Informatie

Maximale lengte voor PCR-amplificatie


Is er een aanbeveling voor hoe lang een doelsequentie voor PCR-amplificatie moet zijn?

Als er een manier is om een ​​doelsequentie te versterken die de aanbevolen lengte overschrijdt?


Het antwoord hangt sterk af van de polymerase die u gebruikt. Sommige zijn ontworpen voor een betere verwerkbaarheid, door fusie van een procesverbeterend domein (Wang et al, Nucleic Acids Res. 2004), maar zelfs de beste zal het moeilijk hebben na enkele tientallen kilobasen.

Je kunt de lengte van de amplicons een beetje oprekken door met de omstandigheden te spelen, maar om iets te produceren dat aanzienlijk groter is dan de gemiddelde limiet van je polymerase, moet je meestal kleinere fragmenten versterken en ze dan samenvoegen. Dit is de strategie die werd gebruikt om het 1079 kbp synthetische genoom van M. mycoides JCVI-syn1.0, het eerste "kunstmatige genoom" (Hutchison et al, Science 2016); de auteurs hebben eerst veel fragmenten van 1,4 kbp geamplificeerd en geassembleerd in vitro. Om gemakkelijk grote fragmenten in elkaar te zetten in vitro, omvatten veelvoorkomende enzymatische technieken in één pot de zogenaamde Gibson-assemblage (Gibson et al, Nature Methods 2009) en Golden gate-assemblage (Engler et al, PLoS One, 2008) bijvoorbeeld.


Genamplificatie

Genamplificatie is de differentiële toename van een specifiek deel van het genoom in vergelijking met de rest. Dit proces lijkt alomtegenwoordig te zijn en komt voor in de meeste organismen, en het is ook aangetoond dat het voorkomt in zowel kiembaan- als somatische cellen. Genamplificatie kan worden geassocieerd met normale ontwikkelingsprocessen of optreden als sporadische genetische gebeurtenissen met gunstige (bijvoorbeeld groei- of overlevingsvoordeel) of nadelige (bijvoorbeeld tumorigenese) gevolgen voor het organisme. Meer recentelijk is amplificatie van somatische cellen uitgebreid bestudeerd bij menselijke kankers. Amplificatie van proto-oncogenen kan leiden tot of bijdragen aan tumorigenese en/of tumorprogressie. In bepaalde gevallen kan het geamplificeerde gen een bruikbaar doelwit zijn voor kankertherapie.


De lengtelimiet van 5 "Nucleotide-toevoegingen aan PCR-primers"

De toevoeging van nucleotiden aan polymerasekettingreactie (PCR)-primers is een veelgebruikte techniek geworden om het klonen van PCR-producten te vergemakkelijken. Een lang fragment dat niet overeenkomt met de matrijs, zoals een voor epitoop coderende sequentie, moet aan het 5'-uiteinde van de primer worden toegevoegd voor identificatie en zuivering van het tot expressie gebrachte eiwit. De lengtelimiet van toegevoegde sequenties is echter nog niet bepaald. Onder onze omstandigheden bleek de maximale lengte voor toevoegingen van 5'-nucleotiden 108 te zijn, wanneer een volledig overeenkomende forwards-primer en gedeeltelijk overeenkomende reverse-primer 44,4-55,6% GC in het overeenkomende gebied met sjabloon bevatten. De hier getoonde resultaten zijn zeer nuttig voor wetenschappers die een lange niet-overeenkomende sequentie met template willen toevoegen, zoals een epitop/een signaalpeptide coderende sequentie en/of de meerdere kloneringsplaatsen.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Geamplificeerd fragmentlengte polymorfisme

AFLP-PCR of gewoon AFLP is een op PCR gebaseerd hulpmiddel dat wordt gebruikt bij genetisch onderzoek, DNA-vingerafdrukken en in de praktijk van genetische manipulatie. Ontwikkeld in de vroege jaren 1990 door Keygene, [1] AFLP gebruikt restrictie-enzymen om genomisch DNA te verteren, gevolgd door ligatie van adapters aan de kleverige uiteinden van de restrictiefragmenten. Een subset van de restrictiefragmenten wordt vervolgens geselecteerd om te worden geamplificeerd. Deze selectie wordt bereikt door gebruik te maken van primers die complementair zijn aan de adaptersequentie, de restrictieplaatssequentie en een paar nucleotiden binnen de restrictieplaatsfragmenten (zoals hieronder in detail beschreven). De geamplificeerde fragmenten worden gescheiden en zichtbaar gemaakt bij denaturering op agarosegelelektroforese, hetzij door middel van autoradiografie of fluorescentiemethodologieën, of via geautomatiseerde instrumenten voor capillaire sequentiebepaling.

Hoewel AFLP niet als acroniem mag worden gebruikt, wordt er gewoonlijk naar verwezen als "Amplified fragment length polymorphism". De resulterende gegevens worden echter niet gescoord als lengtepolymorfismen, maar in plaats daarvan als aanwezigheid-afwezigheidspolymorfismen. [2]

AFLP-PCR is een zeer gevoelige methode voor het detecteren van polymorfismen in DNA. De techniek is oorspronkelijk beschreven door Vos en Zabeau in 1993. [3] [2] In detail is de procedure van deze techniek onderverdeeld in drie stappen:

  1. Digestie van totaal cellulair DNA met een of meer restrictie-enzymen en ligatie van restrictie-halve-site-specifieke adapters aan alle restrictiefragmenten.
  2. Selectieve amplificatie van sommige van deze fragmenten met twee PCR-primers die overeenkomstige adapter- en restrictieplaatsspecifieke sequenties hebben. van amplicons op een gelmatrix, gevolgd door visualisatie van het bandpatroon.

De AFLP-technologie heeft het vermogen om verschillende polymorfismen in verschillende genomische regio's tegelijkertijd te detecteren. Het is ook zeer gevoelig en reproduceerbaar. Als gevolg hiervan is AFLP op grote schaal gebruikt voor de identificatie van genetische variatie in stammen of nauw verwante soorten planten, schimmels, dieren en bacteriën. De AFLP-technologie is gebruikt in strafrechtelijke en vaderschapstesten, ook om kleine verschillen binnen populaties vast te stellen, en in koppelingsstudies om kaarten te genereren voor kwantitatieve trait locus (QTL)-analyse.

AFLP heeft veel voordelen in vergelijking met andere markertechnologieën, waaronder willekeurig geamplificeerd polymorf DNA (RAPD), restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP) en microsatellieten. AFLP heeft niet alleen een hogere reproduceerbaarheid, resolutie en gevoeligheid op het gehele genoomniveau in vergelijking met andere technieken [4], maar het heeft ook de mogelijkheid om tussen 50 en 100 fragmenten tegelijk te amplificeren. Bovendien is er geen voorafgaande sequentie-informatie nodig voor amplificatie (Meudt & Clarke 2007). [5] Als gevolg hiervan is AFLP buitengewoon nuttig geworden in de studie van taxa, waaronder bacteriën, schimmels en planten, waar nog veel onbekend is over de genomische samenstelling van verschillende organismen.


MATERIALEN EN METHODES

DNA-oligonucleotiden

Primer BIP voor M13mp18 (M13BIP) bestond uit de complementaire sequentie (24 nt) van B1, een TTTT-linker en B2 (24 nt): 5′-CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTAC-TTTT-TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT-3′. Primer FIP voor M13mp18 (M13FIP) bestond uit F1c (25 nt), een TTTT-linker en de complementaire sequentie van F2c (22 nt): 5′-ACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCT-TTTT-GTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC-3′. Primers B3 en F3 voor M13mp18 (M13B3 en M13F3) waren respectievelijk 5′-ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA-3′ en 5′-GTTGGGAAGGGCGATCG-3′. De probes die werden gebruikt voor Southern blot-hybridisatie waren 5′-AAGCTTGGCACTGGCCGTCGT-3′ (M13-281) en 5′-GTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACAT-3′ (M13-333). De primers die werden gebruikt voor amplificatie van het HBs-gebied van hepatitisvirus B (HBV)-DNA waren 5′-GATAAAACGCCGCAGACACATCCTTCCAACCTCTTGTCCTCCAA-3′ (HBVBIP), 5′-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGACAAACGGGCAACATACCTT-3' 3′ (HBVB3) en 5′-GGTGGTTGATGTTCCTGGA-3′ (HBVF3). De primers die werden gebruikt voor prostaatspecifieke antigeen-mRNA-amplificatie waren 5′-TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG-3′ (PSABIP), 5′-TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG-3'x02032x02AFIPTG-3' 5′-GGGTGTGGGAAGCTGTG-3′ (PSAF3).

Reactiemengsel voor LAMP

LAMP werd uitgevoerd in een totaal 25 µl reactiemengsel met 0,8 µM elke FIP en BIP, 0,2 µM elke F3 en B3, 400 µM elk dNTP, 1 M betaïne (Sigma), 20 mM Tris' x02013HCl (pH 8,8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2DUS4, 4 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100 en de gespecificeerde hoeveelheden dubbelstrengs doelwit-DNA. Het mengsel werd gedurende 5 minuten op 95 °C verwarmd en vervolgens op ijs gekoeld, 8 U Bst Groot fragment van DNA-polymerase (New England Biolabs) werd toegevoegd, gevolgd door incubatie gedurende 1 uur bij 65°C en 10 minuten verhitting bij 80°C om de reactie te beëindigen.

Analyse van product

Porties van 5 liter LAMP-producten en 1 liter van de met restrictie-enzymen gedigereerde producten werden aan elektroforese onderworpen in 2 agarosegels (0,5 TBE) gevolgd door kleuring met SYBR Green I (Molecular Probes Inc.). Southern-blot-analyses werden uitgevoerd door middel van overdracht naar Hybond Nøx0002b nylonmembraan (Amersham-Pharmacia). Oligonucleotide-probes die aan het uiteinde waren gelabeld met een DIG Oligonucleotide Tailing Kit (Roche Diagnostics) werden gebruikt voor detectie volgens het protocol van de fabrikant. Een aliquot van 5 l LAMP-producten werd ook 14 uur gelopen in een 0,7  alkalische agarosegel die 50 mM NaOH en 1 mM EDTA bevatte, gevolgd door neutralisatie met 1 M TrisߝHCl (pH 8,0), en kleuring met SYBR Green I.

Amplificatie van HBV-DNA gekloneerd in pBR322

HBV viraal DNA (type adr) werd geknipt met BamHI, ingevoegd in de BamHI-plaats van pBR322, gedigereerd met EcoRV en vervolgens gebruikt als sjabloon. Het LAMP-reactiemengsel was hetzelfde als voor M13mp18-DNA, behalve het gebruik van 1,6 µM HBVFIP- en HBVBIP-primers en 0,2 µM HBVF3- en HBVB3-primers. De LAMP-reactie werd gedurende 45 minuten bij 60 °C uitgevoerd. Aliquots van 2 µl van de amplificatieproducten werden gemengd met 300 µl van 1⼐ 000 verdunde originele SYBR Green I in 10 mM Tris–HCl (pH 8,0), en 1 mM EDTA, 30 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur en gekwantificeerd voor fluorescentie-intensiteit met een Shimadzu RF-5000 spectrofotometer.


Op primer gebaseerde benadering voor PCR-amplificatie van gen met hoog GC-gehalte: Mycobacterium Gen als model

het genoom van Mycobacterium is rijk aan GC-gehalte en vormt een probleem bij de amplificatie van sommige genen, vooral die welke rijk zijn aan het GC-gehalte in terminale regio's, door middel van standaard/routine PCR-procedures. Er zijn pogingen gedaan om drie GC-rijke genen van Mycobacterium sp. (Rv0519c en Rv0774c van M. tuberculose en ML0314c van M. leprae). Van deze drie genen, Rv0774c gen werd geamplificeerd met normale primers onder standaard PCR-omstandigheden, terwijl er geen amplificatie werd waargenomen in het geval van Rv0519c en ML0314c genen. In het huidige onderzoek werd met succes een gemodificeerde primer-gebaseerde benadering gebruikt voor amplificatie van GC-rijke sequentie van Rv0519c door codonoptimalisatie zonder de natieve aminozuursequentie te veranderen. De strategie werd met succes bevestigd door de standaardprimers opnieuw te ontwerpen met vergelijkbare modificaties, gevolgd door amplificatie van ML0314c gen.

1. Inleiding

Op polymerasekettingreactie (PCR) gebaseerde klonering van gen van belang met een hoog GC-gehalte is een lang erkend probleem. PCR is een zeer gevoelig instrument en verschillende factoren moeten worden geoptimaliseerd voor amplificatie van het gen van belang. Primer is een van de precieze controle-elementen in dit proces. Het ontwerpen van primers heeft direct invloed op het resultaat van gestandaardiseerde kloneringsprocedures. Een hoog GC-gehalte van het gen genereert complicaties tijdens het ontwerpen van primers, zoals mismatch en hoge annealingstemperatuur, zelfdimeervorming en secundaire structuur. Soms wordt amplificatie van het gen niet routinematig bereikt door normale PCR-technieken. Het meest prominente probleem is de haarspeldlus, die direct interfereert tijdens het annealen van primers op een moeilijk DNA-template dat leidt tot geen amplificatie. Er zijn verschillende strategieën voorgesteld om dit probleem op te lossen. Er werd gemeld dat het gebruik van DMSO en glycerol de uitgloeitemperatuur en denaturatietemperatuur verlaagt, de kans op breuk van de secundaire structuur verhoogt en de efficiëntie van amplificatie verhoogt [1-5]. De hele genoomsequentie van Mycobacterium tuberculosis werd ontcijferd door Cole et al. [6]. De genen van M. tuberculose worden gekloond en uitgedrukt in E coli cellen om hun mogelijke rol in Mycobacterium leven. De Mycobacterium genoom heeft een zeer hoog GC-gehalte (66%) wat de mogelijkheid van haarspeldstructuur in de genomische structuur verhoogde. Uit genoomsequentie-analyse werd waargenomen dat PPE, PE en PGRS multigenfamilie coderen voor eiwitten van ongeveer 110-80 aminozuren die rijk zijn aan proline en glutaminezuur op de N-terminale positie. Proline- en glutaminezuurresiduen worden voornamelijk gecodeerd door triplet van GC-basen in Mycobacterium genoom. De meeste genen voor membraaneiwitten van M. tuberculose waren rijk aan GC-inhoud in terminalregio's. Aanwezigheid van een hoog GC-gehalte verhoogde de uitgloeitemperatuur tot boven de verlengingstemperatuur (72 °C) en ook herhaalde rekoefeningen genereren de haarspeldstructuur. In dergelijke gevallen hangen de effectiviteit en reproduceerbaarheid van PCR-amplificatie af van een gedetailleerde analyse van de mogelijke secundaire structuren van de oligonucleotideprimers en van de vorming van zelfdimeren en kruisdimeren met andere onderling gerelateerde oligonucleotiden [7]. Hoewel deze problemen door verschillende onderzoekers zijn overwogen, zijn er geen systematische details beschikbaar om dit probleem aan te pakken.

In een poging om GC-rijke genen te klonen (Rv0519c en Rv0774c van M. tuberculose en ML0314c van M. leprae) van Mycobacterium sp., ontwierpen we primers met behulp van de standaardmethode voor genamplificatie. Rv0774c en Rv0519c genen toonden 100% nucleotide-identiteit in M. tuberculose H37Rv en M. tuberculose H37Ra. Daarom, M. tuberculose H37Ra chromosomaal DNA werd gebruikt als matrijs voor amplificatie van deze twee genen. We zouden kunnen versterken Rv0774c gen, maar Rv0519c en ML0314c genen met een hoog GC-gehalte in het terminale gebied werden niet geamplificeerd door standaard PCR-procedures. Daarom is in het huidige onderzoek een poging gedaan om de omstandigheden en ingrediënten te standaardiseren die de amplificatie van GC-rijke sequenties bevorderen.

2. materialen en methoden

2.1. Materialen

E coli DH5α cellen en pET-28a werden verkregen van Invitrogen. Taq-polymerase en dNTP's werden gekocht bij Fermentas, VS. Restrictie-enzymen werden gekocht bij New England Biolabs. Kanamycin, Middlebrook media, OADC en tween 80 werden gekocht bij Hi-Media, India. De druk Mycobacterium tuberculosis H37Ra was een vriendelijk geschenk van de directeur van het Nationaal Instituut voor Lepra en Andere Mycobacteriële Ziekten, Agra, India. Genomisch DNA voor Mycobacterium lepra was een vriendelijk geschenk van Dr. Mallika Lavania van Stanley Browne Laboratory, the Leprosy Mission, Nandnagri, Shahdara, New Delhi.

2.2. Mycobacterium Genomische DNA-isolatie

M. tuberculose H37Ra-stammen werden routinematig een week gekweekt op middlebrook, 0,05% Tween 80, verrijkt met OADC. Een week gegroeid M. tuberculose H37Ra-cellen (1,5 ml) werden geoogst door 20 minuten te centrifugeren bij 5000 xg. Geoogste pellet werd opnieuw gesuspendeerd in 400 μL Tris-EDTA-buffer (100 mM Tris/10 mM EDTA, pH 8). De cellen werden gelyseerd door het monster gedurende 5 minuten in een kokend waterbad te plaatsen, gevolgd door 5 minuten afkoelen op ijs. Veertig microliter van 20 mg/ml lysozym en 5 μL van proteïnase K werd toegevoegd. Na 1 uur incubatie bij 37°C, oplossing A (56 μL van 10% SDS, 64 μ1 CTAB-NaCl) werd aan het reactiemengsel toegevoegd. Na 2 uur incubatie bij 65°C werden eiwitten verwijderd door 2-3 keer wassen met fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1). Het genomische DNA werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geprecipiteerd met 0,6 volume isopropanol. Het geprecipiteerde DNA werd gedroogd en opgelost in steriel water en bewaard bij -20°C.

2.3. Wijziging van primers door Codon-optimalisatie

Degeneratie van codons wordt normaal gesproken gebruikt om het bestaande probleem te overwinnen, waaronder verandering van base op wiebelpositie die specifiek is voor de coderende sequentie van Mycobacterium genoom. Ontworpen voorwaartse primer van Rv0519c draagt ​​ongeveer 64% GC-gehalte bij en trajecten van GC leidden tot het ontstaan ​​van een gecompliceerde haarspeldstructuur met een hoge waarde van vrije energieverandering

G. Door de haarspeldstructuur zorgvuldig te onderzoeken, vervormde de introductie van de kleine basis/paar de hele secundaire structuur. De opname die we kozen in de primersequentie was als volgt: guanine (G)-base omgezet in adenosine (A) op de wiebelpositie van het derde codon CGG en thymine (T) in adenine (A) in codon CGT (tabel 1). Evenzo in omgekeerde primer van Rv0519c primersequentie werd de adenosine (A)-base omgezet in thymine (T) op de wiebelpositie van het laatste zesde codon CGA. Mycobacterium leprae genoomsequentie heeft ook hoge guanine- en cytosine-uitstrekkingen. Omgekeerde primersequentie van ML0314c van leprae gen werd ook gewijzigd. Guanine werd omgezet in cytosine op de wiebelpositie van het TCG-codon. Het effect van modificatie werd geanalyseerd door IDT-oligoanalysetools.


In silico Vingerafdrukken met dubbele spijsvertering (DDF)

Het doel van de in silico Double Digestion Fingerprinting (DDF) tool is het simuleren van vingerafdruktechnieken die gebruik maken van twee endonucleasen. Deze tool maakt het ook mogelijk om nieuwe benaderingen uit te proberen op basis van dubbele spijsvertering, en zelfs technieken met behulp van drie endonucleasen.

  • Geamplificeerde fragmentlengtepolymorfismen of AFLP-PCR (1),
  • Infrecuent Restriction Site PCR of IRS-PCR(2), wat in feite AFLP-PCR is, maar gebruik maakt van ten minste één endonuclease die op een ongecompliceerde manier DNA knipt, en selectieve nucleotiden worden niet gebruikt
  • Afgetrokken beperking Vingerafdrukken of SRF (3).

Door gebruik te maken van de DDF-tool kunnen alle bovenstaande technieken worden gesimuleerd. Maar dat zijn niet de enige beschikbare opties. Bij het ontwikkelen van deze tool hebben we zelfs nieuwe vingerafdruktechnieken overwogen die nog niet eerder zijn beschreven. Hoewel we ze niet in het laboratorium hebben uitgeprobeerd, hebben we deze hypothese ontwikkeld omdat ze nodig waren voor de correcte ontwikkeling van een universele vingerafdruktool op basis van dubbele vertering.

Hieronder vindt u de aanpasbare parameters van deze simulatietool:

SELECTIE VAN GENOM OF UPLOADEN SEQUENTIES

Volledige bacteriële sequenties zijn verkregen van NCBI. Alle up-to-date sequenties van bacteriële genoomsequenties zijn inbegrepen in deze service.

Gebruikers kunnen hun sequenties ook uploaden naar de server. Sequenties moeten in Fasta-formaat zijn in een tekst/plat type bestand. Alle gegevens die niet compatibel zijn met een DNA-sequentie (bijvoorbeeld cijfers) worden uit het bestand verwijderd.

Geüploade bestanden worden gekoppeld aan het IP-adres van gebruikers. Deze associatie stelt ons in staat om het gebruik van wachtwoordbeveiligingssystemen te vermijden. Elke gebruiker kan maximaal 5 reeksen uploaden en deze worden na 1 maand verwijderd.

We zullen geen gegevens met betrekking tot geüploade reeksen of het gebruik ervan vastleggen, alleen voor statistieken.

Vertering van DNA met twee endonucleasen levert 4 soorten fragmenten op:

Type 1: Van endonuclease 1 naar endonuclease 2
Type 2: Van endonuclease 2 naar endonuclease 1
Type 3: Van endonuclease 1 naar endonuclease 1
Type 4: Van endonuclease 2 naar endonuclease 2

Selectie van fragmenten kan handmatig zijn, of we kunnen de techniek selecteren (door het selectievakje voor AFLP-PCR- of SRF-technieken te selecteren, worden de juiste fragmenten geselecteerd).

  • AFLP-PCR/IRS-PCR zal type 1 en 2 fragmenten amplificeren.
  • SRF zal alleen type 3 fragmenten detecteren.

MAXIMALE LENGTE VAN FRAGMENTEN

De toegestane lengte van fragmenten ligt tussen 20 en 10000 bp. 3000 bp is de standaardwaarde. De geselecteerde lengte omvat de herkenningssequentie van endonucleasen.

Geselecteerde fragmenttypes zullen worden gecontroleerd op aanwezigheid van de DNA-sequentie die in dit tekstvak is opgenomen, en in het geval dat de sequentie aanwezig is, zal het fragment worden geëlimineerd (het zal niet worden gedetecteerd). Deze uitsluitingssequentie kan overeenkomen met een derde endonuclease dat in het experiment is gebruikt. Het is dus mogelijk om een ​​drievoudig verteringsexperiment te simuleren.

SELECTIE VAN ENDONUCLEASEN

  • Uit een lijst van commercieel verkrijgbare palindroomrestrictie-enzymen (de lijst is verkregen van REBASE).
  • Door de herkenningssequentie in te voeren (gedegenereerde nucleotiden zijn toegestaan).

Een selectievakje maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen overhangende uiteinden die worden verkregen door niet-palindromische endonucleasen (of we fragmenten willen selecteren die het DNA alleen snijden met de geselecteerde sequentie in de richting die in de vorm is geïntroduceerd, of dat we geen onderscheid willen maken tussen snijrichtingen).

Met deze simulatietool voor Double Digestion Fingerprinting-technieken kunnen gesimuleerde AFLP-PCR- en SRF-technieken worden gesimuleerd, evenals nieuwe benaderingen. We hebben een paar voorbeelden toegevoegd om het gebruik van deze tool te laten zien.

Simulatie van AFLP-PCR-experiment
Simulatie van Subtracted Restriction Fingerprinting (SRF) experiment
Simulatie van Double Digestion Fingerprinting-experiment bij gebruik van één niet-palindroom endonuclease
Simulatie van Double Digestion Fingerprinting-experiment bij gebruik van een niet-palindroom endonuclease met gedegenereerde (N) nucleotiden
Simulatie van een experiment met vingerafdrukken met dubbele spijsvertering bij gebruik van slechts één endonuclease


DNA-SJABLOON

De DNA-matrijs zal overeenkomen met het bacteriële DNA waarvan de sequentie is gekozen in de vorm, en indien beschikbaar, kunnen plasmiden in het experiment worden opgenomen. Wanneer de bacteriesoort meer dan één chromosoom heeft (bijv. Agrobacterium tumefaciens, circulair chromosoom), zullen beide worden gebruikt. In het experiment zal bacterieel chromosomaal DNA als circulair worden beschouwd, tenzij het lineair is (bijv. Agrobacterium tumefaciens, lineair chromosoom). Plasmiden zullen altijd als circulair worden beschouwd.

De pagina Rresults toont de startpositie van amplicon in het chromosoom of plasmide en de lengte van elk amplicon. Amplicons die in elk chromosoom of plasmide zijn verkregen, worden afzonderlijk in tabellen weergegeven.

Amplicons worden ook weergegeven in een figuur met een ladder van 100 bp. Rechts van de afbeelding wordt de gesorteerde lengte van alle amplicons getoond.


ExoProStar 1-Step

Enzymatische PCR-opruimingstechnologie met Exonuclease I en alkalische fosfatase gecombineerd in één buis om niet-opgenomen primers en dNTP's te verwijderen. Voor maximaal gemak wordt geleverd in een enkele buis.

Enzymatische PCR-opruimingstechnologie met Exonuclease I en alkalische fosfatase gecombineerd in één buis om niet-opgenomen primers en dNTP's te verwijderen. Voor maximaal gemak wordt geleverd in een enkele buis.

  • Eén buisje met één mix van enzymen voor het opruimen van PCR en sequentiereactie
  • Slechts één pipetteerstap om uw reactie in te stellen
  • Snel 30 minuten handsfree protocol
  • 100% herstel van PCR-product
  • Schaalbaar voor verschillende reactiegroottes
  • Automatiseringsvriendelijk

ExoProStar is onze nieuwe naam voor deze PCR-opschoontechnologie. Geen verandering in de formulering, dus u krijgt hetzelfde geweldige product en dezelfde geweldige voordelen!

Het ExoProStar 1-Step PCR en Sequence Reaction Clean-Up reagens biedt een eenvoudige, eenstaps methode voor het verwijderen van niet-opgenomen primers en nucleotiden voorafgaand aan downstream-analyse. Exonuclease I en alkalische fosfatase-enzymen worden gecombineerd in een enkele, stabiele mix die slechts één pipetteerstap vereist om de reinigingsreactie op te zetten.

ExoProStar 1-Step is gebaseerd op de oprichtingsoctrooien van Cytiva voor het opruimen van PCR-reacties met behulp van Exonuclease 1 en alkalische fosfatase. Deze 1-staps versie is niet beschikbaar in Canada en Japan. In plaats daarvan bieden we een versie aan met de enzymen in twee afzonderlijke buizen, de ExoProStar, en de snellere versie, ExoProStar S.


EvaGreen® is de enige DNA-bindende kleurstof die gevalideerd is voor druppel digitale PCR (ddPCR)

Bekijk de volledige lijst met referenties hier.

Uitgelichte bronvermelding: Dankzij de superieure prestaties van EvaGreen®-kleurstof is het de eerste en enige DNA-bindende kleurstof die geschikt is voor ddPCR-toepassingen. In eerste instantie ontworpen voor detectie op basis van fluorescente sondes, heeft ddPCR-technologie kwantitatieve multiplex-PCR mogelijk gemaakt door monsters te verdelen in duizenden druppeltjes die afzonderlijk kunnen worden gemeten. In een publicatie in Analytical Chemistry, McDermott et al. demonstreren hoe EvaGreen®-kleurstof kan worden gebruikt met ddPCR om meerdere doelen in een monster te analyseren door de geamplificeerde DNA-massa per druppel te onderscheiden. De resultaten laten zien dat ddPCR op basis van EvaGreen® vergelijkbaar presteert met op TaqMan® gebaseerde ddPCR, zonder de extra complexiteit en kosten van fluorescerende sondes. EvaGreen® Dye heeft momenteel een licentie voor Bio-Rad's QX200 ddPCR™ EvaGreen® Supermix en andere ddPCR-gerelateerde reagentia.

VERGEET-ME-NIET™ EVAGREEN® QPCR MASTER MIX

Forget-Me-Not™ qPCR Master Mix is ​​een hot-start EvaGreen® Dye-gebaseerde mastermix voor gebruik in realtime PCR-toepassingen en DNA-smeltcurve-analyse. Forget-Me-Not™ bevat een unieke combinatie van een mastermix met een lage concentratie blauwe kleurstof, plus een DNA-templatebuffer met een hogere concentratie blauwe kleurstof. Wanneer je de 2X Forget-Me-Not™ Master Mix aan je reactie toevoegt, lijkt deze lichtblauw. Als u vervolgens een sjabloon met een Forget-Me-Not™-sjabloonbuffer aan de reactie toevoegt, wordt de kleur donkerblauw (Afbeelding 1, rechts). Met Forget-Me-Not™ kunt u in één oogopslag zien of u bent vergeten een mastermix of sjabloon toe te voegen aan uw reacties, zodat u pipetteerfouten kunt opvangen en tijd, reagentia en uw kostbare DNA-monsters niet verspilt.

Raadpleeg de Forget-Me-Not™ Master Mix-technologie voor meer informatie over onze mastermixen.

Afbeelding 3. Een vergelijking van het ruwe fluorescentiesignaal van qPCR-reacties uitgevoerd met twee EvaGreen®-mastermixen (Forget-Me-Not™ EvaGreen® en Fast EvaGreen®) en QuantiNova SYBR® Green. EvaGreen®-kleurstof is minder remmend dan SYBR®-groen, waardoor een veel helderder signaal mogelijk is.

FORGET-ME-NOT™ UNIVERSELE SONDE QPCR MASTER MIX

Forget-Me-Not™ Universal Probe qPCR Master Mix is ​​een hoogwaardig product voor op fluorescente probes gebaseerde PCR-toepassingen, waaronder kwantificering en SNP-genotypering. Deze kit is geschikt voor alle op fluorescente sondes gebaseerde technologieën, inclusief hydrolysesondes (zoals TaqMan® en dual-labeled BHQ®-sondes) en verplaatsingssondes (zoals Molecular Beacons). Forget-Me-Not™ Universal Probe Master Mix vertoont uitstekende overeenstemming van resultaten in singleplex- en multiplexreacties, heeft een brede instrumentcompatibiliteit en kan worden gebruikt in zowel standaard- als snelle protocollen. Er is ook een aparte kit verkrijgbaar met ROX, als uw instrument ROX-referentiekleurstof nodig heeft.

Raadpleeg de Forget-Me-Not™ Master Mix-technologie voor meer informatie over onze mastermixen.

Afbeelding 4. Forget-Me-Not Universal Probe qPCR Master Mix werkt uitzonderlijk goed voor multiplex-probe-PCR-reacties.

Nieuw: N-FLUX™ 5X digitale PCR-mastermix

Introductie van onze nieuwe N-Flux™ 5X Digital PCR Master Mix, een hoogwaardige, kleurstofvrije mastermix die speciaal is ontwikkeld voor op chip gebaseerde digitale PCR (cdPCR)-platforms. De mastermix is ​​ontworpen om interacties met hydrofobe plastic oppervlakken te minimaliseren voor optimale monsterverdeling, wat resulteert in maximale eindpuntfluorescentie en superieure scheiding tussen positieve en negatieve partities. N-Flux™ 5X Digital PCR Master Mix is ​​gevalideerd in singleplex en multiplex probe-dPCR-reacties. Met behulp van het Combinati Absolute Q digitale PCR-platform voerde de N-Flux™ 5X digitale PCR Master Mix reproduceerbare genotypering en kopie-aantalvariatie-analyse uit met kwantitatieve discriminatie. Bovendien vereenvoudigt de hoge 5X-concentratie de workflows voor gebruikers die qPCR uitvoeren op grote monstervolumes. Dit biedt flexibiliteit en vergemakkelijkt PCR-analyse voor monsters die te verdund zijn voor traditionele 2X-mastermixen.

Raadpleeg voor meer informatie onze productpagina N-Flux™ 5X Digital PCR Master Mix.

KENMERKEN

  • Robuuste resultaten:
    Gevoelige en reproduceerbare prestaties in dPCR- en qPCR-assays.
  • Optimale monsterpartitionering:
    Minimaliseert interacties met hydrofobe plastic oppervlakken en maximaliseert eindpuntfluorescentie.
  • Compatibel met alle op fluorescerende sonde gebaseerde technologieën:
    Inclusief TaqMan® dual-labeled zoals BHQ®-sondes en verplaatsingssondes.
  • Handige 5X-concentratie voor grote monstervolumes
    Vergemakkelijkt workflows voor samples die te verdund zijn voor 2X mastermixen.
Hoge resolutie, multiplex kopie aantal variatieanalyse uitgevoerd met behulp van N-Flux™ 5X Digital PCR Master Mix op het COMBiNATi Microfluidic Array Partitioning (MAP16) apparaat. Superieure partitionering resulteert in kwantitatieve bepaling van het aantal kopieën van een SNP-variant met een lage abundantie en een controle met een hoge abundantie op humaan gDNA, met een uitstekende scheiding tussen positieve en negatieve putjes.
productnaamCatalogus nummerMaat
N-Flux™ 5X digitale PCR-mastermix (proefformaat)31078-T50 x 20 uL reacties
N-Flux™ 5X digitale PCR-mastermix31078250 x 20 uL reacties

Selectiegids voor mastermixen

Catalogus nr.MastermixEvaGreen® qPCRProbe-gebaseerde PCRGeoptimaliseerd voor dPCR1-kleur tracking2-kleuren tracking
31041Vergeet-mij-nietje&handel EvaGreen® qPCR Master Mix met 2-kleuren tracking &rekening &rekening
31042Vergeet-mij-nietje&trade EvaGreen® qPCR Master Mix met 2-kleuren tracking,
met aparte ROX
&rekening &rekening
31045Vergeet-mij-nietje&trade EvaGreen® qPCR Master Mix (lage ROX) &rekening &rekening
31046Vergeet-mij-nietje&trade EvaGreen® qPCR Master Mix (hoge ROX) &rekening &rekening
31043Forget-Me-Not&trade Universele Probe qPCR Master Mix (geen ROX) &rekening &rekening*
31044Forget-Me-Not&trade Universele Probe qPCR Master Mix, met aparte ROX &rekening &rekening*
31078N-Flux&trade 5X Digitale PCR Master Mix &rekening &rekening
*Optioneel

CHEETAH™ HOTSTART TAQ

Cheetah™ Taq is een chemisch gemodificeerd hot-start DNA-polymerase. Met behulp van een gepatenteerde methode die is ontwikkeld door Biotium, is Cheetah™ Taq gemodificeerd om absoluut geen activiteit te hebben bij kamertemperatuur, maar volledig te worden geactiveerd na twee minuten bij 95 ° C.

KENMERKEN

  • Snelle activering:
    Het activeren duurt minder dan 2 minuten, veel sneller dan AmpliTaq Gold en HotStarTaq®.
  • Uitstekend activiteitsherstel:
    Beter herstel van zowel 5′-3′-polymerase- als 5′-exonuclease-activiteiten na activering dan AmpliTaq Gold.
  • Verbeterde stabiliteit:
    Betere stabiliteit dan AmpliTaq Gold tijdens opslag.
  • pH-compatibiliteit:
    Kan worden geactiveerd bij alkalische pH (8,5-9) voor optimale Taq-activiteit en meer specifieke doelamplificatie.

Afbeelding 5. Cheetah™ Taq herstelt sneller zijn volledige activiteit dan andere hot-start enzymen zoals AmpliTaq Gold.

EVA-EZ™ POLYMERASE ACTIVITEITSASSAY

EvaEZ™ Fluorometric Polymerase Activity Assay Kit biedt een gemakkelijke en nauwkeurige manier om de activiteit van een nucleïnezuurpolymerase te bepalen zonder gebruik te maken van radio-isotopen. Het bevat EvaGreen®-kleurstof samen met een geprimed-sjabloon, dNTP's en MgCl2 in een Tris-buffersysteem. In aanwezigheid van DNA-polymerase-activiteit zal de primer worden verlengd om een ​​dubbelstrengs product te vormen dat EvaGreen® Dye kan binden, wat resulteert in een toename van de fluorescentie. De mate van toename van fluorescentie is positief gecorreleerd met de activiteit van polymerase. De test is ontwikkeld voor het meten van Taq-DNA-polymerase-activiteit. Het kan ook worden gebruikt voor andere DNA-polymerasen zoals Pfu, Vent, Phusion®, Bst, Phi29, MMLV, AMV, SuperScript®, T4 DNA-polymerase, T7 DNA-polymerase, Klenow en E. coli DNA-polymerase I. De activiteitstest kan worden uitgevoerd bij temperaturen van 4°C tot 75°C.

Figuur 6. Voorbeeldgegevens van een EvaEZ-assay, die een titratie van Taq DNA-polymerase laat zien.

LEVENSBAARHEID PCR-KLEURSTOFFEN & amp KITS

Biotium is er trots op de geavanceerde technologie van levensvatbaarheid PCR te hebben ontwikkeld, een techniek waarbij de levensvatbaarheid van de cellen kan worden beoordeeld door een monster te behandelen met een DNA-bindende kleurstof, gevolgd door een qPCR of isotherme amplificatiereactie. Voor meer informatie over deze technologie en onze portfolio van reagentia voor levensvatbaarheid PCR, zie Levensvatbaarheid PCR-technologie.

PCR ACCESSOIRE REAGENTIA & GERELATEERDE PRODUCTEN

Biotium biedt een breed scala aan PCR/qPCR-accessoireproducten om u te helpen bij uw DNA-amplificatie-experimenten, waaronder:


PCR-laboratoriumdecoratie

Laboratoriumwanden, -plafonds en -vloeren moeten glad, gemakkelijk te reinigen, lekvrij en bestand tegen chemicaliën en desinfectiemiddelen zijn. De grond moet stroef zijn en tapijten en gordijnen mogen niet in het laboratorium worden gelegd. Het plafond moet een solide structuur hebben, een goede luchtdichtheid en alle negatieve hoeken nemen een cirkelvormige booglijnovergang aan, de binnenwand van de muur is glad, niet-adsorptie, corrosiebestendig, gemakkelijk schoon te maken en te desinfecteren, de muur en het plafond worden aanbevolen om kleur stalen plaat te gebruiken.

Het grondmateriaal moet voldoen aan de eisen van naadloos, geen lekkage, glad en corrosiebestendig.

Kies de lampen en lantaarns met de functie van zuivering die de kenmerken van eenvoudige reiniging en geen stofophoping kunnen bereiken. The laboratory should be equipped with emergency lighting devices. Also, consider the appropriate installation location to ensure that personnel leave the laboratory safely.

Reliable power supply and emergency lighting. Each room must be equipped with ultraviolet germicidal lamps, the installation height of germicidal lamps is between 1.8

An ultraviolet lamp is installed inside the transfer window for disinfection is required.

It should be equipped with enough fixed power sockets to avoid using multiple devices with a common power socket. There should be a reliable grounding system where leakage protection devices or monitoring and alarm devices should be installed at key locations.

The laboratory table cabinets and chairs should be stable and firm, with round corners. The benchtop should be waterproof and resistant to heat, organic solvents, acids and alkalis, disinfectants and other chemical agents. Epoxy countertops are generally used.

The cabinets and test benches in the test bench should be firm, and a certain distance should be maintained between the test benches, cabinets and other equipment for easy cleaning.

The laboratory door is a purification door. There should be a window and an automatic door closer. The doors in the laboratory must be opened in place. And to achieve an appropriate fire rating, the door lock and door opening direction should not hinder the escape of indoor personnel.

The laboratory should be equipped with a sink, and the faucet switch should be non-manual located near the exit.

The water supply pipeline should be equipped with backflow preventers or other effective devices the water supply and drainage system should be free of leakage with anti-backflow design.

Appropriate emergency equipment is required, such as fire fighting equipment, accident handling equipment, first aid equipment, etc.
Appropriate communication devices.


Bekijk de video: Mengukur Kekuatan Otot - One Repetition Maximum (Januari- 2022).