Informatie

Halorhodospira halophila - Biologie


Halorhodospira halophila (voorheen Ectothiorhodospira halophila) is een extreem halofiele paarse bacterie die tot voor kort officieel lid was van het geslacht Ectothiorhodospira. fylogenetisch, Halorhodospira halophila is geassocieerd met de gamma-onderverdeling van de phylum Proteobacteria en staat bekend als fototroof en Gram-negatief. Dit toont belangrijk aan dat ruwe omgevingen waarvan ooit werd gedacht dat ze exclusief waren voor archaea, eigenlijk ook bacteriën bevatten.


Substraatbindend gebied van ABC-type glycine-betaïnetransportsysteem

<p>De annotatiescore biedt een heuristische maatstaf voor de annotatie-inhoud van een UniProtKB-item of proteoom. Deze score <strong>kan niet</strong> worden gebruikt als maatstaf voor de nauwkeurigheid van de annotatie, aangezien we de 'juiste annotatie' voor een bepaald eiwit niet kunnen definiëren.<p><a href='/help/annotation_score' target='_top'> Meer. </a></p> - Eiwit voorspeld i <p>Dit geeft het type bewijs aan dat het bestaan ​​van het eiwit ondersteunt. Merk op dat het 'eiwitbestaan'-bewijs geen informatie geeft over de nauwkeurigheid of correctheid van de weergegeven sequentie(s).<p><a href='/help/protein_existence' target='_top'>Meer. </a></p>

Selecteer een sectie aan de linkerkant om inhoud te zien.


Licht oogstend eiwit B800/850/890 alfa-3-keten

<p>De annotatiescore biedt een heuristische maatstaf voor de annotatie-inhoud van een UniProtKB-item of proteoom. Deze score <strong>kan niet</strong> worden gebruikt als maatstaf voor de nauwkeurigheid van de annotatie, aangezien we de 'juiste annotatie' voor een bepaald eiwit niet kunnen definiëren.<p><a href='/help/annotation_score' target='_top'> Meer. </a></p> - Experimenteel bewijs op eiwitniveau i <p>Dit geeft het type bewijs aan dat het bestaan ​​van het eiwit ondersteunt. Merk op dat het 'eiwitbestaan'-bewijs geen informatie geeft over de nauwkeurigheid of correctheid van de weergegeven sequentie(s).<p><a href='/help/protein_existence' target='_top'>Meer. </a></p>

Selecteer een sectie aan de linkerkant om inhoud te zien.


Halorhodospira Halophila

3.2 De fotocyclus van de fotoactieve gele proteïne

Het PYP, dat voor het eerst werd ontdekt in het cytoplasma van Halorhodospira halophila bacterie, is een cytoplasmatische blauwlichtfotoreceptor die de negatieve fototaxisroute initieert. Bij fotobestraling ondergaat de chromofoor van PYP een volledig omkeerbare fotocyclus, beginnend bij een pG in donkere toestand en vervolgens door twee vroege spectroscopische tussenproducten I0 en ik0 ‡ dat kan gelijk zijn aan IT en ICP, respectievelijk. Na de initiële relaxatie vervalt wt-PYP snel tot een rood verschoven intermediair pR. Het precieze mechanisme voor het genereren van pR is echter nog steeds onduidelijk. Ihee et al. (Jung et al., 2013 Kim et al., 2012) stelde voor dat IT gelijktijdig kan vervallen tot de twee tussenproducten pR1 en pR2 (via ICP) door een parallelle isomerisatiereactie, terwijl Zimányi et al. (Koroshyy et al., 2013) stelde een ander mechanisme voor dat pR2 wordt geproduceerd na pR1 via een opeenvolgende reactie. In beide mechanismen is de intermediaire pR2 ondergaat een protoneringsreactie om één proton van het Glu46-residu te vangen, wat leidt tot een blauw verschoven intermediair pB′ en een energetisch onstabiel, geladen Glu46 . De Glu46 − veroorzaakt een grote conformationele verandering in het eiwit, ontspant tot een vermeende signaleringstoestand pB die een nieuw blauw verschoven intermediair vormt. Ihee et al. ( Kim et al., 2012 ) publiceerde ook een andere mogelijkheid dat de pB rechtstreeks vanuit pR . kan worden bereikt1 omdat ze overeenkomsten vertonen in de chromofoororiëntatie en de omringende waterstofbindingsnetwerken. Uiteindelijk wordt de fotocyclus voltooid via een reeks deprotonerings- en heromerisatieprocessen. Een structureel herstel van PYP wordt bereikt door een nieuwe intermediaire pG′ met een gedeprotoneerde chromofoor die het optreden van heromerisatie vergemakkelijkt. Identificeer alle mogelijke tussenproducten in de fotocyclus van PYP is een belangrijke uitdaging voor zowel experimenteel als theoretisch onderzoek. Omdat er zoveel discussiepunten zijn, zoals de parallelle versus sequentiële kinetische routes, de toewijzing van verschillende tussenproducten en de identiteit van de donor en acceptor voor protonoverdracht in de meerstaps protonatie-deprotonatiereactie, Chen en Fang et al. (Wei et al., 2014) voeren een uitgebreide computationele studie uit om het algehele proces aan te pakken met behulp van een gecombineerde QM/MM-benadering, op het niveau van de theorie van CASPT2/CASSCF/AMBER. Bij de berekening van de beperkte Europarlementariërs langs de fysiek gemotiveerde reactiecoördinaten die alle mogelijke foto-isomerisatie- en protonoverdrachtsprocessen modelleren, worden de pCA-chromofoor en zijn aangrenzende residuen (volledig of gedeeltelijk) evenals de kristalwatermoleculen opgenomen in het QM-subsysteem, terwijl de resterende residuen, watermoleculen en tegenionen werden behandeld met MM. Er werden verschillende QM/MM-partities aangenomen om rekening te houden met verschillende stappen in de fotocyclus van PYP. De eerste stap van foto-isomerisatie wordt beschreven met QM1, die de pCA-chromofoor en een deel van de Glu46- en Cys69-residuen omvat. De laatste isomerisatiestappen ICP → pR2 en pR1 → pR2, evenals daaropvolgende processen, waarbij twee typische structurele vervormingen betrokken zijn via de gelijktijdige torsie langs twee niet-aangrenzende of aangrenzende bindingen, worden beschreven door QM2 met het hele Cys69-residu inbegrepen. Om de MEP's van de protonatie-deprotonatiestappen te berekenen, zijn respectievelijk één en drie kristalwatermoleculen toegevoegd aan de subsystemen QM3 en QM4. Voor de QM3 werd ook een deel van Tyr42 toegevoegd om rekening te houden met zijn rol als protonoverdrachtrelais.

Hun studie geeft een uitgebreid beeld van de algemene fotocyclus van de isomerisatie- en protoneringsreacties bij de foto-excitatie van het wildtype PYP. Zoals geïllustreerd in Schema 3, na fotobestraling tot S1(1 ππ*) staat, isomeriseert de pG langs b-binding via één-binding flip (OBF) naar CI (S0/S1), gevolgd door "hula twist" (HT), "fietspedaal" (BP) en OBF-isomerisatiereacties om cis isomeren pR1, LCP, en ikCT, respectievelijk. De pB kan worden bereikt door ofwel protonering van pR1 of ikCP → pB-overgang. beginnend bij ICP, moet een barrière van 16,2 kcal/mol fietspedaalisomerisatie worden overschreden om een ​​tussenliggende pR . te vormen2, met een snelle protoneringsreactie (6,1 kcal/mol) om pB′ te krijgen. Er is nog een hoge barrière van 28,4 kcal/mol die moet worden overwonnen door isomerisatie van fietspedaal en een omgekeerde OBF-isomerisatie, wat leidt tot een hydrofobe-hydrofiele transformatie en de vorming van pB. Daarna trekt de blootgestelde COO −-groep van Glu46 wateroplosmiddel aan in de bindingsholte en triggert de snelle deprotoneringsreactie van pCA. De fotocyclus wordt uiteindelijk voltooid door het terugwinnen van de fenoxyring die watermoleculen afstoot uit de bindingsholte door een OBF-isomerisatie met een grote barrière van 36,6 kcal/mol. Hun studies onthullen dat het parallelle mechanisme via pR1 → pB-transitie is een gunstig kanaal, maar bestaat naast het sequentiële model via de pR1 → pR2 transformatie.

Schema 3 . Mechanistische illustratie van de algehele PYP-fotocyclus: de protonatie-deprotonatie en isomerisatiereacties van de hula-twist (HT), het fietspedaal (BP) en de one-bond flip (OBF) worden weergegeven in blauw (lichtgrijs in de gedrukte versie) samen met de speciale één of twee bindingen en de bijbehorende barrières (kcal/mol) zijn ook rood gemarkeerd (lichtgrijs in de printversie).

Van Wei et al. (2014), gereproduceerd met toestemming van de PCCP Owner Societies.


Genoomsequencing en annotatie

Geschiedenis van het genoomproject

Dit organisme werd geselecteerd voor sequencing om zijn halofiele aanpassingen, zijn ongebruikelijke zwavelmetabolisme, zijn fotosynthetische routes beter te begrijpen en om een ​​raamwerk te bieden voor een beter begrip van signaalroutes voor fotoactief geel eiwit. De volledige genoomsequentie is gedeponeerd in GenBank. Sequentiebepaling, afwerking en annotatie werden uitgevoerd door het DOE Joint Genome Institute (JGI). Tabel 2 geeft de projectinformatie en de associatie met MIGS versie 2.0-compliance [25].

Groeiomstandigheden en DNA-isolatie

H. halophila SL1-stam DSM 44 T werd verkregen van Deutsche Sammlung vor Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, Duitsland, en werden gekweekt in DSMZ 253-medium. De cellen werden anaëroob en fotosynthetisch gekweekt door ze in glazen kweekbuizen van 20 ml te plaatsen die volledig gevuld waren met groeimedium en afgesloten met schroefdoppen. De buizen werden op 42ºC in een waterbad gehouden en verlicht met 70 W wolfraamlampen. Chromosomaal DNA werd gezuiverd uit de resulterende celculturen met behulp van de CTAB-procedure.

Genoomsequencing en assemblage

De random shotgun-methode werd gebruikt bij het sequeneren van het genoom van H. halophila SL1. Grote (40 kb), mediaan (8 kb) en kleine (3 kb) insert random sequencing bibliotheken werden gesequenced voor dit genoomproject met een gemiddeld slagingspercentage van 88% en gemiddelde leeslengtes van hoge kwaliteit van 750 nucleotiden. Na de shotgun-fase werden de reads geassembleerd met parallelle phrap (High Performance Software, LLC). Mogelijke verkeerde assemblages werden gecorrigeerd met Dupfinisher (niet gepubliceerd, C. Han) of door transposon-bombardementen van overbruggende klonen (EZ-Tn5 <P6Kyori/KAN-2> Tnp Transposome-kit, Epicenter Biotechnologies). Hiaten tussen contigs werden gedicht door bewerking, aangepaste primerwandelingen of PCR-amplificatie. De voltooide genoomsequentie van H. halophila SL1 bevat 36.035 uitlezingen, waarmee een gemiddelde van 12-voudige sequentiedekking per base wordt bereikt met een foutenpercentage van minder dan 1 op 100.000.

Genoomannotatie

Identificatie van vermeende eiwitcoderende genen en initiële geautomatiseerde annotatie van het genoom werd uitgevoerd door de Oak Ridge National Laboratory genoomannotatiepijplijn. Aanvullende genvoorspellingsanalyse en functionele annotatie werd uitgevoerd binnen het IMG-platform [41].


Zijketenspecifieke isotopenlabeling van eiwitten voor infrarood structurele biologie: het geval van ring-D4-tyrosine-isotooplabeling van fotoactief geel eiwit

Een belangrijk knelpunt bij het gebruik van infraroodspectroscopie als krachtig hulpmiddel voor het verkrijgen van gedetailleerde informatie over de eiwitstructuur is de toewijzing van vibratiemodi aan specifieke aminozuurresiduen. Side-chain specifieke isotopische labeling is een algemene benadering voor het verkrijgen van dergelijke opdrachten. We rapporteren een methode voor het bewerken van isotoop met hoge opbrengst van het bacteriële blauwlichtsensor fotoactief geel eiwit (PYP) dat ring-D(4)-Tyr bevat. PYP werd heteroloog overgeproduceerd in Escherichia coli in minimale media die ring-D(4)-Tyr bevatten in aanwezigheid van glyfosaat, dat de endogene biosynthese van aromatische aminozuren (Phe, Trp en Tyr) remt. Massaspectrometrie van het intacte eiwit en van tryptische peptiden toonde ondubbelzinnig zeer specifieke labeling aan van alle vijf Tyr-residuen in PYP met 98% incorporatie en niet-detecteerbare isotopische scrambling. FTIR-spectroscopie van het eiwit onthult een karakteristieke Tyr-ringtrillingsmodus bij 1515 cm (-1) die is verschoven naar 1436 cm (-1), consistent met die van ab initio-berekeningen. PYP is een modelsysteem voor structurele dynamiek van eiwitten en voor receptoractivering bij biologische signalering. De hier beschreven resultaten openen de weg naar de analyse van PYP met behulp van isotoop-bewerkte FTIR-spectroscopie met zijketenspecifieke labeling.


Interactie van een fotochroom UV-sensoreiwit Rc-PYP met PYP-bindend eiwit

Fotoactief geel eiwit (PYP) van Halorhodospira halophila is een van de typische lichtsensor-eiwitten. Hoewel de fotoreactie ervan uitgebreid is bestudeerd, is tot op heden geen stroomafwaarts partnereiwit geïdentificeerd. In deze studie werd de intermoleculaire interactiedynamiek waargenomen tussen PYP van Rhodobacter capsulatus (Rc-PYP) en een mogelijk stroomafwaarts eiwit, PYP-bindend eiwit (PBP), werden bestudeerd. Er werd gevonden dat UV-licht een langlevend product (pUV*) induceerde, dat een interactie aangaat met PBP om een ​​stabiel heterohexameer te vormen (Complex-II). Het reactieschema voor deze interactie werd onthuld met behulp van tijdelijke absorptie- en transiënte roostermethoden. Tijdsopgeloste diffusiedetectie toonde aan dat een hetero-trimeer (Complex-I) tijdelijk wordt gevormd, dat Complex-II produceerde via een tweede-orde reactie. Alle andere tussenproducten, waaronder die van pBL, hebben geen interactie met PBP. Het reactieschema en de kinetiek worden bepaald. Interessant is dat langlevende Complex-II dissocieert bij excitatie met blauw licht. Deze resultaten tonen aan dat Rc-PYP een fotochrome en nieuw type UV-sensor is, waarvan het signaalproces vergelijkbaar is met dat van andere lichtsensoreiwitten in het zichtbare lichtgebied. De fotochrome heterogene intermoleculaire interacties gevormd tussen PYP en PBP kunnen worden gebruikt als een nieuw en nuttig hulpmiddel in de optogenetica.


Structuur en mechanistische kenmerken van de prokaryotische minimale RNase P

Endonucleolytische verwijdering van 5'-leadersequenties van tRNA-precursortranscripten (pre-tRNA's) door RNase P is essentieel voor eiwitsynthese. Naast RNA-gebaseerde RNase P-enzymen, oefenen alleen-eiwitversies van het enzym deze functie uit in verschillende Eukarya (hier PRORP's genoemd) en in sommige bacteriën (Aquifex aeolicus en naaste verwanten) behoren beide enzymtypen tot verschillende subgroepen van de metallonucleasesuperfamilie van het PIN-domein. homologen van Aquifex RNase P (HARP's) komen ook tot expressie in sommige andere bacteriën en veel archaea, waar ze naast op RNA gebaseerd RNase P bestaan ​​en niet de belangrijkste RNase P-activiteit vertegenwoordigen. Hier hebben we de structuur van de bacteriële HARP van Halorhodospira halophila door cryo-EM en onthult een nieuwe schroefachtige dodecamere assemblage. Biochemische experimenten tonen aan dat oligomerisatie vereist is voor RNase P-activiteit van HARP's. We stellen voor dat het tRNA-substraat bindt aan een verlengd spike-helix (SH) -domein dat uitsteekt uit het schroefachtige samenstel om het 5'-uiteinde in de nabijheid van de actieve plaats van de naburige dimeersubeenheid te positioneren. De structuur suggereert dat eukaryote PRORP's en prokaryotische HARP's dezelfde structurele elementen van pre-tRNA's herkennen (tRNA-ellebooggebied en splitsingsplaats). Onze analyse levert dus de structurele en mechanistische basis voor pre-tRNA-verwerking door het prokaryotische HARP-systeem.


Deuterium-isotoopeffecten in de fotocyclusovergangen van het fotoactieve gele eiwit

Het Photoactive Yellow Protein (PYP) van Halorhodospira halophila (voorheen Ectothiorhodospira halophila) wordt steeds vaker gebruikt als modelsysteem. Als zodanig is een grondig begrip van de fotocyclus van PYP essentieel. In deze studie hebben we informatie van pOH- (of pH-) afhankelijkheid en (kinetische) deuteriumisotoopeffecten gecombineerd om bestaande fotocyclusmodellen uit te werken. Voor verschillende kenmerken van PYP konden we een onderscheid maken tussen pH- en pOH-afhankelijkheid, een niet-triviaal onderscheid bij het vergelijken van gegevens van monsters opgelost in H(2)O en D(2)O. Het blijkt dat de meeste kenmerken van PYP pOH-afhankelijk zijn. We bevestigden het bestaan ​​van een pB'-tussenproduct in de pR-naar-pB-overgang van de fotocyclus. Bovendien konden we aantonen dat de overgang van pR naar pB' omkeerbaar is, wat het eerder waargenomen bi-exponentiële karakter van de pR-naar-pB-fotocyclusstap verklaart. Ook is het absorptiespectrum van pB' enigszins rood verschoven ten opzichte van pB. Het herstel van de pG-toestand gaat gepaard met een omgekeerd kinetisch deuteriumisotoopeffect. Onze interpretatie hiervan is dat voordat de chromofoor kan worden geïsomeriseerd, deze wordt gedeprotoneerd door een hydroxide-ion uit een oplossing. Hieruit stellen we een nieuw fotocyclustussenproduct voor, pB(deprot), waaruit pG wordt gewonnen en dat in evenwicht is met pB. Dit wordt in onze gegevens ondersteund door de combinatie van de waargenomen pOH- en pH-afhankelijkheid, samen met het kinetische deuteriumisotoopeffect.

Figuren

Spectraal deuterium isotoop effect. In…

Spectraal deuterium isotoop effect. In ( EEN ), de gemonteerde spectra van de ...

KDIE verkregen met de eenvoudige ...

KDIE verkregen met het eenvoudige fotocyclusmodel. In ( EEN ) de fotocyclus...

Vergelijking tussen de eenvoudige en ...

Vergelijking tussen het eenvoudige en het complexe model. Gegevens opgenomen op 360 (...

KDIE verkregen met het complex ...

KDIE verkregen met het complexe model. In ( EEN ) het fotofietsmodel...


Invoering

Alle halofiele organismen lopen het risico van cellulaire uitdroging veroorzaakt door de hoge osmotische activiteit van zoute omgevingen, en hebben osmoprotectiestrategieën nodig om te overleven. Aangezien zoute oceanen, zoute meren, binnenzeeën en zoute grondwater

97% van al het water op aarde 1 en zoutafzettingen liggen ten grondslag aan ongeveer een kwart van het land op aarde 2, zoute en hyperzoute omgevingen zijn van grote ecologische betekenis. Bovendien is het zoutgehalte geïdentificeerd als een belangrijke bepalende factor voor de samenstelling van de microbiële gemeenschap 3 . Daarom zijn halofiele aanpassingen van algemeen biologisch belang. Halofiele micro-organismen slagen erin te gedijen in zoute en zelfs hyperzoute omgevingen door de osmotische activiteit van hun cytoplasma te verhogen tot die van de omgeving. Twee soorten osmoadaptieve strategieën worden gebruikt door halofielen en extreme halofielen 4,5,6,7: ofwel de accumulatie van molaire concentraties van KCl of de accumulatie van organische verbindingen zoals glycine-betaïne-compatibele opgeloste stoffen in hun cytoplasma 8,9,10,11 . Welke van deze twee belangrijkste osmoprotectiestrategieën een organisme gebruikt, heeft ingrijpende implicaties voor zijn ecologie, fysiologie, biochemie en evolutionaire geschiedenis.

Organische osmolyten interfereren niet met de functionele eigenschappen van cytoplasmatische componenten 10,12,13,14 en worden daarom compatibele opgeloste stoffen genoemd. Voor organismen die deze strategie voor osmobescherming gebruiken, is het daarom voldoende om compatibele opgeloste stoffen te accumuleren, hetzij door opname uit het extracellulaire medium of door biosynthese. De biosynthese van molaire concentraties van organische osmoprotectanten vertegenwoordigt echter een grote investering in termen van ATP, reducerende equivalenten en koolstof 5 . Daarentegen zijn hoge concentraties KCl over het algemeen toxisch voor verschillende cytoplasmatische enzymen 15 . In organismen die KCl als hun belangrijkste osmoprotectant gebruiken, wordt het profiel van iso-elektrische punten van het gehele proteoom verschoven naar zure waarden 16,17,18,19,20,21,22,23. Aangenomen wordt dat een dergelijke zuurgraad van het proteoom de enzymfunctie in het zoute cytoplasma 19,20,21,24,25 mogelijk maakt, maar er wordt aangenomen dat het organisme permanent hoge niveaus van cytoplasmatisch KCl moet handhaven. Zodra een organisme een zuur proteoom heeft ontwikkeld, is een belangrijk voordeel dat KCl een bio-energetisch goedkope osmoprotectant is. Haloarchaea zoals Halobacterium salinarum leunen bijna volledig op KCl, terwijl veel halofiele bacteriën overwegend glycine-betaïne gebruiken 26,27 . Bijna alle halofielen en extreme halofielen waarvoor osmoprotectieve niveaus zijn gerapporteerd, gebruiken uitsluitend KCl of compatibele opgeloste stoffen als hun belangrijkste osmoprotectanten 4,5,6. Deze overkoepelende visie die het denken over de tweeledige aard van osmoprotectiestrategieën heeft geleid, is op de proef gesteld door recente experimentele resultaten 28,29, die ons ertoe hebben aangezet de hier gerapporteerde onderzoeken uit te voeren.

De meeste kennis over halofiele osmoprotectiestrategieën is verkregen door uitgebreide studies van een zeer klein aantal organismen, met name de Archaeon Halobacterium salinarum 17 en Salinibacter ruber (Bacteroidetes) 22,30. Daarom wilden we de osmoprotectiestrategie van extreme halofielen van andere bacteriële phyla onderzoeken, en selecteerden we twee nauw verwante 31 extreem halofiele paarse fotosynthetische Proteobacteriën: Halorhodospira halophila 32 en Halorhodospira halochloris 33 . Terwijl H. halochloris waarvan is aangetoond dat het glycine-betaïne als belangrijkste osmoprotectant gebruikt 34 , vonden we dat: H. halophila accumuleert voornamelijk molaire concentraties van KCl 28 . Dit resultaat impliceert een relatief recente en dramatische evolutionaire verandering in de osmoprotectiestrategie. Onverwacht vonden we dat bij een lager zoutgehalte (ongeveer dat van zeewater) H. halophila behoudt een zuur proteoom maar accumuleert geen cytoplasmatisch KCl boven de niveaus gevonden in E coli 28 . Deze waarneming volgt niet de verwachting dat zure proteomen in halofielen hoge niveaus van KCl nodig hebben om functioneel te zijn. Bovendien bleek uit verder onderzoek dat veel Halobacteriën zijn niet beperkt tot het gebruik van KCl als hun osmoprotectant maar gebruiken organische osmoprotectanten 29 . Alles bij elkaar genomen impliceren deze waarnemingen een onverwachte diversiteit in osmoprotectiemechanismen. Hoewel wordt aangenomen dat de meeste extreme halofielen hun osmoprotectiestrategie wijden aan het gebruik van KCl of organische osmoprotectanten, rapporteren we hier het bestaan ​​van een "omoprotection switch" in H. halophila, waardoor dit organisme kan schakelen tussen de KCl- en organische osmoprotectieve strategieën, afhankelijk van de omgevingsomstandigheden.


Discussie

HiPIP II is de fysiologische elektronendonor van de fotosynthetische RC in H. halophila. Zoals hierboven beschreven, is een significante fractie van HiPIP aanwezig in het periplasma van H. halophila cosedimenten met het membraan tijdens de bereiding van chromatoforen. Deze HiPIP is geïdentificeerd als HiPIP II. De feiten die deze HiPIP (l) kan worden gefotooxideerd in geïmmobiliseerde monsters en (ii) aan de membranen is gebonden in een goed gedefinieerde conformatie in foto-geoxideerde of chemisch geoxideerde monsters, tonen aan dat een deel, zo niet alles, van HiPIP II een strak en elektronoverdracht competent complex vormt met de RC. De kinetiek van door licht geïnduceerde absorptieveranderingen bevestigen het bestaan ​​van dit complex en tonen aan dat de overdracht van HiPIP naar P+-elektronen wordt gemedieerd door een cytochroomsubeenheid. Een koppelingsplaats voor HiPIP II op deze subeenheid komt overeen met de waarneming dat ruwe extracten van HiPIP II die een cytochroomcomponent bevatten de g1 = 2.10 signaal. De kinetische gegevens leveren a t 1/2 van ≤11 μs voor elektronendonatie van HiPIP aan de cytochroomsubeenheid.

De resultaten tonen daarom aan dat HiPIP II de elektronendrager is die de RC-in H. halophila door middel van een cytochroomsubeenheid (momenteel is er geen bewijs voor betrokkenheid van een andere elektronendrager). Zowel de optische als de EPR-experimenten laten een substoichiometrische oxidatie van het RC-gebonden HiPIP zien. Een groot deel van deze "ontbrekende" HiPIP-foto-oxidatie kan worden toegeschreven aan de evenwichtsconstante tussen P+ en HiPIP. De waargenomen sterke vertraging van de donatiereactie van de cytochroom-subeenheid naar P+ en de afname van de mate van P+-oxidatie die het omringende redoxpotentieel verhoogt, levert bewijs voor een significant lagere ΔE m tussen P+, heem en HiPIP in het gekoppelde systeem (bij omgevingspotentiaal waar het hoge potentiaalpaar is verminderd) dan verwacht op basis van evenwichttitraties. Effecten van elektrostatische interacties op kinetische reacties in RC's zijn gedetailleerd beschreven in ref. 38.

HiPIP II van H. halophila Toont sterk variabele EPR- en Redox-eigenschappen. De aan RC gebonden HiPIP II heeft EPR-spectra die significant verschillen van de spectra die in dit werk zijn gepubliceerd en bevestigd voor de oplosbare HiPIP II. Ironisch genoeg is de verschuiving van G 1 van 2,10 in de RC-gebonden toestand tot 2,14 in het gezuiverde eiwit is gedocumenteerd in twee eerdere artikelen (26, 31) maar is eerder over het hoofd gezien. Van alle HiPIP's die in het verleden zijn bestudeerd, is de oplosbare HiPIP II van H. halophila valt op door zijn spectrale eenvoud. Hoewel HiPIP's typisch "gecompliceerde" EPR-spectra vertonen die waarschijnlijk voortkomen uit de superpositie van twee of meer paramagnetische centra, is het spectrum van oplosbare H. halophila HiPIP II kan worden gesimuleerd door een enkele paramagnetische soort met G 1 om 2.14, G 2 op 2.034, en G 3 op 2.024 (33). NMR-gegevens suggereren dat de "eenvoud" van de HiPIP II EPR-soort voortkomt uit een enkele positionering van het gemengde valentiepaar in de geoxideerde cluster (39), in tegenstelling tot twee of meer permutaties van dit paar tussen de vier ijzeratomen van de cubaan in andere HiPIP's. Zoals hierboven getoond, verschilt deze enkele paramagnetische soort in het gezuiverde eiwit van de enkele paramagnetische soort in de RC-gebonden HiPIP II. Interactie van HiPIP II met de cytochroomsubeenheid verandert dus hoogstwaarschijnlijk een andere gemengde valentiepaardistributie in de laagste energietoestand, wat resulteert in onderscheidbare paramagnetische soorten in oplosbaar en RC-gebonden HiPIP. een toeschrijving van G-tensor naar moleculaire assen is bepaald voor HiPIP II op basis van elektron-nucleaire dubbele resonantie (ENDOR) resultaten (33). De waarschijnlijke verandering van de lokalisatie van gemengde valentie sluit helaas een structurele interpretatie van de G-tensororiëntaties bepaald in ons werk.

Samengevat, hoewel de moleculaire basen voor de waargenomen E m en paramagnetische variabiliteiten zijn op dit moment niet duidelijk, maar toch (l) een uitstekend hulpmiddel bieden voor het analyseren van de interacties van HiPIP II met zijn redox-partners en (ii) stellen ons in staat om de functionele energie van de H. halophila elektronenoverdrachtsketen (zie volgende paragraaf).

De oplossing voor het 'Redox Enigma'. Voorheen was de lage E m waarden van de twee iso-HiPIP's van H. halophila (+50 mV en +110 mV bepaald bij laag zoutgehalte en in geïsoleerde toestand) (40) werden gebruikt als bewijs tegen hun betrokkenheid bij fotosynthetische elektronenoverdracht. De Em waarden van P/P + in de RC en het Rieske centrum in de bc 1 complex werd stilzwijgend verondersteld in het typische bereik voor paarse bacteriën te liggen (d.w.z. +400 tot +500 mV voor P/P + en +250 tot +340 mV voor Rieske). In dit werk wordt E m van HiPIP II bij fysiologische zoutconcentraties en in de gecomplexeerde toestand werd vastgesteld op +140 ± 20 mV. In onze studies van H. halophila, maten we de redoxpotentialen van P/P+ en de hemes die aanwezig zijn in de cytochroomsubeenheid van de fotosynthetische RC, evenals de redoxpotentiaal van het Rieske-cluster van de bc 1 complexe (37). De Em waarden van P/P + en van het Rieske centrum in H. halophila bleken respectievelijk +270 mV en +120 ± 20 mV te zijn bij fysiologische zoutomstandigheden. Elektronenoverdracht van de QO-site van de bc 1 complex met de fotosynthetische RC komt dus voor in het bereik tussen +100 mV en +300 mV, d.w.z. >100 mV onder de waarden die worden aangetroffen in andere paarse bacteriële systemen. Bovendien is het potentieel van HiPIP II in fysiologische zoutomstandigheden minstens 70 mV positiever dan eerder bepaald onder standaardomstandigheden. Deze twee correcties op eerder aangenomen potentialen maken HiPIP II zeer geschikt voor het pendelen van elektronen tussen de bc 1 complex en de RC. Tot dusverre wijst geen van onze resultaten op een implicatie van HiPIP I bij fotosynthetische elektronenoverdracht. De functionele rol van HiPIP I moet dus nog worden opgehelderd.

De HiPIP-elektronenshuttle in Proteobacteria: slechts een vervanging voor oplosbare cytochromen? Omdat de eerste rapporten hebben aangetoond dat HiPIP's een functionele rol kunnen spelen die gelijkwaardig is aan die van oplosbaar cytochroom C 2 (10, 11), hebben een aantal onderzoeken (l) toonde het wijdverbreide voorkomen van HiPIP's in proteobacteriële elektronenoverdrachtketens (26) en (ii) stimuleerde de karakterisering van de kinetische parameters van de HiPIP/RC-elektronendonatiereactie (10, 41, 42). Het grootste deel van de tot nu toe verkregen gegevens is geïnterpreteerd met de HiPIP's die werken als oplosbare cytochromen C 2 (met iets langzamere elektronenoverdrachtssnelheden) en zijn daarom alternatieven voor de oplosbare cytochromen, net als de kleine kopereiwitten in sommige proteobacteriën of in oxygenische fotosynthese. Er zijn echter steeds meer aanwijzingen dat de door HiPIP's gemedieerde elektronenoverdracht aanzienlijk kan verschillen van die van cytochoom C 2.

Plaatsgerichte mutagenese-experimenten op de Rubrivivax gelatinosus tetraheme-subeenheid (18, 20, 21, 23) hebben al aangegeven dat het koppelen van HiPIP aan de cytochroom-subeenheid hydrofobe in plaats van elektrostatische interacties met zich meebracht, zoals het geval is voor cytochroom C 2.

De interactie tussen HiPIP en zijn vliezige partner is sterk. HiPIP II wordt routinematig vastgehouden tijdens de voorbereiding van membranen en er moeten specifieke inspanningen worden geleverd om de membraanfractie van HiPIP-moleculen volledig uit te putten. Deze strakke binding is niet beperkt tot het geval van HiPIP II in H. halophila. We hebben in feite co-zuivering van HiPIP's met membranen waargenomen in alle proteobacteriële soorten die we tot nu toe hebben bestudeerd (22, 37). Een significante affiniteit voor de membraan-integrale reactiepartners lijkt dus een gemeenschappelijk kenmerk te zijn van proteobacteriële HiPIP's. Dit gedrag staat in contrast met de situatie die we tegenkwamen voor cytochroom C 2, dat, hoewel het tijdens de bereiding van chromatoforen vaak in afgesloten blaasjes wordt vastgehouden, geen bijzonder sterke neiging vertoont om samen met de membraanfractie te zuiveren. Onze bevinding van een sterke associatie van HiPIP met de RC in alle bestudeerde proteobacteriën vormt in feite een kinetisch probleem, omdat verwacht wordt dat een strak complex de snelle uitwisseling van een foto-geoxideerde HiPIP voor een andere gereduceerde HiPIP zal belemmeren. Verdere experimenten zullen nodig zijn om dit raadsel over elektronenoverdracht op te lossen.

Een derde bijzonderheid van HiPIP's, ook waargenomen met HiPIP II uit H. halophila, bestaat uit hun sterke neiging om in oplossing te multimeriseren (37). Het lijkt ons onvermijdelijk dat de hoge lokale concentratie van HiPIP in het periplasma zijn neiging om multimeren te vormen moet vergroten. Ofwel hebben dergelijke multimeren fysiologische relevantie tijdens elektronenoverdracht of een ander niet-gespecificeerd eiwit zorgt ervoor dat de HiPIP niet multimeriseert in hele cellen.

Samenvattend geven de resultaten die in dit werk worden gerapporteerd samen met eerder gepubliceerde gegevens aan dat het gedetailleerde functionele mechanisme van HiPIP-elektronenshuttling aanzienlijk kan afwijken van dat gebruikt door cytochroom C 2.


Bekijk de video: QM. MM 모범 사례: 효소 촉매 메커니즘의 QM. MM 모델링에서 화학적 정확성을 향하여 . (December 2021).