Informatie

Verbetering van de DNA-kwaliteit en opbrengst van ontlastingsmonsters


Ik heb genomisch DNA geprepareerd uit de ontlasting van varkens, maar de concentratie was erg laag - ongeveer 3~4 ng/µl, toen ik het met nanodrop meet. DeA260/A280enA260/A230waarden kwamen ook niet erg goed uit (respectievelijk 0,4~0,5 en 1,0). Ik heb ook twee keer geprobeerd het DNA te filteren, maar dat verbeterde de kwaliteit niet. Heeft iemand ervaring met DNA-extractie uit ontlastingsmonsters en kan mij voorstellen hoe ik de kwaliteit en opbrengst kan verbeteren?


De verwachte fotometrische verhoudingen voor puur DNA liggen rond de 1,8 (A260/A280) en 2,0-2,2 (A260/A230). Ter referentie, als u puur RNA extraheert, is de verhouding idealiter 2,0 (A260/A280).

Vaak duiden lagere verhoudingen meestal op een lage zuiverheid vanwege verontreinigingen of gewoon een zeer lage hoeveelheid DNA.

EDTA, koolhydraten en fenol onder andere chemicaliën hebben allemaal een absorptie bij 230 nm. Als u TRIzol-reagens heeft gebruikt om DNA te extraheren, kunt u ook enige absorptie van dit reagens krijgen bij 270 nm als u een deel van de fenolfase (roze stof) of het grensvlak (wit troebel stof tussen de waterige fase en de roze fase) onjuist hebt gepipetteerd. Als je een lage ratio meet, zoals je deed, betekent dit waarschijnlijk dat je in je uiteindelijke DNA-extract lijkt te hebben (een) dingen die geen DNA zijn in uw oplossing, en/of (B) een zeer lage concentratie DNA.

Als je vermoedt dat je genoeg DNA hebt, kun je zuiveren om te proberen niet-nucleïnezuren te verwijderen. Met zulke lage verhoudingen vermoed ik echter dat je DNA helemaal opnieuw moet extraheren; het lijkt erop dat je niet genoeg hebt om te redden door simpelweg opnieuw te zuiveren.

Welke methode heb je gebruikt om je DNA te extraheren? Wat bedoel je met filteren?


Invoering

De mondholte herbergt een van de meest diverse microbiomen in het menselijk lichaam [1]. Binnen de mondholte komen verschillende specifieke niches voor, waaronder die in plaque en speeksel [2, 3], waar dysbiose en de aanwezigheid van specifieke microben geassocieerd kunnen worden met ziekte [4-6]. De keuze van het DNA-extractieprotocol heeft het potentieel om onze perceptie van de microbioomstructuur te beïnvloeden. DNA-extractie is mogelijk via verschillende cellysisprocedures, waaronder chemische, enzymatische, mechanische en warmte. Recente studies tonen aan dat de cellysismethode die wordt gebruikt tijdens DNA-extractie uit orale monsters het herstel van specifieke bacteriële phyla kan beïnvloeden [7]. Mechanische lysis verhoogt het aantal verschillende bacteriële phyla dat uit speeksel wordt gewonnen [7], terwijl de toevoeging van lysozym aan mechanische lysis de algehele bacteriële DNA-opbrengst uit speeksel verbetert [8]. Evenzo maximaliseert in plaque een mechanische lysisstap en de toevoeging van lysozyme het herstel op soortniveau [9]. Omdat alle methoden inherente vooroordelen hebben, is een benadering die een waarheidsgetrouwe weergave van het orale microbioom biedt, van vitaal belang als we de klinische manifestaties ervan beter willen begrijpen.

Studies naar DNA-extractiebias hebben zich grotendeels gericht op de bacteriële bestanddelen van het orale microbioom, dus gegevens met betrekking tot de schimmelgemeenschap (mycobioom) ontbreken in vergelijking. Identieke gastheer- (menselijke) en schimmelsequenties op 18S rRNA-genprimerbindingsplaatsen maken dit gen tot een ongeschikt doelwit voor veel menselijke monsters, aangezien de verkregen sequenties voornamelijk van mensen afkomstig kunnen zijn in plaats van van schimmels. Mede om deze reden is de intergene internal transcribed spacer (ITS)-regio een aantrekkelijk alternatief geworden voor 18S-rRNA-gensequencing voor analyses van schimmelgemeenschappen, vanwege de grotere sequentievariabiliteit die het onderscheidt van het gastheer-DNA en ook een grotere taxonomische resolutie mogelijk maakt [ 10]. De voordelen van ITS-sequencing hebben echter nog niet geleid tot een sterk verbeterd begrip van het orale mycobioom. Tot op heden hebben slechts een handvol onderzoeken geprobeerd deze gemeenschap te beschrijven, met nog minder nadruk op hoe DNA-extractie de representatie ervan kan beïnvloeden [11–13].

Fysische en chemische interacties vinden plaats tussen bacteriën en schimmels in de orale omgeving, die de structuur en het gedrag van de orale microbiële gemeenschap sturen en mogelijk bijdragen aan de pathogenese van orale ziekten [14-16]. Daarom zou het voordelig zijn om gelijktijdig DNA van zowel bacteriële als schimmelgemeenschappen te bestuderen om de klinische associaties van zowel intra- als interdomeinrelaties te begrijpen. Hier evalueren we systematisch vier genomische DNA-extractiemethoden (gDNA) om bacteriële en schimmelgemeenschapsprofielen te vergelijken en te bepalen welke methoden een geschikte weergave bieden van microbiële diversiteit in menselijke tandplak- en speekselmonsters.


9 juni 2021 - Technique Talk: PCR-kwaliteit en opbrengst optimaliseren

Het Scientist Creative Services-team in samenwerking met MilliporeSigma
29 mrt 2021

GRATIS webinar

woensdag 9 juni 2021
14.30 - 15.30 uur, Oosterse tijd

Verschillende factoren zijn van invloed op het succes van PCR. Afgezien van het ontwerp van de primer, zijn de twee belangrijkste de kwaliteit van de template en de robuustheid van de polymerase. Harde workflows voor monstervoorbereiding kunnen nucleïnezuren beschadigen, waardoor het aantal beschikbare doelen voor het polymerase-enzym wordt verminderd. Dit kan selectiebias in het monster introduceren, dat vervolgens wordt versterkt en overdreven tijdens PCR. Wat de robuustheid van polymerase betreft, kunnen reagentia die worden gebruikt en niet voldoende worden verwijderd tijdens de monstervoorbereiding, polymerasen remmen. Bovendien kunnen de enzymen vatbaar zijn voor verkeerde lezingen die fouten introduceren.

Gelukkig zijn er manieren om deze valkuilen te vermijden. Nieuwe technologieën zoals GenElute ™ -E-zuivering zorgen voor zachtere, gestroomlijnde workflows die schade verminderen en vooroordelen minimaliseren. Deze workflows gaan gepaard met superieure polymerase-enzymen die lagere foutenpercentages bieden en remmende verontreinigingen kunnen overwinnen.

leerdoelen

• Veelvoorkomende chemische en biologische onzuiverheden die moeten worden vermeden tijdens de extractie van nucleïnezuur
• Strategieën voor het optimaliseren van de DNA/RNA-kwaliteit om de opbrengst van PCR-reacties te verbeteren
• Een polymerase selecteren voor robuuste PCR-assays uit ruwe monsters

Maak kennis met de instructeur:

Katherine Mecheling
Wetenschapper
MilliporeSigma


Materialen en methodes

Ethische uitspraak

Alle studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Missouri. Voor dieren die eigendom zijn van de overheid (hond en kat) werd voorafgaande toestemming van de eigenaar verkregen voordat fecale monsters werden genomen.

Monsterverzameling

Zebravismonsters: Zebravis (Danio rerio) werden onderworpen aan euthanasie met 0,1% kruidnagelolie in aquariumwater, en het gehele maagdarmkanaal werd verwijderd en in een steriele cryovial van 2 ml geplaatst. De weefsel- en fecale inhoud werden onmiddellijk ingevroren en gedurende twee weken voorafgaand aan DNA-extractie in een vriezer van -80°C bewaard. Muis (Mus musculus) monsters: vijf vers geëvacueerde fecale pellets per muis werden in een steriele Eppendorf-buis van 1,5 ml geplaatst. Monsters werden onmiddellijk ingevroren en gedurende twee weken in een vriezer van -80°C bewaard. Voorafgaand aan elke extractiemethode werd één fecale pellet per muis uit de vriezer verwijderd en werd de extractie uitgevoerd zoals hieronder beschreven. Kat (Felis domesticus), hond (Canis vertrouwd), en paard (Equus caballus) monsters: vers geëvacueerde fecale monsters werden verzameld van particuliere katten en honden. Vers geëvacueerde fecale monsters van paarden werden verkregen van paarden die aanwezig waren in het Veterinary Medical Teaching Hospital van de Universiteit van Missouri om redenen die geen verband houden met gastro-intestinale aandoeningen. Na verzameling werden monsters in conische buizen van 50 ml geplaatst en gedurende twee weken voorafgaand aan DNA-extractie in een vriezer van -80°C bewaard. Een klein stukje fecaal materiaal werd onmiddellijk voorafgaand aan de uitvoering van elke extractiemethode uit het bevroren monster verwijderd. Het resterende monster werd teruggeplaatst in de vriezer.

DNA-extractie

Al het DNA werd geëxtraheerd en gekwantificeerd aan het Metagenomics Center van de Universiteit van Missouri (MUMC).

Qiagen DNeasy-kit

DNA-extractie werd uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant met kleine aanpassingen om mechanische verstoring mogelijk te maken. In het kort, voor katten-, honden- en paardenmonsters werd 25 mg uitwerpselen in een steriele buis van 2 ml met ronde bodem geplaatst die 500 L steriele PBS en een roestvrijstalen kraal met een diameter van 0,5 cm bevatte. Monsters werden mechanisch verstoord met behulp van een TissueLyser II (Qiagen, Venlo, Nederland) gedurende 3 minuten bij 30 Hz, gevolgd door 5 minuten centrifugeren bij 200 x g. Een volume van 200 L supernatant werd verwijderd en in een steriele Eppendorf-buis van 1,5 ml geplaatst. Een gelijk volume buffer AL werd toegevoegd en de monsters werden daarna verwerkt volgens het protocol van de fabrikant. Voor muizenmonsters werd één fecale pellet in een steriele buis met ronde bodem van 2 ml met 500 L steriele PBS en een roestvrijstalen kraal met een diameter van 0,5 cm geplaatst en verwerkt zoals hierboven beschreven. Voor vismonsters werd het gehele maagdarmkanaal in een geautoclaveerde buis van 2 ml met ronde bodem van 500 L en een roestvrijstalen kraal van 0,5 cm diameter geplaatst en verwerkt zoals hierboven beschreven. Alle monsters werden geëlueerd in 200 L AE-buffer.

MoBio PowerFecal-kit

DNA-extractie werd uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant met kleine aanpassingen vanwege de beschikbaarheid van apparatuur. In het kort, voor katten-, honden- en paardenmonsters werd 0,25 mg fecaal monster toegevoegd aan de droge kraalbuis met 750 L kraaloplossing en voorzichtig gevortext. Cl-oplossing werd toegevoegd, het monster werd kort gevortext en gedurende 10 minuten bij 65°C geïncubeerd volgens het aanbevolen protocol. Monsters werden 10 minuten geschud. in een TissueLyser II (Qiagen, Venlo, Nederland) op 30Hz. Monsters werden gedurende 1 minuut bij 13.000 x g gecentrifugeerd, het supernatant werd overgebracht naar de meegeleverde 2 ml verzamelbuis en de rest van het protocol werd gevolgd zoals aanbevolen door de fabrikant. Voor muizenmonsters werd één fecale pellet toegevoegd aan de droge kraalbuis met 750 L kraaloplossing en verwerkt zoals hierboven beschreven. Voor vismonsters werd het gehele maagdarmkanaal in de droge kraalbuis met 750 L kraaloplossing geplaatst en verwerkt zoals hierboven beschreven. Alle monsters werden geëlueerd in 100 L oplossing C6.

Qiagen QIAamp Cador Pathogen Mini-kit

DNA-extractie werd uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant met kleine aanpassingen vanwege de beschikbaarheid van apparatuur. In het kort, voor katten-, honden- en paardenmonsters werd 25 mg uitwerpselen in een steriele buis met ronde bodem van 2 ml geplaatst die 500 L steriele PBS en een roestvrijstalen kraal met een diameter van 0,5 cm bevatte. Monsters werden mechanisch verbroken met behulp van een TissueLyser II (Qiagen, Venlo, Nederland) gedurende 2 minuten bij 25 Hz, gevolgd door 2 minuten centrifugeren bij 14.000 x g. Een volume van 400 L supernatant werd verwijderd en in een steriele buis van 2 ml met schroefdop geplaatst die 2 mg steriele glasparels en 100 L lysisbuffer ATL bevatte. Monsters werden gedurende 10 minuten op een TissueLyser II (Qiagen, Venlo, Nederland) verwerkt. bij 50 Hz en de rest van het protocol werd gevolgd zoals aanbevolen door de fabrikant. Voor muizenmonsters werd één fecale pellet in een steriele buis met ronde bodem van 2 ml geplaatst die 500 μL steriele PBS en een roestvrijstalen kraal met een diameter van 0,5 cm bevatte en het monster werd verwerkt zoals hierboven beschreven. Voor vismonsters werd het gehele maagdarmkanaal in een steriele buis met ronde bodem van 2 ml met 500 μL steriele PBS en een roestvrijstalen kraal van 0,5 cm diameter geplaatst en het monster werd verwerkt zoals hierboven beschreven. Alle monsters werden geëlueerd in 150 L AE-buffer.

Qiagen QIAamp DNA Kruk Mini Kit

DNA-extractie werd uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant. In het kort, voor katten-, honden- en paardenmonsters werd 200 mg uitwerpselen in een steriele buis van 2 ml met ronde bodem geplaatst die 1,4 ml ASL-lysisbuffer bevat en de rest van het protocol werd gevolgd zoals beschreven door de fabrikant. Voor muizenmonsters werd één fecale pellet in een steriele buis van 2 ml met ronde bodem geplaatst die 1,4 ml lysisbuffer bevatte en het monster werd verwerkt zoals hierboven beschreven. Voor vismonsters werd het gehele maagdarmkanaal in een steriele buis van 2 ml met ronde bodem geplaatst die 1,4 ml lysisbuffer bevatte en het monster werd verwerkt zoals hierboven beschreven. Alle monsters werden geëlueerd in 200 L AE-buffer.

Isopropanol DNA-extractie

DNA-extractie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [18]. In het kort, voor katten-, honden- en paardenmonsters werd 25 mg uitwerpselen in een steriele buis van 2 ml met ronde bodem van 800 L lysisbuffer (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA en 4 % natriumdodecylsulfaat) en een roestvrijstalen kraal met een diameter van 0,5 cm. Monsters werden mechanisch ontwricht met behulp van een TissueLyser II (Qiagen, Venlo, Nederland) gedurende 3 minuten bij 30 Hz, gevolgd door incubatie bij 70°C gedurende 20 minuten met periodieke vortexing. Monsters werden gedurende 5 minuten bij 5000 x g gecentrifugeerd en het supernatant werd vervolgens overgebracht naar een steriele Eppendorf-buis van 1,5 ml die 200 L 10 mM ammoniumacetaat bevatte. Lysaten werden gevortext, 5 min op ijs geïncubeerd en vervolgens gecentrifugeerd. Supernatant werd overgebracht naar een steriele Eppendorf-buis van 1,5 ml en één volume gekoelde isopropanol werd toegevoegd. Monsters werden 30 minuten op ijs geïncubeerd. en vervolgens gecentrifugeerd bij 16.000 x g, bij 4 ° C, gedurende 15 minuten. De resulterende DNA-pellet werd gewassen met 70% ethanol en opnieuw gesuspendeerd in 150 L Tris-EDTA (10 mM Tris en 1 mM EDTA), gevolgd door toevoeging van 15 L proteïnase K en 200 μL AL Buffer. Monsters werden gedurende 10 minuten bij 70°C geïncubeerd. en 200 μL 100% ethanol werd aan de buizen toegevoegd. Monsters werden gemengd door voorzichtig pipetteren en de inhoud werd overgebracht naar een spinkolom uit de DNeasy-kit. Het DNA werd gezuiverd volgens de instructies van de fabrikant en geëlueerd in 200 L EB-buffer. Voor muizenmonsters werd één fecale pellet in een steriele buis van 2 ml met ronde bodem geplaatst die lysisbuffer en een roestvrijstalen kraal met een diameter van 0,5 cm bevatte en het monster werd verwerkt zoals hierboven beschreven. Voor vismonsters werd het gehele maagdarmkanaal in een steriele buis van 2 ml met ronde bodem geplaatst die lysisbuffer en een roestvrijstalen kraal met een diameter van 0,5 cm bevatte en het monster werd verwerkt zoals hierboven beschreven. Alle monsters werden geëlueerd in 200 l EB-buffer.

Kwantificering en beoordeling van zuiverheid

Voor alle extractiemethoden werden de DNA-concentraties fluorometrisch bepaald (Qubit dsDNA BR-assay, Life Technologies, Carlsbad CA) en de zuiverheid werd beoordeeld via 260/280 en 260/230 absorptieverhoudingen, zoals bepaald via spectrofotometrie (Nanodrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). Monsters werden tot sequencing bij -20°C bewaard.

Bibliotheekconstructie en 16S rRNA-sequencing

Bibliotheekconstructie en sequentiebepaling werden uitgevoerd in de DNA Core-faciliteit van de Universiteit van Missouri. De DNA-concentratie van monsters werd fluorometrisch bepaald en alle monsters werden genormaliseerd tot 3,51 ng/μL voor PCR-amplificatie. Bacteriële 16S-rRNA-amplicons werden gegenereerd via amplificatie van het V4-hypervariabele gebied van het 16S-rRNA-gen met behulp van enkelvoudig geïndexeerde universele primers (U515F/806R) geflankeerd door Illumina-standaardadaptersequenties en de volgende parameters: 98°C (3:00) +[ 98°C (0:15) +50°C (0:30) +72°C (0:30) ] × 25 cycli +72°C (7:00) . Amplicons werden vervolgens samengevoegd voor sequencing met behulp van het Illumina MiSeq-platform en V2-chemie met 2 × 250 bp gepaarde uitlezingen, zoals eerder beschreven [18]. Monsters die meer dan 10.000 aflezingen retourneren, werden geacht een succesvolle amplificatie te hebben.

Informatica-analyse

Assemblage, binning en annotatie van DNA-sequenties werd uitgevoerd in de MU Informatics Research Core Facility. In het kort, aaneengesloten DNA-sequenties werden geassembleerd met behulp van FLASH-software [19], en geruimd als ze kort bleken te zijn na het trimmen voor een basiskwaliteit van minder dan 31. Qiime v1.8 [20]-software werd gebruikt om uit te voeren de novo en op referentie gebaseerde chimera-detectie en -verwijdering, en resterende aaneengesloten sequenties werden toegewezen aan operationele taxonomische eenheden (OTU's) via de novo OTU-clustering en een criterium van 97% nucleotide-identiteit. Taxonomie werd toegewezen aan geselecteerde OTU's met behulp van BLAST [21] tegen de Greengenes-database [22] van 16S-rRNA-sequenties en taxonomie. Hoofdcomponentanalyses werden uitgevoerd met behulp van ¼ root-getransformeerde OTU relatieve abundantiegegevens via een niet-lineair iteratief partieel kleinste kwadraten (NIPALS) algoritme, met behulp van een open access Excel-macro die verkrijgbaar is bij het Riken Institute (//prime.psc.riken. jp/Metabolomics_Software/StatisticalAnalysisOnMicrosoftExcel/index.html).

Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met gebruikmaking van Sigma Plot 12.3 (Systat Software Inc., Carlsbad, CA). Verschillen tussen DNA-extractiemethoden in totale DNA-concentratie werden bepaald met behulp van ANOVA met een post-hoctest van Student Newman-Keuls. Verschillen in relatieve abundantie van phylum (niet-zeldzaam) na succesvolle NGS-amplificatie, d.w.z. het bereiken van 10.000 sequenties, werden bepaald met behulp van ofwel ANOVA met Student Newman-Keuls post-hoctest of een t-test met Mann-Whitney post-hoctest. Ontvanger werkende karakteristieke (ROC) curves werden gegenereerd uit 260/280 en 260/230 absorptieverhoudingen verkregen uit monsters van elke gastheersoort met gebruikmaking van succes van amplificatie als de binaire classificator. Statistische verschillen in microbiële diversiteit werden bepaald op een uniforme diepte met behulp van ANOVA met Student Newman-Keuls post hoc-test. Resultaten werden als statistisch significant beschouwd voor: P waarden ≤ 0,05.


Achtergrond: Dit is de derde in een reeks publicaties waarin formele methodevalidatie voor de verwerking van biospecimen wordt gepresenteerd in het kader van accreditatie in laboratoria en biobanken. We rapporteren hier optimalisatie van een ontlastingsverwerkingsprotocol dat is gevalideerd voor geschiktheid voor doeleinden in termen van downstream-DNA-gebaseerde analyses.

Methoden: Het verzamelen van ontlasting werd aanvankelijk geoptimaliseerd in termen van monsterinvoerhoeveelheid en supernatantvolume met behulp van hondenkruk. Drie DNA-extractiemethoden (PerkinElmer MSM I ® , Norgen Biotek All-In-One ® , MoBio PowerMag ® ) en zes soorten opvangcontainers werden geëvalueerd met menselijke ontlasting in termen van DNA-kwantiteit en -kwaliteit, DNA-opbrengst en de reproduceerbaarheid ervan door spectrofotometrie, spectrofluorometrie en kwantitatieve PCR, DNA-zuiverheid, SPUD-assay en op 16S-rRNA-gensequentie gebaseerde taxonomische handtekeningen.

Resultaten: Het optimale MSM I-protocol omvat een ontlastingsmonster van 0,2 g en 1000 L supernatant. De MSM I-extractie was superieur in termen van DNA-kwantiteit en kwaliteit in vergelijking met de andere twee geteste methoden. Optimale resultaten werden verkregen met gewone Sarstedt-buisjes (zonder stabilisator, die onmiddellijk moesten worden ingevroren en bewaard bij -20 °C of -80 °C) en Genotek-buisjes (met stabilisator en RT-bewaring) in termen van DNA-opbrengsten (totaal, humaan, bacterieel, en dubbelstrengs) volgens spectrofotometrie en spectrofluorometrie, met lage opbrengstvariabiliteit en goede DNA-zuiverheid. Er werden geen remmers geïdentificeerd bij 25 ng/μL. Het protocol was reproduceerbaar in termen van DNA-opbrengst tussen verschillende ontlastingshoeveelheden.

conclusies: We hebben een methode voor het verzamelen van ontlasting gevalideerd die geschikt is voor downstream DNA-metagenomische analyse. DNA-extractie met de MSM I-methode met behulp van Genotek-buisjes werd als optimaal beschouwd, met eenvoudige logistiek in termen van verzameling en verzending en biedt de mogelijkheid tot automatisering. Laboratoria en biobanken moeten ervoor zorgen dat protocolvoorwaarden systematisch worden vastgelegd in de scope van accreditatie.


Biases tijdens DNA-extractie beïnvloeden de karakterisering van de microbiota geassocieerd met larven van de Pacifische witte garnaal, Litopenaeus vannamei

Voor een diepgaande karakterisering van de microbiota geassocieerd met garnalenlarven, is een zorgvuldige selectie van de DNA-isolatieprocedure van het grootste belang om vooroordelen te vermijden die worden geïntroduceerd in gemeenschapsprofilering. Vier E.Z.N.A.™ DNA-extractiekits, d.w.z. Bacterial, Mollusc, Stool en Tissue DNA Kits, afgekort als Ba, Mo, St en Ti, werden aanvankelijk geëvalueerd met zoea 2 (Z2) larven van de Pacifische witte garnaal (Litopenaeus vannamei) door 16S amplicon-sequencing op een Illumina MiSeq-platform. Verdere karakterisering van aanvullende larvale monsters, met name nauplii 5 (N5), mysis 1 (M1) en postlarven 1 (P1), werd uitgevoerd met Ba- en St-kits om het veranderende microbiota-profiel tijdens de garnalenbroedperiode te onderzoeken. De resultaten van de Z2-monsters toonden aan dat de DNA-opbrengsten van de vier kits aanzienlijk varieerden (P < 0,05), terwijl er geen significante verschillen werden gedetecteerd in de α-diversiteitsmetrieken van de microbiota. Daarentegen won de St-kit, met de laagste DNA-opbrengst en -kwaliteit, met succes DNA van Gram-positieve en darm-geassocieerde bacteriële groepen, terwijl de Ba-kit, die maximale microbiota-overeenkomst vertoonde met de Mo-kit, de beste reproduceerbaarheid vertoonde. Er werden met name significante verschillen waargenomen in relatieve abundanties van de meest dominante taxa bij het vergelijken van de resultaten van de Ba- en St-kits op Z2-, M1- en P1-monsters. Bovendien is de geïdentificeerde bacteriële gemeenschap aanzienlijk verschoven met de ontwikkeling van de larven, ongeacht de DNA-extractiekits. De vooroordelen over DNA-herstel die voortkomen uit de larvale microbiota kunnen te wijten zijn aan verschillende protocollen voor cellysis en zuivering. Daarom kan gecombineerde toepassing van verschillende DNA-extractiemethoden de identificatie van sommige biologisch belangrijke groepen vergemakkelijken vanwege hun complementaire effecten. Deze aanpak moet voldoende aandacht krijgen voor een grondig begrip van de larven-geassocieerde microbiota van de penaeid garnaal.

trefwoorden: Bacteriële gemeenschap Commerciële kit DNA-extractie High-throughput sequencing Litopenaeus vannamei larven.

Belangenconflict verklaring

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

Figuren

Figuur 1. Detrended correspondentieanalyse van de…

Figuur 1. Detrended correspondentieanalyse van de Z2 larvale microbiota uit DNA geëxtraheerd met vier...

Figuur 2. Relatieve overvloed aan dominante bacteriële...

Figuur 2. Relatieve overvloed aan dominante bacteriële phyla of klassen geassocieerd met geëxtraheerde Z2-larven...

Figuur 3. Samenstelling en overvloed aan dominante…

Figuur 3. Samenstelling en abundantie van dominante bacteriële phyla of klassen geassocieerd met L. vannamei…

Figuur 4. Dominante bacteriële families geassocieerd met...

Figuur 4. Dominante bacteriële families geassocieerd met de L. vannamei larven in stadia N5 (A),…

Figuur 5. Heatmap van clusterrelaties…

Figuur 5. Heatmap van clusterrelaties van op kits gebaseerde replicaten en dominante OTU-gebaseerde taxa van...


DNA-bronnencentrum

Hoe extraheer je hoogwaardig DNA uit vele weefseltypes, in verschillende staat van ontbinding? Geoptimaliseerde methoden zijn de oplossing, voor elke monsterbron.

DNA-bankgids

Uitgebreide kennis over het isoleren en kwantificeren van hoogwaardig DNA. Deze handleiding is stap voor stap.

Op zoek naar de juiste gDNA-zuiveringskit?

Door kits te categoriseren op monsterbron, DNA-type en platform, helpt het selectiewiel u snel de juiste kit te kiezen.

De blauwdruk van het leven, vereenvoudigd

DNA komt in verschillende vormen voor in dieren, planten, bacteriën en virussen. Deze handige poster illustreert de basis van DNA. Je kunt het gebruiken om je lab te versieren en jonge studenten kennis te laten maken met de fascinerende wereld van de moleculaire biologie.

Video: Hoe meer DNA te zuiveren uit uitdagende weefsels

Dr. Dominic O'Neal legt uit hoe QIAamp Fast DNA Tissue Kit genomisch DNA levert van uitdagende weefselmonsters met behulp van een snelle combinatie van mechanische, chemische en enzymatische lysis. De poster die in de video wordt gepresenteerd, is hier te downloaden.

DNA-dag (25 april) herdenkt de ontdekking en het begrip van DNA en de wetenschappelijke vooruitgang die dit begrip mogelijk heeft gemaakt. We herinneren ons de tijd in 1953 toen James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins, Rosalind Franklin en collega's artikelen publiceerden over de structuur van DNA in het tijdschrift Nature.

Voor DNA-dag 2020 hebben we enkele opmerkelijke verhalen over DNA-onderzoek verzameld om met u te delen uit alle wetenschapsgebieden. De meeste hiervan zijn ontdekkingen die zeer recent zijn gedaan.

QIAamp DNA Micro-handboek Download PDF
QIAamp DNA Mini Blood Mini-handboek Download PDF
Snelstartprotocol: QIAamp DNA Mini Kit Download PDF
QIAamp DNA Blood Midi/Maxi-handboek Download PDF
QIAamp DNA FFPE-weefselhandboek Download PDF
GeneRead DNA FFPE-handboek Download PDF
QIAamp Fast DNA Stool Mini-handboek (isolatie van gastheer-gDNA uit ontlastingsmonsters) Download PDF
QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit-handboek (isolatie van microbieel DNA uit ontlasting- en darmmonsters) Download PDF
QIAGEN Genomic DNA-handboek Download PDF
Snelstartprotocol: QIAGEN Genomic DNA-voorbereiding Download PDF
MagAttract HMW DNA Kit-handboek Download PDF
DNeasy Handboek voor bloed en weefsels Download PDF
Snelstartprotocol DNeasy Blood & Tissue Kit Download PDF
DNeasy Plant Pro Kit-handboek Download PDF

QIAamp Fast DNA Kruk's160Mini Kit

Voor isolatie van gDNA uit ontlastingsmonsters

Snelle zuivering van hoogwaardig genomisch DNA (humaan en bacterieel) uit verse of ingevroren ontlastingsmonsters.

Snelle en gemakkelijke DNA-extractie op basis van silica zonder fenol of chloroform

Voor spin-kolom of 96-wells extractie van totaal DNA uit dierlijk bloed en weefsels en uit cellen, gist, bacteriën of virussen.

QIAamp Fast DNA-weefselkit

Voor snelle isolatie van genomisch DNA uit solide weefselmonsters

Opbrengstverbeteringen van 5 tot 10 keer in vergelijking met standaardmethoden Verminderde lysistijd van uren tot slechts 15 minuten.

QIAamp DNA-bloedminikit

Ontworpen voor de verwerking van tot 200 '181l vers of bevroren menselijk volbloed

Voor de zuivering van maximaal 12 µg genomisch, mitochondriaal of viraal DNA uit bloed en verwante lichaamsvloeistoffen.

Aanbevolen instrumenten:

Voor monsterverstoring met gemiddelde tot hoge doorvoer voor moleculaire analyse

Verstoort gelijktijdig meerdere biologische monsters door schudden op hoge snelheid in plastic buizen met roestvrij staal, wolfraamcarbide of glasparels.

Voor volledig geautomatiseerde extractie van nucleïnezuur met de spinkolomkits van QIAGEN

Geavanceerde digitale mogelijkheden en connectiviteit Met QIAcube Connect kunnen onderzoekslaboratoria hun bekende QIAGEN spin-kolom extractie- en zuiveringsprotocollen volledig automatiseren en volgen - met één druk op de knop.


Invoering

Momenteel hangt moleculaire tumorprofilering grotendeels af van de beschikbaarheid van een weefselbiopsie voor solide kankertypes [1-3]. Hoewel weefselbiopten soms op verschillende tijdstippen tijdens het ziekteverloop van de patiënt nodig zijn, kan het verkrijgen van een weefselbiopsie problematisch zijn omdat dit vaak zeer invasief is en een zeker risico voor de patiënt met zich meebrengt, afhankelijk van de locatie van de tumor. Bovendien bevat de biopsie niet altijd voldoende tumorcellen voor moleculaire profilering. Bovendien, aangezien een weefselbiopsie slechts een momentopname van de tumor vertegenwoordigt, is het bestuderen van tumorheterogeniteit vaak niet haalbaar met weefselbiopten [4-6].

Een alternatieve methode om de tumor op moleculair niveau te karakteriseren is vloeibare biopsie. Het maakt de analyse mogelijk van met kanker geassocieerde biomarkers in vloeibaar biologisch materiaal, meestal bloed. Een vloeibare biopsie bestaat uit verschillende circulerende componenten die zowel afkomstig zijn van niet-kwaadaardig weefsel als van kankerweefsel. Deze circulerende componenten omvatten circulerend celvrij DNA (cfDNA), circulerend celvrij RNA (cfRNA), microRNA (miRNA), tumoreiwitten, circulerende tumorcellen (CTC's), extracellulaire blaasjes (EV's) en tumor-opgeleide bloedplaatjes (TEP's) [ 4, 7, 8]. Vloeibare biopsieën hebben een groot potentieel om de beperkingen van weefselbiopten te overwinnen. Ze maken met name herhaalde bemonstering van kankerpatiënten mogelijk om een ​​meer gedetailleerde patiëntbewaking te vergemakkelijken, een nauwkeurigere en relevantere weergave van de huidige ziektestatus te bieden, het onderzoek naar tumorheterogeniteit mogelijk te maken en aanvullende informatie te verschaffen voor de behandelingsselectie [6, 9] . Bij longkanker kan het gebruik van de Cobas Epidermale groeifactorreceptor (EGFR) Mutatietest v2 (Roche, Basel Zwitserland) is goedgekeurd voor de detectie van: EGFR varianten door cfDNA-analyse door de Food and Drug Administration (FDA) voor behandelingsselectie [10-12]. In mei 2019 de therascreen® PIK3CA De RGQ PCR-kit heeft goedkeuring gekregen van de Amerikaanse regelgevende instanties als begeleidende diagnostiek om te helpen bij het identificeren van borstkankerpatiënten die in aanmerking komen voor behandeling met PIQRAY (Alpelisib). Momenteel wordt vloeibare biopsie vooral gebruikt in specifieke klinische situaties, bijvoorbeeld wanneer de beschikbaarheid van weefsel beperkt en/of onvoldoende is voor moleculair testen [2, 13].

Andere vloeistoffen zoals urine, speeksel en hersenvocht kunnen ook worden gebruikt, maar zijn minder onderzocht in vergelijking met bloedmonsters. Over het algemeen is cfDNA dat vrijkomt in de bloedcirculatie door apoptose of necrose tussen de 116-161 bp lang [14-16]. Gegevens over circulerend foetaal DNA in de urine suggereren dat cfDNA in de urine zelfs meer gefragmenteerd is, variërend van 40-250 bp [17-19]. Recent wordt de focus verlegd naar het onderzoek van urine voor moleculaire tumorprofilering. In vergelijking met bloedafname zijn op urine gebaseerde biopsieën volledig niet-invasief, maken zelfafname thuis mogelijk en verhogen bijgevolg het comfort van de patiënt voor enkelvoudige afname of herhaalde afname. Daarom bieden ze een veelbelovend alternatief voor weefsel- en bloedmonsters [20, 21]. Ondanks het hoge potentieel van urine als vloeibare biopsie, is er geen gestandaardiseerd protocol voor pre-analytische behandeling van urine om cfDNA te bewaren voor downstream-toepassingen, wat problematisch is omdat 32-75% van alle testfouten het gevolg zijn van problemen die zich voordoen tijdens de pre-analytische fase [22-24]. Het gebruik van geschikte pre-analytische omstandigheden is essentieel om een ​​hoge opbrengst aan cfDNA te bereiken en om een ​​nauwkeurige en gevoelige detectie van moleculaire biomarkers in urine te bereiken. De optimalisatie en standaardisatie van de pre-analytische condities in bloed zijn al door veel onderzoeksgroepen bestudeerd [24-29]. Daarentegen zijn slechts enkele onderzoeken gepubliceerd in urine [21, 23, 30, 31]. Om deze reden hebben we verschillende pre-analytische omstandigheden onderzocht om te bepalen welke het meest geschikt zijn om urinemonsters van hoge kwaliteit te genereren die geschikt zijn voor moleculaire analyse. Idealiter zou de aanwezigheid van lange genomische DNA (gDNA) fragmenten (>500 bp), afgeleid van intacte niet-kwaadaardige cellen uit de urinewegen, de toch al lage concentratie van van tumor afgeleid cfDNA in de monsters niet moeten verdunnen. Deze verdunning zal onvermijdelijk de gevoeligheid van de gebruikte detectietechnieken verminderen en nauwkeurige detectie van moleculaire biomarkers bemoeilijken. Om de gevoeligheid van urine-analyse te vergroten, was het doel van deze studie om de invloed van verschillende pre-analytische omstandigheden op de concentratie van cfDNA en genomisch DNA te bestuderen.


Verbetering van de DNA-kwaliteit en opbrengst van ontlastingsmonsters - Biologie

De DNeasy extractiekits (Qiagen) zijn eenvoudig, toegankelijk en veel gebruikt. Hoewel ontworpen voor specifieke steekproeftypes, hebben veel onderzoeken hun gebruik aangepast aan verschillende steekproeftypes. DNeasy PowerSoil, of aspecten daarvan, is gebruikt voor maag-, darm- of fecale analyse van ongewervelde dieren ( Knapp et al. 2010 , O'Rorke et al. 2015 ), vissen ( Koinari et al. 2013 , Bolnick et al. 2014 ), reptielen ( Lau et al. 2013 , Colston et al. 2015 ), vogels ( Vo en Jedlicka 2014 , Lewis et al. 2016 ), zoogdieren ( Parfrey et al. 2014 , Ishaq en Wright 2014 ) en in het bijzonder het menselijk microbioom Project (Aagaard et al. 2013). DNeasy Blood and Tissue is gebruikt voor studies van omgevings-DNA (eDNA) uit watermonsters (Rees et al. 2014, Spens et al. 2016, Niemiller et al. 2017). Although widely used, commercial kits are expensive and separate kits can be required for different sample types. DNA extraction, using commercial kits, is therefore a significant cost factor which limits the scope of experiments in molecular studies and increases the costs of genetic biodiversity monitoring.

Methods Solutions and reagents

Comparison of DNA yield and quality

For each sample type, three different samples (A, B and C) were selected for comparison (Table 1 ). Sample A represented a commonly encountered sample of its type whereas B and C were representative of more challenging samples.

Samples used for comparison of methods in this study. Shown are the amounts of each sample processed per extraction method: either Mu-DNA or the relevant commercial kit (Qiagen DNeasy).

Soil samples were collected from three soil types: A (garden soil high organic content), B (ephemeral pool sediment high clay content) and C (diesel polluted soil high contaminant levels). All samples were loosely mixed at collection. In sterile laboratory conditions, 5 g of each sample was put through a 2 mm mesh sieve to remove large particulate debris before being thoroughly homogenised with a pestle and mortar. The homogenate was separated into multiple 0.25 g (wet weight) subsamples and stored at -20 °C until required for extraction.

Stool samples were collected from three species with different diets: A (European hedgehog, Erinaceus europaeus omnivore), B (Greylag goose, Anser anser grazer) and C (Otter, Lutra lutra carnivore, high number of volatile organic compounds). In sterile laboratory conditions, each sample was thoroughly homogenised with a pestle and mortar. The homogenate was separated into multiple 0.25 g (wet weight) subsamples and stored at -20 °C until required for extraction.

Tissue samples were taken from ethanol preserved specimens of three species: A (Cichlid, Nimbochromis livingstonii muscle tissue), B (Woodlouse, Oniscus asellus high chitin content) and C (Earthworm, Lumbricus terrestris mucus rich with soil gut contents). Multiple 25 mg (dry weight) subsamples of specimens were removed and stored at -20 °C until required for extraction.

Three water samples types were collected: A (shallow eutrophic lake high sediment load and faecal matter), B (ephemeral pool mesocosm turbid, high algal content) and C (deep oligotrophic lake low particulate matter). After collection, samples were transported on ice and stored at 4 °C until filtered. Filtering took place less than 16 hours after collection in sterile laboratory conditions. Each water sample was thoroughly mixed by pouring and then split into two subsamples of equal volume. Subsamples were vacuum-filtered through sterile 47 mm diameter 0.45 μm Whatman cellulose nitrate membrane filters (GE Healthcare), labelled and stored at -20 °C until required for extraction.

Extracted DNA yield, purity and downstream inhibition

Extracted DNA integrity and molecular weight

Fish metabarcoding of lake water DNA extractions

Sample collection and preparation

A minimum of 2 l of water was collected from 13 shore sample sites around Windermere (Lake District, Cumbria, UK). Samples were transported on ice. Under sterile laboratory conditions, samples were thoroughly mixed by pouring and split into paired 1 l subsamples to be filtered. Filtering took place in less than 16 hours and filters were stored as above. DNA extractions followed the protocol of Mu-DNA : Water described above or DNeasy PowerWater. Identical lysis and purification conditions for both protocols were maintained: all filters were lysed in DNeasy PowerWater Bead Tubes and MB Spin Columns (Qiagen) were used for purification of all subsamples. Lysis was performed on a Vortex Genie (Scientific Industries) with Vortex Adapter (MoBio) at maximum speed for five minutes.

Bioinformatics and data analyses

metaBEAT, a custom bioinformatics pipeline ( https://github.com/HullUni-bioinformatics/metaBEAT ), was used to process sequencing outputs. The workflow consisted of the following steps: (i) demultiplexing (ii) trimming, merging and quality filtering (iii) chimera detection (iv) clustering (v) taxonomic assignment against a curated database. A low-frequency noise threshold approach was used to remove potential false positives from the metaBEAT data ( Hänfling et al. 2016 ), only records exceeding a minimum proportion (0.001) of read counts in a sample were accepted as “true” positive records. Remaining reads were converted to relative species abundance (%) of assigned reads.

All statistical analysis was performed in R 3.2.5 ( R Core Team 2016 ) using the VEGAN package ( Oksanen et al. 2017 ). DNA yield and purity measures for extractions were compared with a linear model using planned contrasts between methods per sample. Metabarcoding of lake water DNA extractions were analysed using an analysis of similarity (ANOSIM) of relative species abundance across all replicates between methods. Non-metric multidimensional scaling (NMDS) ordination was used to visualise differences in extraction methods across all replicates grouped by site and extraction.

Costing of extraction methods

Raw data and scripts are available on Open Science Framework ( https://doi.org/10.17605/osf.io/vrb4a) . Sequencing data are available from NCBI Sequence Read Archive (Bioproject: PRJNA473636, SRA accession numbers: SRR7234627–SRR7234708).

Results and discussion Extracted DNA yield, purity and downstream inhibition

We used A260/A280 en een260/A230 UV absorbance measures via spectrophotometry to determine the quality of DNA extractions as suggested by Olson and Morrow (2012) . The ideal measures for pure DNA are shown in Figure 2 , yet in some cases, they are exceeded. These measures can be influenced by many aspects, such as invertebrate chitin ( Athanasio et al. 2016 ) and RNA. Spectrophotometry of extracted DNA can be affected by the presence of co-extracted RNA by inflating A260 values, therefore the ratios used for purity evaluations are skewed upwards. In our study, we refrained from the use of RNase so as to give a true representation of the method in an unmodified state. Should RNA-free DNA be required for any sample type, we suggest an RNase A treatment for a short incubation period (<1 hour) post-lysis. As purity measures can be affected by many factors, extracted DNA quantity and quality can therefore only reliably be ascertained by a combination of high-sensitivity dsDNA assays, gel electrophoresis visualisation of extracted DNA and intensity of PCR amplification success.

Extracted DNA integrity and molecular weight

Integrity and molecular weight of soil, tissue and water sample extractions from the methods compared in this study. Shown are the highest yielding extractions per method from Soil C, Tissue A and Water B. Extractions are indicated by the relevant method for sample type DNeasy (Q) or Mu-DNA (M).

Fish metabarcoding of lake water DNA extractions

After the application of noise filtering thresholds to read count data, both methods detected the same 15 fish species previously recorded in Windermere ( Hänfling et al. 2016 ). Broadly, individually sequenced samples cluster by site when visualised with NMDS ordination with some variance between replicates (Supplementary file 2). Although species detected varied between method replicates per site (Supplementary file 3), there was no significant difference between methods in overall species relative abundance (ANOSIM: R = -0.02, p = 0.93) and both methods produced high similarity species profiles for the lake as a whole (Figure 5 ). This shows that Mu-DNA produces DNA of sufficient quality for metabarcoding approaches even when target DNA concentration is low and that no bias is introduced through the choice of extraction method.

Species profiles of Windermere from metabarcoding of extractions using the compared methods of this study. Relative species abundance (%) of assigned reads is given per method DNeasy PowerWater or Mu-DNA : Water. Positioning of species is arbitrary and arranged alphabetically. Diamonds indicate the position of low abundance species in the profiles for both methods.


QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit

Extracting microbial DNA from stool and gut samples can be challenging. Researchers will isolate higher yields of pure microbial DNA from stool and gut samples more efficiently with our new QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit.

The QIAamp Power Fecal Pro DNA Kit builds and improves on our original PowerFecal technology utilizing a novel bead tube and optimized chemistry for more efficient lysis of bacteria and fungi. Inhibitor removal has been streamlined, allowing researchers to eliminate challenging inhibitors from stool and gut samples faster. This results in total DNA that reveals higher alpha diversity through observed operational taxonomic units (OTUs) in downstream testing.

Isolation of DNA using the QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit can be automated on the QIAcube Connect.

Want to try this solution for the first time? Request a quote for a trial kit.

Uitvoering

Using improved technologies, the new QIAamp PowerFecal Pro Kit allows researchers to obtain higher yields of DNA from stool and gut samples compared with alternative methods (See: 'Higher yields of DNA with the QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit.').
Improved yields of higher quality DNA are also achieved when comparing the QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit to the first generation QIAamp PowerFecal DNA Kit when running stool and fungal samples (See: 'The new QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit enables the isolation of larger amounts of high quality DNA.').

Beginsel

The streamlined Inhibitor Removal Technology ® (IRT) used by the new QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit is highly efficient at removing inhibitors while still decreasing sample processing time. The QIAamp PowerFecal Pro DNA Kits also showed the highest A260/A280 ratios, near 1.8, of any other commercially available kit, indicating the absence of inhibitors. Less variability was also observed between the samples processed with QIAamp PowerFecal Pro DNA Kits (See: ‘Highly pure DNA isolated using the new QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit.’). Researchers using the QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit can identify a greater bacterial diversity with increased OTUs from stool samples compared with the first-generation QIAamp PowerFecal Kit and other commercially available kits (See: ‘Greater total number of bacterial OTUs isolated with the new QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit.’).

Procedure

Samples processed with the QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit are added to a bead beating tube. Rapid and thorough
homogenization occurs using mechanical and chemical methods. Once cells are lysed, our patented IRT is used to remove
inhibitors. Total genomic DNA is captured on a silica membrane in a spin-column format. DNA is then washed and eluted,
ready for downstream applications.


Bekijk de video: paardenpoep (Januari- 2022).