zal ik twee specifieke siRNA's moeten kiezen uit een scherm van meerdere siRNA-kandidaten. Als negatieve controle zou ik ook een onzinnig siRNA door elkaar moeten gooien. Natuurlijk moet het specifieke siRNA een significante knock-down van het enzym laten zien; de controle mag de expressie niet beïnvloeden. Er moet ook een gevalideerde positieve controle (zoals GAPDH) en een nepbehandelde controle zijn.

Is deze experimentele opzet voldoende? Wat zijn enkele veelvoorkomende dingen om in gedachten te houden, of valkuilen om te vermijden bij het doen van siRNA-onderzoeken?


Eerst moet u beslissen of u een shRNA wilt ontwerpen of siRNA's wilt gebruiken.

Als je shRNA wilt gebruiken, moet je kijken naar de regels die "Mad Scientist" noemde. U kunt mismatches invoegen, maar zorg ervoor dat u de secundaire structuur niet verstoort. U kunt RNAFold gebruiken om te verifiëren.

shRNA heeft altijd problemen en je moet je ontwerp optimaliseren, testen met realtime PCR of Northern blot enz. om de productie en de concentratie te bevestigen.

U kunt siRNA's ontwerpen en er zijn online algoritmen om u te helpen er een te ontwerpen. U moet een sequentie kiezen die specifiek is voor uw gen. Deze stap is belangrijk voor zowel shRNA als siRNA's om off-targeting te minimaliseren/vermijden.

Een gangbare praktijk is om een ​​pool van siRNA's te gebruiken voor een enkel gen. Gepoolde siRNA's zijn voor veel genen in de handel verkrijgbaar.

Voor de experimentele controles zou je twee experimenten moeten doen:

  • nep-siRNA behandeld; die geen enkel gen beïnvloeden
  • Uw siRNA behandeld

test vervolgens op een referentiegen zoals GAPDH en uw gen. Een goed referentiegen zou het gen moeten zijn waarvan niet wordt verwacht dat het de expressie verandert. GAPDH is mogelijk niet altijd een goede referentie (bijvoorbeeld in gevallen waarbij het metabolisme wordt beïnvloed). De keuze van het referentiegen is intuïtief en hangt af van uw voorkennis van het systeem. In plaats van GAPDH kun je ook GFP transfecteren en dat als controle kwantificeren (spike-in).


Nauwkeurig en efficiënt siRNA-ontwerp: een belangrijk punt bij competente genuitschakeling

RNA-interferentiegerelateerde strategieën zijn aantrekkelijke methoden geworden in verschillende onderzoeksgebieden. Exact sequentieontwerp van deze kleine moleculen is een essentiële stap in de silencing-procedure. Talloze onderzoekers hebben geprobeerd enkele algoritmen te definiëren om de kans op succes van short interfererende RNA's (siRNA's) te vergroten. In de afgelopen decennia is online ontwerpsoftware gericht geweest op het bevorderen van de kwaliteit van siRNA-ontwerpen op basis van de meest geciteerde algoritmen. Volgens onze eerdere experimenten zou een combinatie van verschillende criteria nuttig zijn. Dat wil zeggen, siRNA's gesuggereerd door een combinatie van hulpmiddelen lijken efficiënter te zijn. Bovendien zullen verschillende factoren, zoals de afstand van het doelgebied tot de startplaats van de transcriptie, nucleotidesamenstelling, afwezigheid van off-target effecten en secundaire structuren in de doelplaats en siRNA en de aanwezigheid van asymmetrie en energievallei binnen het siRNA de efficiëntie van siRNA's verhogen. . Ondanks de toepassing van verschillende online tools en het voldoen aan de criteria, is er geen garantie voor het ontwerpen van een effectief siRNA. Het nauwgezet ontwerpen van siRNA's volgens de voorgestelde algoritmen en scoresystemen en het gebruik van verschillende siRNA's voor het targeten van hetzelfde gen zou echter leiden tot een verbeterd silencing-resultaat. In deze review richten we ons op veelvoorkomende algoritmen en online software en introduceren we een nieuw scoresysteem dat in onze experimenten wordt gebruikt.


Technoten

Een nieuwe manier om de efficiëntie van siRNA-afgifte te beoordelen - TechNotes 12(3)
Beschrijving: Met onze nieuwe KDalert™ GAPDH-assaykit en een microplaatfluorometer kunt u in minder dan 30 minuten een betrouwbare meting van de GAPDH-enzymactiviteit in gekweekte cellen van mensen, muizen of ratten verkrijgen.

Zijn siRNA-pools slim? - TechNotes 12(1)
Beschrijving: Twee strategieën voor grootschalige screeningsexperimenten worden vergeleken.

Genfunctie beoordelen met siRNA-bibliotheken - TechNotes 11(3)
Beschrijving: Er wordt een experiment beschreven waarin siRNA's uit de Silencer™ Kinase siRNA-bibliotheek elk werden getest om hun effecten op cellulaire proliferatie en mitotische index te bepalen.

Cells-to-cDNA™ II-toepassingen | Kwantificering van siRNA-doelgenexpressie
Beschrijving: Kwantificeer genexpressie in met siRNA getransfecteerde cellen zonder RNA te isoleren.

Beheer uw siRNA-onderzoek | Bewezen siRNA-controles en overeenkomende primaire antilichamen - TechNotes 10(1)
Beschrijving: Ambion introduceert een controle-siRNA gericht op ß-actine, evenals een primair antilichaam tegen ß-actine, ideaal voor gebruik in immunofluorescentie-experimenten om de door RNAi geïnduceerde verlaging van eiwitniveaus te detecteren.

Afbakening van de rol van overleving in oncogenese: een siRNA-onderzoek - TechNotes 13(4)
Beschrijving: In deze studie werden gerichte siRNA's gebruikt om de expressie van survivine te veranderen, en een reeks biochemische en celgebaseerde testen werden uitgevoerd op de getransfecteerde cellen om bekende indicatoren van apoptose te beoordelen om de rol van survivine bij kanker beter te begrijpen.

Duur van door siRNA geïnduceerde silencing: uw vragen beantwoord -TechNotes 15(3)
Beschrijving: In dit artikel beantwoorden we vragen over de persistentie van het RNAi-effect dat wordt geïnitieerd door siRNA's in menselijke cellen te transfecteren.

Verbeterde siRNA-afgifte en langdurige genuitschakeling - TechNotes 12(1)
Beschrijving: Gebruik Ambion's nieuwe pSilencer™ 5.1 Retro System om siRNA's van een retrovirale vector stabiel tot expressie te brengen

Zorg voor RNAi-succes - TechNotes 13(4)
Beschrijving: Samen bieden Ambion en Applied Biosystems een complete en handige oplossing voor experimenten met genuitschakeling.

Experimentele variabiliteit en replica's in siRNA-experimenten - TechNotes 14(4)
Beschrijving: Dit artikel beschrijft verschillende bronnen van variatie in RNAi-experimenten, evenals hoe het ideale aantal replicaten te bepalen.

Snelle en nauwkeurige bevestiging van genuitschakeling | Silencer® siRNA's & TaqMan® genexpressieassays - TechNotes 14(1)
Beschrijving: Dit artikel illustreert het gecombineerde gebruik van Ambion's Silencer® siRNA's en Applied Biosystems TaqMan® genexpressieassays om hoogwaardige, nauwkeurige en reproduceerbare genuitschakelingsgegevens te genereren.

Snelle nauwkeurige beoordeling van door siRNA geïnduceerde genuitschakeling - TechNotes 12(2)
Beschrijving: Dit artikel illustreert het gecombineerde gebruik van Ambion's Silencer® siRNA's en Applied Biosystems TaqMan® genexpressieassays om hoogwaardige, nauwkeurige en reproduceerbare genuitschakelingsgegevens te genereren

Vijf manieren om siRNA's te produceren - TechNotes 10 (3)
Beschrijving: Een overzicht van vijf methoden voor het genereren van siRNA's voor gebruik in gene silencing-onderzoeken.

Label uw siRNA fluorescerend om het in levende cellen te volgen - TechNotes 9(4)
Beschrijving: Label siRNA's met Cy3 of FAM voor analyse van subcellulaire lokalisatie, transfectie-efficiëntie en om getransfecteerde cellen te identificeren voor verdere analyse.

Genspecifieke uitschakeling door RNAi - TechNotes 10(1)
Beschrijving: Een kort overzicht (met figuur) van het mechanisme van RNAi.

Krijg controle over uw siRNA-experimenten
Beschrijving: Het R&D-personeel van Applied Biosystems geeft advies over het juiste gebruik van controles voor siRNA-experimenten.

Aan de slag met RNAi - TechNotes 13(1)
Beschrijving: Een greep uit de inleidende informatie die te vinden is in Ambion's nieuw beschikbare RNA Interference Research Guide.

Aan de slag met RNAi In vivo - TechNotes 15(2)
Beschrijving: Dit artikel beschrijft een RNAi-experiment in een diermodel waarbij siRNA werd toegediend met behulp van hydrodynamische staartaderinjectie.

High Throughput Levering van siRNA's: voorbeelden - TechNotes 12(3)
Beschrijving: Bekijk siRNA-screeninggegevens uit een recente Ambion-publicatie die werd gebruikt om kinasegenen te identificeren die betrokken zijn bij celproliferatie.

Overeenkomende siRNA's en tests - TechNotes 11(4)
Beschrijving: Ambion-siRNA's elimineren het giswerk dat gepaard gaat met het ontwerpen en testen van siRNA's, terwijl de Taqman®-genexpressieassays van Applied Biosystems een snelle, eenvoudige manier bieden om mRNA-knockdown te meten.

Volgende generatie siRNA's om uw zwijgen te laten brullen - TechNotes 15(1)
Beschrijving: Ambion® Silencer® Select siRNA's bevatten de nieuwste verbeteringen in siRNA-ontwerp, voorspellingsalgoritmen voor off-target effecten en chemische modificaties om siRNA's op te leveren met ongeëvenaarde werkzaamheid, potentie en specificiteit.

Optimalisatie van siRNA-transfectie voor RNAi - TechNotes 12(1)
Beschrijving:
Lage transfectie-efficiëntie en lage levensvatbaarheid van de cellen zijn de meest voorkomende oorzaken van mislukte genuitschakelingsexperimenten.

RNAi-experimenten uitvoeren bij dieren - TechNotes 13(1)
Beschrijving: Een inleiding tot RNAi in vivo, inclusief bespreking van lokale toediening en systemische levering van siRNA's.

Snel siRNA-afgifte en levensvatbaarheid van cellen beoordelen in dezelfde test - TechNotes 13(1)
Beschrijving: Ambion's KDalert™ GAPDH-assay is een eenvoudige 3-stappenprocedure voor de kwantificering van door siRNA geïnduceerde GAPDH-knockdown in gekweekte cellen, waardoor deze kit het ideale hulpmiddel is voor transfectie-optimalisatie-experimenten.

RNAi-workflow in vier stappen - TechNotes 15(1)
Beschrijving: Dit korte artikel schetst de workflow voor een typisch RNAi-experiment met siRNA's.

RNAi als hulpmiddel voor analyse van zoogdiergenen: toepassingen van siRNA's - TechNotes 10(5)
Beschrijving: Een senior wetenschapper van Ambion bespreekt enkele van de meest prominente toepassingen voor RNAi in zoogdiersystemen en voorbeelden van deze toepassingen uit de literatuur.

RNAi: Grootte doet ertoe - TechNotes 9(5)
Beschrijving: Hoe dsRNA-lengte correleert met de efficiëntie van genuitschakeling.

Aanbevelingen voor succesvolle siRNA-bibliotheekschermen - TechNotes 11 (6)
Beschrijving: Ambion-wetenschappers identificeren vijf procedures die de schermresultaten van de siRNA-bibliotheek aanzienlijk verbeteren.

Verminderde siRNA-concentraties leiden tot minder off-target effecten - TechNotes 15(2)
Beschrijving: Silencer® Select siRNA's zijn ontworpen voor een hogere potentie en specificiteit en minder off-target effecten, wat leidt tot het bereiken van maximale knockdown met lagere concentraties siRNA.

Lever siRNA's reproduceerbaar in gekweekte cellen - TechNotes 14(2)
Beschrijving: siPORT™ NeoFX™ is een op lipiden gebaseerd transfectiemiddel dat kan worden gebruikt om hechtende cellen efficiënt te transfecteren terwijl ze worden gesubkweekt, zonder verhoogde cytotoxiciteit.

RNAi How To voor nieuwe gebruikers - TechNotes 11(5)
Beschrijving:
RNA-interferentie, het biologische mechanisme waarmee dubbelstrengs RNA (dsRNA) gen-uitschakeling induceert door complementair mRNA te targeten voor afbraak, zorgt voor een revolutie in de manier waarop onderzoekers genfunctie bestuderen.

Selecteren van siRNA-sequenties om op te nemen in de pSilencer-vectoren - TechNotes 9(5)
Beschrijving: Een gids voor de identificatie van doelgensequenties die gevoelig zijn voor door siRNA geïnduceerde afbraak.

Succesvolle siRNA-bibliotheekschermen instellen - TechNotes 11 (6)
Beschrijving: Een algemeen overzicht van een effectief screeningsproces.

Silencer® siRNA-bibliotheken | siRNA-bibliotheken die zich richten op belangrijke functionele genklassen
Beschrijving: Nieuwe versies van Ambion's 0,25 nmol Silencer® siRNA-bibliotheken zijn vrijgegeven. Lees de details in dit artikel, inclusief het aantal en de soorten genen waarop elke bibliotheek zich richt.

Silencer® siRNA Screening Configuratiescherm | Effectieve controles voor RNAi-screeningsexperimenten - TechNotes 13(1)
Beschrijving: Een overzicht van Ambion's nieuwe Silencer® siRNA Screening Control Panel van positieve en negatieve controle-siRNA's voor het bepalen van transfectie-efficiëntie en hitdrempels in siRNA-screeningsexperimenten.

Silencer® siRNA-startpakket | Nieuwe gebruikerskit voor genuitschakeling - TechNotes 13(1)
Beschrijving: Silencer siRNA-bibliotheken zijn sets van siRNA's die zich richten op groepen genen van functionele genklassen tot hele genomen, dus ze zijn ideaal voor padanalyse en doelidentificatie en -validatie.

Silencer® siRNA-bibliotheken | Schijn het licht op de genfunctie - TechNotes 14(2)
Beschrijving: Silencer siRNA-bibliotheken zijn sets van siRNA's die zich richten op groepen genen van functionele genklassen tot hele genomen, dus ze zijn ideaal voor padanalyse en doelidentificatie en -validatie.

siRNA-expressievectoren met selecteerbare markeringen - TechNotes 10(1)
Beschrijving:
Er zijn nu zes nieuwe pSilencer™ siRNA-expressievectoren beschikbaar, elk met een antibioticumresistentiegen om selectie in gekweekte zoogdiercellen te vergemakkelijken.

siRNA-screening Valideert duizenden doelen in één week - TechNotes 16(1)
Beschrijving: Validatie van siRNA-knockdown kan vaak langer duren dan het scherm zelf. Twee wetenschappers van Applied Biosystems hebben deze stap meer dan 10 keer gestroomlijnd, waarbij ze meer dan 1500 siRNA's valideren die zich richten op meer dan 500 genen binnen een enkele week.

siRNA Design Het zit allemaal in het algoritme - TechNotes 11(3)
Beschrijving: De effectiviteit van het algoritme dat is gebruikt om Ambion's Silencer™ vooraf ontworpen, gevalideerde en bibliotheek-siRNA's te ontwerpen, wordt aangetoond met ongeveer 1100 verschillende siRNA's en 400 endogene transcripten.

siRNA-geïnduceerde mRNA knockdown en fenotype: hoe te meten en wanneer te meten? -TechNotes 15(3)
Beschrijving: In dit rapport onderzochten wetenschappers van Applied Biosystems de duur van een verwacht fenotype parallel aan de meting van mRNA-knockdown op verschillende tijdstippen na siRNA-transfectie.

Stroomlijn uw siRNA-transfecties - TechNotes 11 (6)
Beschrijving: Introductie van siPORT™ NeoFX™ Transfection Agent voor snelle, reproduceerbare transfectie van siRNA.

Test meer siRNA's voor minder - TechNotes 9(6)
Beschrijving: Ambion's nieuwe Silencer™ siRNA Construction Kit produceert transfectieklaar siRNA tegen een fractie van de kosten van chemische synthese.

Tools voor het optimaliseren van de levering van siRNA | Definieer de beste voorwaarden voor siRNA-afgifte in gekweekte cellen - TechNotes 14(2)
Beschrijving: Ambion siRNA-leveringsoptimalisatiekits en -reagentia zijn gebruiksvriendelijk en bevatten gedetailleerde instructies om u te helpen het optimalisatieproces te stroomlijnen.

Berekeningen voor siRNA-gegevens begrijpen -TechNotes 14(3) Beschrijving: In dit artikel wordt beschreven hoe u het percentage resterende genexpressie en het percentage knockdown van genexpressie kunt bepalen bij het beoordelen van de effecten van siRNA's met realtime RT-PCR.

Gevalideerde siRNA's gebruiken in functionele genomische tests - TechNotes 10 (3)
Beschrijving: Een door Silencer gevalideerd siRNA gericht op de TNFalpha-receptor wordt gebruikt om genproducten te identificeren die zijn geassocieerd met door TNFalpha geïnduceerde activering van de NF-kappaB-route.

Visualisatie van siRNA in zoogdiercellen - TechNotes 9(3)
Beschrijving:
Het labelen van GAPDH en c-myc-siRNA met fluoresceïne of Cy3 bleek geen effect te hebben op de silencing-efficiëntie, maar maakte visualisatie van de distributiepatronen van deze moleculen na transfectie mogelijk.

Welke competente cellen moeten worden gebruikt voor het klonen van siRNA's in pSilencer
Beschrijving: Het R&D-personeel van Applied Biosystems geeft advies over het juiste gebruik van controles voor siRNA-experimenten.


Referenties

Paddison, P. et al. Een bron voor grootschalige op RNA-interferentie gebaseerde schermen bij zoogdieren. Natuur 428, 427–431 (2004).

Berns, K. et al. Een grootschalig RNAi-scherm in menselijke cellen identificeert nieuwe componenten van de p53-route. Natuur 428, 431–437 (2004).

Kittler, R. et al. Een door endoribonuclease bereid siRNA-scherm in menselijke cellen identificeert genen die essentieel zijn voor celdeling. Natuur 432, 1036–1040 (2004).

Boese, B. et al. Mechanistische inzichten helpen computationeel kort interfererend RNA-ontwerp. Methoden Enzymol. 392, 73–96 (2005).

Khvorova, A., Reynolds, A. & Jayasena, SD Functionele siRNA's en miRNA's vertonen streng bias. Cel 115, 209–216 (2003).

Schwarz, DS et al. Asymmetrie in de assemblage van het RNAi-enzymcomplex. Cel 115, 199–208 (2003).

Reynolds, A. et al. Rationeel siRNA-ontwerp voor RNA-interferentie. nat. Biotechnologie. 22, 326–330 (2004).

Hsieh, AC et al. Een bibliotheek van siRNA-duplexen die gericht zijn op de fosfoinositide 3-kinase-route: determinanten van gen-uitschakeling voor gebruik in celgebaseerde schermen. Nucleïnezuren Res. 32, 893–901 (2004).

Ui-Tei, K. et al. Richtlijnen voor de selectie van zeer effectieve siRNA-sequenties voor RNA-interferentie van zoogdieren en kippen. Nucleïnezuren Res. 32, 936–948 (2004).

Amarzguioui, M. & Prydz, H. Een algoritme voor de selectie van functionele siRNA-sequenties. Biochem. Biofysica. Onderzoek gemeenschappelijk 316, 1050–1058 (2004).

Saetrom, P. & Snove, O., Jr. Een vergelijking van voorspellers voor de werkzaamheid van siRNA. Biochem. Biofysica. Onderzoek gemeenschappelijk 321, 247–253 (2004).

Labuda, D., Nicoghosian, K. & Cedergren, R.J. Een nieuwe RNA-digestieactiviteit van commercieel polynucleotidefosforylase. FEBS Lett. 179, 213–216 (1985).

Kierzek, R. Hydrolyse van oligoribonucleotiden: invloed van sequentie en lengte. Nucleïnezuren Res. 20, 5073–5077 (1992).

Schneider, G. & Wrede, P. Kunstmatige neurale netwerken voor computergebaseerd moleculair ontwerp. prog. Biofysica. Mol. Biol. 70, 175–222 (1998).

Weinstein, JN. et al. Neural computing bij de ontwikkeling van kankergeneesmiddelen: het werkingsmechanisme voorspellen. Wetenschap 258, 447–451 (1992).

Stolorz, P., Lapedes, A. & Xia, Y. Het voorspellen van de secundaire structuur van eiwitten met behulp van neurale netwerken en statistische methoden. J. Mol. Biol. 225, 363–377 (1992).

Giddings, MC et al. Kunstmatige neurale netwerkvoorspelling van antisense-oligodeoxynucleotide-activiteit. Nucleïnezuren Res. 30, 4295–4304 (2002).

Krijt, A.M. & Sonnhammer, E.L. Computationele antisense oligo-voorspelling met een neuraal netwerkmodel. Bio-informatica 18, 1567–1575 (2002).

Rumelhart, D. in Parallelle gedistribueerde verwerking (red. McClelland, J. & de PDP Research Group), vol. 1, 318-362 (MIT Press, Cambridge, MA).

Huesken, D. et al. mRNA-fusieconstructen dienen in een algemene celgebaseerde test om oligonucleotide-activiteit te profileren. Nucleïnezuren Res. 31, e102/1–e102/11 (2003).

Zamore, P.D., Sharp, P.A., Tuschl, T. & Bartel, D.P. RNAi: dubbelstrengs RNA stuurt de ATP-afhankelijke splitsing van mRNA aan met tussenpozen van 21 tot 23 nucleotiden. Cel 101, 25–33 (2000).

Benjamini, Y. & Hochberg, Y. Beheersing van het percentage valse ontdekkingen: een praktische en krachtige benadering van meervoudig testen. J. van de Royal Statistical Society. Serie B 57, 289–300 (1995).

Vickers, T.A. et al. Efficiënte reductie van doel-RNA's door kleine interfererende RNA- en RNASE H-afhankelijke antisense-middelen. J. Biol. Chem. 278, 7108–7118 (2003).

Horbarth, J. et al. Sequentie, chemische en structurele variatie van kleine interfererende RNA's en korte haarspeld-RNA's en het effect op genuitschakeling bij zoogdieren. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 13, 83–106 (2003).

Ohba, H. et al. Remming van bcr-abl- en/of c-abl-genexpressie door kleine interfererende, dubbelstrengs RNA's: overspraak met celproliferatiefactoren en andere oncogenen. Kanker 101, 1390–1403 (2004).

Hall, J. Het ontrafelen van de algemene eigenschappen van siRNA's: kracht in aantallen en lessen uit het verleden. nat. Rev. Genet. 5, 552–557 (2004).

Hemmings-Mieszczak, M., Dorn, G., Natt, F., Hall, J. & Wishart, W. Antisense-oligonucleotiden complementeren RNAi-gemedieerde specifieke remming van de recombinante ratten-P2X3-receptor. Nucleïnezuren Res. 31, 2117–2126 (2003).

Butz, N. et al. Het menselijke ubiquitine-conjugerende enzym Cdc34 regelt cellulaire proliferatie door regulering van p27Kip1-eiwitniveaus. Exp. Cel res. 303, 482–493 (2005).


SiRNA-oplossingen van Dharmacon™

RNA-interferentie via synthetisch klein interfererend RNA (siRNA) is de voorkeurskeuze voor snelle maar betrouwbare verlies-van-functie-onderzoeken. In het algemeen bruikbaar voor vele toepassingen en in elke cellijn, biedt siRNA een ongecompliceerde en veel aangehaalde techniek voor functionele genuitschakeling. Al meer dan 20 jaar is Dharmacon de meest vertrouwde naam in siRNA-ontwerp en -synthese van hoge kwaliteit.

Selecteer een vooraf ontworpen siRNA-productlijn of ontwerp uw eigen siRNA met aangepaste aanpassingen.

ON-TARGETplus siRNA

Accell siRNA

SiGENOME siRNA

Betrouwbare genuitschakeling van de langst bestaande siRNA-garantie op de markt.

Transfectiereagentia

SiRNA-controles

Weet je niet waar je moet beginnen?

Onze siRNA knockdown-garantie

De ON-TARGETplus-, Accell- en siGENOME-siRNA-lijnen zijn gegarandeerd* om de doelgenexpressie op mRNA-niveau met ten minste 75% effectief tot zwijgen te brengen.

Lincode siRNA

Knockdown lange, niet-coderende RNA-genen met gespecialiseerd siRNA, aangepast om specificiteit te garanderen.

Aangepast siRNA-ontwerp

Ontwerp uw eigen siRNA voor elke soort op onze gebruiksvriendelijke tool.

Het verminderen van off-targets maximaliseert specificiteit

Een succesvol siRNA-knockdown-experiment moet zowel effectief als specifiek zijn. Het SMARTselection-ontwerpalgoritme van Horizon (gebruikt voor ON-TARGETplus, Accell, siGENOME en Lincode siRNA) biedt een hoge mate van zekerheid dat het beoogde gen het enige gen zal zijn dat tot zwijgen wordt gebracht.

De primaire bron van door siRNA gemedieerde off-targets is het zaadgebied (nucleotiden 2-7), dat de microRNA-route gebruikt om niet-specifieke gen-uitschakeling te induceren via interacties binnen de 3'-UTR. Het opnemen van uitgebreide bio-informatische strategieën zoals zaadregiofilters en zaadfrequentie-analyse binnen de SMARTselection-ontwerpstrategie minimaliseert microRNA-achtige off-target-activiteit voor verbeterde specificiteit.

Het poolen van siRNA verbetert de effectiviteit

De SMARTpool (beschikbaar voor ON-TARGETplus, Accell, siGENOME en Lincode siRNA) combineert vier genspecifieke siRNA's in een enkele reagenspool. Onderzoek heeft aangetoond dat gepoolde siRNA's:

  • Verbeter de kans op effectieve gene silencing
  • Minimaliseer sequentiespecifieke off-targeting door de relatieve concentratie van elk siRNA . te verlagen
  • De natuurlijke RNAi-route beter nabootsen
  • Verminder valse negatieven veroorzaakt door ontoegankelijke bindingssites

Welk siRNA past bij jou?

Horizon biedt meerdere vooraf ontworpen productlijnen voor het genoom van mensen, muizen en ratten. Gebruik de onderstaande tabel om het optimale siRNA voor uw behoeften te bepalen.

ON-TARGETplus siRNA Chemisch gemodificeerd voor verbeterde specificiteit Accell siRNA Zelfleverende siRNA siGENOME siRNA Kosteneffectieve, efficiënte demping Lincode siRNA Knockdown lang niet-coderend RNA
Aanbevolen voor neuronale, suspensie-, primaire en andere moeilijk te transfecteren cellen
Aanbevolen transfectiereagens DharmaFECT transfectiereagens Niet nodig DharmaFECT transfectiereagens DharmaFECT transfectiereagens
Beschikbaar als individuele siRNA- en SMARTpool-formaten
Gegarandeerde knockdown door SMARTpool en 3 van de 4 siRNA's
Aanpassingen van de detectiestreng om interactie met RISC te voorkomen en de opname van antisense-strengen te bevorderen
Modificaties van het antisense strengzaadgebied om activiteit buiten het doelwit te destabiliseren en de doelspecificiteit te verbeteren
Aangepast om cellulaire opname te vergemakkelijken zonder afzonderlijke transfectiereagentia
Stabiliserende modificaties om door nuclease gemedieerde afbraak te voorkomen
Volgorde-informatie geleverd bij aankoop
Zoeken ON-TARGETplus Zoek Accell Zoek siGENOME Zoek Lincode

SiRNA-screeningbibliotheken

Op RNAi gebaseerde screening met behulp van synthetisch siRNA is een nuttig hulpmiddel voor het begrijpen van een ziekteroute of voor het identificeren van geneesmiddeldoelen. Onderzoekers kunnen een aangepaste screeningbibliotheek ontwerpen met slechts 20 ON-TARGETplus, Accell, Lincode of aangepaste siRNA's met behulp van onze Cherry-Pick Library Tool, of bladeren door onze brede selectie van vooraf gedefinieerde genfamilie- en siRNA-bibliotheken met het hele genoom.

Experimentele ondersteuning

Hulp nodig bij een nieuwe RNAi-techniek? We bieden live wetenschappelijke technische ondersteuning en een uitgebreide verzameling technische bronnen om u op weg te helpen!


Hoe RNAi werkt

De voorwaarde RNA-interferentie (RNAi) werd bedacht om een ​​cellulair mechanisme te beschrijven dat de eigen DNA-sequentie van het gen gebruikt om het uit te schakelen, een proces dat onderzoekers noemen tot zwijgen brengen. In een grote verscheidenheid aan organismen, waaronder dieren, planten en schimmels, wordt RNAi geactiveerd door dubbelstrengs RNA (dsRNA).

Tijdens RNAi wordt lang dsRNA in kleine fragmenten gesneden of "in blokjes gesneden"

21 nucleotiden lang door een enzym genaamd "Dicer". Deze kleine fragmenten, kleine interfererende RNA's (siRNA) genoemd, binden aan eiwitten uit een speciale familie: de Argonaute-eiwitten. Na binding aan een Argonaute-eiwit wordt één streng van het dsRNA verwijderd, waardoor de resterende streng beschikbaar blijft om te binden aan boodschapper-RNA-doelsequenties volgens de regels van basenparing: A bindt U, G bindt C en vice versa. Eenmaal gebonden, kan het Argonaute-eiwit ofwel het boodschapper-RNA splitsen, het vernietigen, of bijkomende factoren rekruteren om de doelsequentie op andere manieren te reguleren.

RNAi wordt veel gebruikt door onderzoekers om genen het zwijgen op te leggen om iets over hun functie te leren. siRNA's kunnen worden ontworpen om met elk gen te matchen, kunnen goedkoop worden vervaardigd en kunnen gemakkelijk aan cellen worden toegediend. Men kan nu commercieel gesynthetiseerde siRNA's bestellen om vrijwel elk gen in de cel van een mens of ander organisme tot zwijgen te brengen, waardoor het tempo van biomedisch onderzoek drastisch wordt versneld. Bovendien maakt het vermogen om de expressie van een enkel gen uit te schakelen RNAi een aantrekkelijke therapeutische benadering voor de behandeling van infectieziekten of genetische aandoeningen, zoals die welke het gevolg zijn van de ongepaste en ongewenste activiteit van een gen, zoals bij veel kankers en neurodegeneratieve ziekten. Er zijn momenteel verschillende klinische onderzoeken die de veiligheid en effectiviteit van siRNA-geneesmiddelen testen.

RNAi is veel meer dan een onderzoekstool. RNAi omvat een reeks oude en geavanceerde cellulaire mechanismen die een verscheidenheid aan biologische functies reguleren. Argonaute-eiwitten binden veel natuurlijk voorkomende kleine RNA's om zich te verdedigen tegen transponeerbare elementen, de chromosoomstructuur en stabiliteit te behouden en de ontwikkelingstiming en differentiatie te reguleren. MicroRNA's vertegenwoordigen bijvoorbeeld een natuurlijke vorm van voor de ontwikkeling belangrijke siRNA's. Net als siRNA's worden microRNA's gemaakt door Dicer, maar microRNA is afgeleid van enkelstrengs RNA's die zichzelf terugvouwen om kleine gebieden van dubbelstrengs RNA te genereren - zogenaamde "stam-loops" - in plaats van het lange dubbelstrengs RNA dat produceert siRNA's. microRNA's kunnen Argonaute-eiwitten begeleiden om boodschapper-RNA's te onderdrukken die onvolledig overeenkomen met het miRNA, waardoor één microRNA honderden genen kan reguleren. Mensen maken meer dan 500 verschillende microRNA's en de ongepaste productie van specifieke microRNA's is in verband gebracht met verschillende ziekten. Geneesmiddelen om ziekteverwekkende microRNA's te remmen, worden nu getest als therapieën voor verschillende menselijke ziekten.


18 maart 2015: The PLOS ONE Staff (2015) Correctie: MysiRNA-Designer: een workflow voor efficiënt siRNA-ontwerp. PLOS ONE 10(3): e0119062. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119062 Bekijk correctie

Het ontwerp van klein interfererend RNA (siRNA) is een multifactorieel probleem dat de aandacht heeft getrokken van veel onderzoekers op het gebied van therapeutische en functionele genomica. MysiRNA score werd eerder geïntroduceerd die de correlatie van de voorspelling van siRNA-activiteit verbetert, rekening houdend met de nieuwste algoritmen. In dit artikel een nieuw programma, MysiRNA-ontwerper, wordt beschreven die verschillende factoren integreert in een geautomatiseerde workflow, rekening houdend met variaties in mRNA-transcripten, toegankelijkheid van siRNA- en mRNA-targets, en zowel bijna perfecte als gedeeltelijke off-target-matches. Het beschikt ook over de MysiRNA score, een hoog gerangschikte gecorreleerde siRNA-effectiviteitsvoorspellingsscore voor het rangschikken van de ontworpen siRNA's, naast de topscoremodellen Biopredsi, DISR, Thermocomposition21 en i-Score, en integreert ze in een unieke siRNA-score-filtratietechniek. Deze multi-score filtratielaag filtert siRNA dat de 90% drempels passeert die zijn berekend op basis van experimentele datasetfuncties. MysiRNA-ontwerper neemt een toetreding, vindt geconserveerde regio's tussen zijn transcriptruimte, vindt toegankelijke regio's binnen het mRNA, ontwerpt alle mogelijke siRNA's voor deze regio's, filtert ze op basis van drempels voor meerdere scores en voert vervolgens SNP en off-target filtratie uit. Deze strikte selectiecriteria werden getest tegen menselijke genen waarin ten minste één actief siRNA was ontworpen uit 95,7% van de totale genen. Bovendien, wanneer getest tegen een experimentele dataset, MysiRNA-ontwerper bleek in staat om 98% van de vals-positieve siRNA's te verwerpen, wat superioriteit aantoont ten opzichte van drie geavanceerde siRNA-ontwerpprogramma's. MysiRNA is een vrij toegankelijke (Microsoft Windows-gebaseerde) desktop-applicatie die kan worden gebruikt om siRNA met een hoge nauwkeurigheid en specificiteit te ontwerpen. wij geloven dat MysiRNA-ontwerper heeft de potentie om hierin een belangrijke rol te spelen.

Citaat: Mysara M, Garibaldi JM, ElHefnawi M (2011) MysiRNA-Designer: een workflow voor efficiënt siRNA-ontwerp. PLoS ONE 6(10): e25642. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0025642

Editor: Szabolcs Semsey, Niels Bohr Instituut, Denemarken

Ontvangen: 12 juni 2011 Geaccepteerd: 8 september 2011 Gepubliceerd: 26 oktober 2011

Auteursrechten: © 2011 Mysara et al. Dit is een open-access artikel dat wordt gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie in elk medium toestaat, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en bron worden vermeld.

Financiering: De auteurs hebben geen steun of financiering te melden.

Concurrerende belangen: De auteurs hebben verklaard dat er geen concurrerende belangen bestaan.


Therapeutisch siRNA: state of the art

RNA-interferentie (RNAi) is een oud biologisch mechanisme dat wordt gebruikt om zich te verdedigen tegen externe invasie. Het kan in theorie alle ziektegerelateerde genen op een sequentiespecifieke manier tot zwijgen brengen, waardoor klein interfererend RNA (siRNA) een veelbelovende therapeutische modaliteit wordt. Na een reis van twee decennia vanaf de ontdekking ervan, zijn twee goedkeuringen van siRNA-therapieën, ONPATTRO ® (patisiran) en GIVLAARI™ (givosiran), bereikt door Alnylam Pharmaceuticals. Als we kijken naar de farmaceutische geschiedenis van de mens op lange termijn, heeft siRNA-therapie momenteel een buitengewone mijlpaal bereikt, aangezien het al is veranderd en zal blijven veranderen in de behandeling en het beheer van ziekten bij de mens. Het kan driemaandelijks, zelfs tweemaal per jaar worden toegediend om therapeutische effecten te bereiken, wat niet het geval is voor kleine moleculen en antilichamen. Het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen was buitengewoon moeilijk, met als doel complexe obstakels te overwinnen, zoals hoe efficiënt en veilig siRNA's aan gewenste weefsels en cellen kunnen worden afgeleverd en hoe de prestaties van siRNA's kunnen worden verbeterd met betrekking tot hun activiteit, stabiliteit, specificiteit en potentieel off-target Effecten. In deze review worden de evolutie van siRNA chemische modificaties en hun biomedische prestaties uitgebreid besproken. Alle klinisch onderzochte en gecommercialiseerde siRNA-afgifteplatforms, inclusief het GalNAc (N-acetylgalactosamine)-siRNA-conjugaat, en hun fundamentele ontwerpprincipes worden grondig besproken. De laatste vooruitgang in de therapeutische ontwikkeling van siRNA wordt ook samengevat. Deze recensie biedt een uitgebreid overzicht en een routekaart voor algemene lezers die in het veld werken.

Belangenconflict verklaring

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Figuren

Schematische illustraties van de werkende…

Schematische illustraties van de werkingsmechanismen van miRNA ( een ) en siRNA…

Structuren van chemische modificaties en...

Structuren van chemische modificaties en analogen die worden gebruikt voor siRNA- en ASO-decoratie. Volgens…

Representatieve ontwerpen voor de chemische…

Representatieve ontwerpen voor de chemische modificatie van siRNA. De sequenties en wijzigingsdetails...

Preklinische en klinische prestaties van…

Preklinische en klinische prestaties van siRNA's met uitgebreide modificatiechemie. een Zin en…

Schema's van representatieve klinisch bestudeerde ...

Schema's van representatieve klinisch bestudeerde siRNA-formuleringen en hun farmacodynamische prestaties. een –…

siRNA-bezorgplatforms die...

siRNA-afgifteplatforms die preklinisch en klinisch zijn geëvalueerd. Soorten lipiden...

Weefsels die het doelwit zijn van siRNA en ...

Weefsels die het doelwit zijn van siRNA- en miRNA-therapieën die momenteel worden onderzocht in de klinische ...


Hoe ontwerp je een siRNA-experiment? - Biologie

Accell siRNA bereikt wat geen enkel ander product kan claimen: levering in moeilijk te transfecteren cellen zonder extra reagentia, virus of instrumenten. Bereik gegarandeerde genuitschakeling in cellen die buiten het bereik van conventionele RNAi-methoden lagen vanwege toxiciteit door transfectiereagentia, elektroporatie of ongewenste virale reacties.

  • Overzicht
  • Werkstroom
  • Garantie
  • formaten
  • Bediening
  • Bibliotheken screenen
  • Gegevensgalerij
Hoogtepunten
  • Nieuwe, gepatenteerde siRNA-modificaties vergemakkelijken passieve opname, bescherming tegen nucleasedegradatie, specificiteit en knockdown-efficiëntie
  • Accell zelfleverend siRNA komt cellen binnen zonder de noodzaak van transfectiereagentia, virale vectortransductie of instrumenten (nucleofectie of elektroporatie)
  • Lage toxiciteit maakt langdurige silencing mogelijk van meerdere doses en tot 30 dagen!
Bewezen prestaties in moeilijk te transfecteren celtypen
  • Immunologische cellen & ndash Jurkat-cellen, primaire T-cellen, lymfocyten, mononucleaire cellen (PBMC), macrofagen
  • Neuronale cellen & ndash primaire neuronen, glioomcellen, organotypische hersenschijfjes
  • Primaire cellen & ndash fibroblasten, cardiomyocyten, & beta-eilandcellen
  • In vivo modellen & ndash hersenen levering, dermale (huid) levering, parodontaal model

Accell-workflow

Het Accell siRNA-toepassingsprotocol vereenvoudigt gerichte gen-knockdown

(1) Combineer Accell-siRNA met Accell-afgiftemedia (of andere lage- of geen-serummedia) (2) Voeg Accell-afgiftemix rechtstreeks aan cellen toe en incubeer gedurende 72 uur.

Experimentele overwegingen

Deze doorbraak in siRNA-afgifte vereist geen transfectiereagens, maar heeft enkele unieke toepassingsvereisten.

  • Accell siRNA works at a higher concentration than conventional siRNA recommended 1µM working concentration.
  • Delivery may be inhibited by the presence of BSA in serum. Optimization studies with serum-free media formulations (Accell Delivery Media) or < 2.5% serum in standard media is recommended.
  • Full-serum media can be added back after 48 hours of incubation, optimal mRNA silencing is typically achieved by 72 hours, or up to 96 hours for protein knockdown.
Our siRNA knockdown guarantee

Accell siRNA reagents (SMARTpool and three of four individual siRNAs) are guaranteed to silence target gene expression by at least 75% at the mRNA level when used under optimized conditions as defined in this featured article.

Learn more about the Accell siRNA knockdown guarantee »
Accell siRNA format options
SMARTpool:

A mixture of 4 siRNA provided as a single reagent providing advantages in both potency and specificity.

Set of 4:

A convenient option for purchasing aliquots of all 4 individual siRNAs targeting a single gene.

Individual siRNAs:

Select 1, 2, 3 or 4 individual siRNAs per gene.

Due to the unique nature of Accell siRNA delivery, it requires a higher working concentration than conventional siRNAs. This table provides the approximate number of reactions (wells) at recommended 1&muM Accell siRNA working concentration in different plate formats (assuming no loss from pipetting).

Effectively optimize Accell siRNA delivery conditions and control for variables in ongoing experiments with fluorescent or unlabeled positive and negative controls. Accell Control Kits combine species-specific validated controls for assessment of Accell technology in your difficult-to-transfect cells. Choose from our selection of positive controls (targeting housekeeping genes), fluorescent or unlabeled negative controls, or an Accell Control Kit. Although Accell siRNA requires no transfection reagent for delivery, it is recommended for use at 1 µM concentration, so be sure to adjust order quantity accordingly.

Accell positive control reagents
Accell cyclophilin B control siRNA

Validated positive control siRNA targeting the Cyclophilin B (PPIB) housekeeping gene in human, mouse, or rat. Accell siRNA requires no transfection reagent or viral vector for delivery into difficult-to-transfect cells.

Accell cyclophilin B control pool

Validated positive control pool of four siRNAs targeting the Cyclophilin B (PPIB) housekeeping gene in human, mouse, or rat. Accell siRNA requires no transfection reagent or viral vector for delivery into difficult-to-transfect cells.

Accell GAPD control siRNA

Validated positive control siRNA targeting the GAPD housekeeping gene in human, mouse, or rat. Accell siRNA requires no transfection reagent or viral vector for delivery into difficult-to-transfect cells.

Accell GAPD control pool

Validated positive control pool of four siRNAs targeting the GAPD housekeeping gene in human, mouse, or rat. Accell siRNA requires no transfection reagent or viral vector for delivery into difficult-to-transfect cells.

Accell green cyclophilin B control siRNA

Validated, fluorescent positive control siRNA targeting the PPIB housekeeping gene in human, mouse, or rat. Cytoplasmic presence of label (FAM) permits qualitative assessment of Accell siRNA passive delivery.

Accell red cyclophilin B control siRNA

Validated, fluorescent positive control siRNA targeting the PPIB housekeeping gene in human, mouse, or rat. Cytoplasmic fluorescence permits qualitative assessment of Accell siRNA passive delivery.

Accell eGFP control siRNA

Validated, fluorescent positive control siRNA targeting the eGFP housekeeping gene in human, mouse, or rat. Cytoplasmic fluorescence permits qualitative assessment of Accell siRNA passive delivery.

Accell eGFP control pool

Validated positive control siRNA pool targeting the green fluorescent protein (eGFP) gene for use in cells from any species. Accell siRNA requires no transfection reagent or viral vector for delivery into difficult-to-transfect cells.

Accell negative control reagents
Accell non-targeting siRNA

A negative control siRNA to determine baseline cellular response to Accell siRNA application. Accell siRNA requires no transfection reagent or viral vector for delivery into difficult-to-transfect cells.

Accell non-targeting pool

A negative control pool of four siRNAs to determine baseline cellular response to Accell siRNA application. Component siRNAs are designed to target no human, mouse, or rat genes.

Accell green non-targeting siRNA

Fluorescent negative control siRNA for assessment of Accell passive delivery technology as determined by cytoplasmic localization of the FAM-labeled Accell siRNA. Designed to target no human, mouse, or rat genes.

Accell red non-targeting siRNA

Fluorescent negative control siRNA for reliable assessment of Accell passive delivery technology as determined by cytoplasmic localization of the DY-547-labeled Accell siRNA. Designed to target no human, mouse, or rat genes.

Accell control siRNA kits
Accell control siRNA kits (green)

A kit containing four validated species-specific positive, negative, and FAM-labeled siRNA controls to assess Accell self-delivering siRNA technology in your difficult-to-transfect cells. Includes resuspension buffer and Accell delivery media.

Accell control siRNA kits (red)

A kit containing four species-specific validated positive, negative,and DY-547-labeled siRNA controls to assess Accell self-delivering siRNA technology in your difficult-to-transfect cells. Includes resuspension buffer and Accell delivery media.

Accell siRNA libraries
Human siRNA libraries

Find the predefined gene family, including Druggable genes or Whole Genome, that&rsquos right for your discovery efforts.

Mouse siRNA libraries

A wide selection of predefined siRNA libraries, including the most up-to-date Whole Mouse genome collection available.

Cherry-pick RNAi libraries

Fast and easy online configuration and ordering of plated siRNA & microRNA reagents targeting your genes of interest.

Custom siRNA synthesis

No pre-designed product to fit your needs? Use our online design tools and extensive synthesis options to create a custom siRNA specific for your application.

Researchers have submitted the following figures to show off their great gene silencing results in their difficult-to-transfect cells using Accell siRNA. If you have data to showcase, fill out this brief form and you will receive instructions on how to submit your data! New data will be added regularly, so check back often!

RNA interference by the Accell system in human skin mast cells

Mast cells were purified from human skin of healthy donors according to our routine protocol (e.g. PMID: 14634065, 15191551, 15666093, 15675967, 20545757, 24671954, 25725371, 26706922, 28264498, 28845295, 28859248), reaching 98-100% purity, and transfected with siRNA as specified by the Dharmacon all siRNAs were used at 1 µM. (A) Cellular uptake of siRNA, as measured by fluorescence microscopy using PE-labeled (non-targeting) siRNA (24 h after transfection). (B) and (C) relative gene expression in cells transfected with non-targeting siRNA versus siRNA targeting either GAPDH or Cyclophilin B, measured by RT-qPCR (48 h post-transfection) and normalized to control expression given as 1. Mean ± SEM of n = 6-9 individual experiments. Note that the knockdown was both highly efficient and specific, as only the targeted RNA was downregulated, while the Cyclophilin B-specific siRNA had no impact on GAPDH expression and vice versa. ** p < 0.01 *** p < 0.01 ****p < 0.0001 by Kruskal-Wallis test with multiple comparisons (GraphPad Prism 7.0 software). NS = not significant.

Submitted by Magda Babina, PhDDepartment of Dermatology and Allergy, Universitätsmedizin Berlin

Accell siRNA delivery and gene silencing in cardiomyocytes

Neonatal rat ventricular myocytes were incubated with 1 &muM Accell Green (A Cat# D-001950-01) or Red (B Cat# D-001960-01) Non-targeting siRNA for 72 hours in Accell delivery media (Cat# B-005000). Nuclei were stained with DAPI (blue). Labeled control uptake showed diffuse cytoplasmic localization in nearly all cells. The bar graph indicates the level of gene silencing achieved with Accell GAPD Control siRNA (Cat# D-001930-03) and Pool (Cat# D-001930-30) control reagents when used with neonatal rat ventricular myocyte (NRVM) media or Accell delivery media. Myocytes were prepared as described in Maass AH & Buvoli M. Cardiomyocyte preparation, culture, and gene transfer. Methods in Molecular Biology 2007366: 321-30. mRNA expression was determined by QuantiGene branched DNA assay (Panomics).


How to Design an siRNA Experiment? - Biologie

How does SVM work?
Consider a two-class classification problem shown schematically below. The mathematical problem of classifying the samples in blue and orange is to find a hyperplane that will best separate the two classes. For the data shown on the left, the best accuracy one can achieve is 75%. However, in a space that is bend (shown on the right), a hyperplane can be found to achieve perfect classification.

Mathematically the space transformation is achieved by using the kernel functions, which defines distance measures in the new space. In addition, SVM uses only data points close to class boundaries for prediction, thus may be less sensitive to noises in the data.

To use SVM, one must first train the SVM to obtain a model. Different model/kernel combinations should be tried to achieve the lowest error rate as determined by the validation. The online version does not allow you to change kernel parameters. You may obtain the stand-alone version if you would like to further improve your model

Please help to improve SVM RNAi
The SVM RNAi 2.0 is trained using 100 RNAi sequences from published papers and 750 sequences randomly picked from rodent cDNA sequences. The model has a 10-fold cross-validation accuracy of

90%. Note fewer RNAi sequences are predicted compared to the rule-based algorithms. Greater than 50% of RNAi sequences predicted by the rule-based algorithms are not predicted to be good candidates by the SVM.

The problem we have is to find a few good siRNA targets. The solution to this problem is simple in principle. All we need to do is to reject more bad siRNA target than good siRNA target, then good targets will be enriched in the remaining pool. Suppose we have 10 good targets among 40 bad targets, if we reject 80% good targets and 95% bad targets, there will be only 2 good targets and 2 bad targets left. We have increased our chance of success by 2.5 folds.

To achieve this, we have optimized our SVM machine to reject as many bad siRNA targets as possible even though we may reject many of the good targets. Enrichment in good targets is ensured because bad targets are 1.3-2.5 times more likely being rejected compared to good targets. See Figure 1 for details.

Does SVM RNAi use the rules such as AARN17YTT?

This is frequently a source of confusion. SVM RNAi is a learning program. It starts with no rules at all. By learning from training data, it comes up with a decision function for testing whether a particular sequence is a good siRNA candidate. The decision function is usually complex and may or may not be interpreted as simple rules.

On the other hand, since the majority of the good siRNAs in the training data do satisfy the Tuschl s rules (AARN17Y), a large fraction of targets predicted by SVM RNAi do satisfy Tuschl s rules. However it is not equivalent to say SVM RNAi uses Tuschl s rules. Many sequences satisfying the Tuschl s rules are ruled out by SVM RNAi. Apparently, there are additional restrictions from SVM RNAi.

What is the success rate of SVM RNAi?

Before talking about success rate, we must define success. We set a high standard for a good siRNA target: (1) the knockdown must be detected at the protein level (2) the level of knockdown must be reproducible and significant (good for publication).

On the training set SVM RNAi achieved a 10-fold cross validation rate of

90%. On independent sets, the overall accuracy is 50-70% for SVM RNAi 2 and 60%-80% for SVM RNAi 3.6.

The overall rate is the success rate in predicting both positives and negatives. SVM RNAi 3.6 is not optimized for best overall success rate. It is optimized to reduce the false-positive rate --- the rate that matters most to researchers. SVM RNAi 3.6 can reduce false-positive rate by as much as 50%.

If I choose 100 targets use SVM RNAi 3.6, how many will be good targets?

Unfortunately the success rate can't be computed directly from the SVM model. The best estimate we can give is the fail rate:

50% * (Tuschl's rule fail rate).

Have you trained and tested your model using experimental data that measured mRNA level by real-time RT-PCR?

No, we excluded all data that didn't show a knockdown at the protein level. A small decrease in mRNA level may not lead to a significant decrease in protein level since the translation machinery may compensate for the decrease in mRNA. If a siRNA also suppresses translation, then the change in the protein level will be greater. Furthermore, antisense RNA may also cause a decrease in the mRNA level as measured by real-time RT-PCR (Vickers et al, J Biol Chem. 278(9):7108-18).

What do you mean SVM RNAi 3.6 can reduce false-positive rate by as much as 50%?

If you have designed five siRNAs using the rules most people have used and only one showed specific siRNA activity, your false-positive rate is 4/5=80%. Reducing the false-positive rate by 50% means that the new false-positive rate will be 80% * 50% = 40%, i.e., only 2 (5 * 40%) siRNAs will not have specific activities if five targets are selected by SVM RNAi 3.6.

If I reject all siRNA candidates, my false-positive rate will be 0.

SMV RNAi does not randomly reject siRNA targets. It is tested to ensure that the probability of rejecting a good siRNA target is less than the probability of rejecting a bad siRNA target. As a result the remaining pool of siRNAs are enriched in good siRNA targets. See Figure 1 for detailed statistics.

Why do I need the stand-alone version?

The stand-alone SVM RNAi is version 3.6 while the online one is version 2.0. Version 3.6 is trained and tested with a larger set of published siRNA sequences compared to version 2.0 (

The stand-alone version allows users to eliminate siRNAs with multiple targets. Blast may also be used for this step. Blast is time consuming and results may not be clear especially when close family members exist. It is easy to overlook Blast results.

Why do you eliminate siRNAs with only 15-base match to more than one gene?

Although a single mismatch may abrogate silencing, recent findings suggest that shorter matches may translationally repress untargeted genes (Semizarov et. al., PNAS 100(11), 6347-6352 Doench et. al., Genes Dev. 17(8):991-1008 Jackson et. al., Nature Biotech. 21(6): 635-637). Furthermore 15-base match to untargeted genes may nevertheless decrease effective siRNA concentration. For this reason any siRNA duplex (in two directions) with a potential of binding to more than one gene will be eliminated.

What is the user experience?

User feedbacks so far are in general positive. Performances of SVM 3.6 on data provided by users are better or as good as on published data.

Does SVM RNAi work for hairpin siRNA?

There is no strong reason to suspect hairpin siRNA will have a different set of rules for target selection. The SVM model is not trained separately for hairpin siRNA.

How do I get SVM RNAi 3.6?

THIS SOFTWARE IS PROVIDED BY CHANG BIOSCIENCE ``AS IS'' AND ANY EXPRESS OR IMPLIED WARRANTIES, INCLUDING, BUT NOT LIMITED TO, THE IMPLIED WARRANTIES OF MERCHANTABILITY AND FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE ARE DISCLAIMED. IN NO EVENT SHALL CHANG BIOSCIENCE OR ITS SPONSORS BE LIABLE FOR ANY DIRECT, INDIRECT, INCIDENTAL, SPECIAL, EXEMPLARY, OR CONSEQUENTIAL DAMAGES (INCLUDING, BUT NOT LIMITED TO, PROCUREMENT OF SUBSTITUTE GOODS OR SERVICES LOSS OF USE, DATA, OR PROFITS OR BUSINESS INTERRUPTION) HOWEVER CAUSED AND ON ANY THEORY OF LIABILITY, WHETHER IN CONTRACT, STRICT LIABILITY, OR TORT (INCLUDING NEGLIGENCE OR OTHERWISE) ARISING IN ANY WAY OUT OF THE USE OF THIS SOFTWARE, EVEN IF ADVISED OF THE POSSIBILITY OF SUCH DAMAGE.


Bekijk de video: РНК-интерференция: разделка, нарезка и обслуживание ваших клеток Алекс Дайнис (Januari- 2022).