Informatie

Markervalidatie met behulp van transcriptoom- en genomische sequenties afgeleid van een enkele cel


Ik heb een SSR-markeranalyse uitgevoerd met behulp van een bioinformatisch hulpmiddel op enkele RNA-seq-gegevens van menselijke weefsels. Nu was mijn supervisor van mening dat we deze SSR moeten valideren op transcriptomische en genomische sequenties die zijn afgeleid van een enkele cel.

Mijn vraag is: waarom zou ik validatie doen op sequenties van een enkele cel? Bedankt voor het delen van uw idee en ervaring hier.


Ik denk dat je supervisor wil zien of er intercellulaire variatie is in de herhalingslengte en zo ja, de variatie wil berekenen. Dit kan worden vergeleken met inter-weefsel- of inter-individuele variatie.

Gewoonlijk zou u, wanneer u een pool van cellen voor een test neemt, de eigenschappen van individuele cellen uitgemiddelden.

Met behulp van sequencing kun je misschien de variabiliteit in de herhalingslengte vinden als je leest lang genoeg is. Volgens wikipedia zijn de SSR's 2-5 bp lange motieven die 5-50 keer worden herhaald. Dus de maximale lengte zou 250 bp zijn, wat een gemakkelijke taak is. U zou dus de fractie van de SSR's met een bepaalde lengte uit een gepoolde steekproef kunnen weten en een lengteverdeling kunnen verkrijgen. Dit is vrij eenvoudig als je de locus van de herhalingen kent en specifieke primers gebruikt voor sequencing.

Als u echter de exacte locus van uw SSR's niet kent en u willekeurige RNA/DNA-fragmentatie en totale RNA/DNAseq uitvoert, dan kunt u dat misschien niet zo gemakkelijk doen.

In ieder geval denk ik dat het gemakkelijker is om de locus te bepalen en gerichte sequencing uit te voeren in gepoolde monsters, dan eencellige RNAseq te doen (tenminste als het doel is om herhalingslengteverdeling te verkrijgen).


SCMarker: Ab initio-markerselectie voor transcriptoomprofilering van één cel

Affiliaties Afdeling Bioinformatica en Computational Biology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, Verenigde Staten van Amerika, Afdeling Genetica, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, Verenigde Staten van Amerika

Rollen Schrijven – recensie & redactie

Affiliation Department of Bioinformatics and Computational Biology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, Verenigde Staten van Amerika


Ontwikkeling en validatie van SSR-markers op basis van transcriptoomsequencing van Casuarina equisetifolia

Casuarina soorten worden gewaardeerd als pionierbomen voor bosbouw aan de kust. Versnellen Casuarina fokken voor robuustere, aantrekkelijkere en kouderesistente cultivars, is het essentieel om moleculaire marker-geassisteerde veredeling te introduceren. Gebaseerd op Casuarina equisetifolia transcriptoomgegevens, 10.291 EST-SSR-loci met de typen 2-6 nucleotide-herhalingen werden geïdentificeerd uit geassembleerde 118.270 unigenen. Elke 13,54 kb werd gemiddeld één EST-SSR gevonden en de distributiefrequentie van SSR's was 8,7%. De meest voorkomende herhalingsmotieven waren dinucleotide met AG/CT en trinucleotide met AAG/CTT. Een totaal van 150 SSR-markers werden willekeurig geselecteerd voor validatie, waarvan 15 duidelijke, reproduceerbare en polymorfe banden produceerden, en dus werden gebruikt voor genetische verwantschapsanalyse onder 26 genotypen van vier Casuarina en drie Allocasuarina soort. In totaal werden 42 banden geïdentificeerd, variërend van 2 tot 5 banden per locus met een gemiddelde van 2,8. De informatie-inhoud van het polymorfisme varieerde van 0,2624 tot 0,6177 met een gemiddelde waarde van 0,4265, wat wijst op een hoog niveau van polymorfisme. Het UPGMA-dendrogram onthulde een grote genetische variatie tussen soorten binnen twee geslachten, Allocasuarina en Casuarina. Ondertussen zijn de 15 zeer polymorfe Casuarina SSR-markeringen bleken ook overdraagbaar te zijn Casuarina en Allocasuarina soort. Deze waardevolle SSR-markers kunnen verder worden toegepast voor populatie- en evolutionaire genetische studies in Casuarinaceae, en zullen nuttig zijn bij de selectie en veredeling van Casuarina soorten voor het verbeteren van koude tolerantie.


Invoering

Het menselijk lichaam bevat een geavanceerd immuunsysteem dat het zelf onderscheidt van niet-eigen-antigenen. Dit vereist een adaptief systeem dat in staat is om te gaan met een groot aantal antigenen. T-cellen herkennen antigenen aan hun unieke T-celreceptor (TCR), ofwel van het TCRαβ of TCRγδ type. Ongeveer 95% van de T-cellen brengen een TCR'x003B1'x003B2-receptor tot expressie, bestaande uit een TCR'x003B1- en een TCR'x003B2-keten. Deze TCR-ketens zijn zeer divers in hun variabele domeinen. In elke afzonderlijke cel wordt een uniek voor TCR coderend gen gevormd door een complex recombinatieproces waarbij ofwel V- en J-genen (TCRα of TRA-locus) of V-, D- en J-genen (TCRβ of TRB-locus) betrokken zijn (1). Dit V(D)J-recombinatieproces genereert een enorme diversiteit aan TR-repertoire, vooral in de V(D)J-junctie of complementariteitsbepalende regio 3 (CDR3), die herkenning van een breed scala aan antigenen mogelijk maakt. Schattingen van het aantal mogelijke verschillende TCRαβ receptoren bedragen 10 12 (2, 3). TCRαβ +-cellen, die ofwel CD4 + (T-helper) of CD8 + (T-cytotoxische) zijn, bestaan ​​uit verschillende subsets die verschillende rijpingsstadia en -functies weerspiegelen. Antigeen-onervaren of weinig T-cellen hebben een breed, niet-geselecteerd TCR-repertoire (4) in vergelijking met antigeen-ervaren of geheugen-T-cellen die TCR-repertoires bevatten die meestal bestaan ​​uit specifieke antigeen-geselecteerde specificiteiten.

Assays om de diversiteit van het TCR-repertoire te bepalen, waren tot nu toe voornamelijk gericht op TCRβ-ketenprofilering, variërend van op DNA- (5) of RNA-sequencing gebaseerde (6) TRB-bulkassays tot op flowcytometrie gebaseerde eencellige TCRVβ-benaderingen (7). Een groot nadeel van de bulksequencing-benaderingen is het grote aantal cellen dat nodig is. Op flowcytometrie gebaseerde testen voor het analyseren van TCRV'x003B2-repertoirediversiteit op eencellig niveau zijn beperkt tot 24 verschillende TCRV'x003B2-families die samen slechts 70% van het normale menselijke TCRV'x003B2-repertoire dekken. Bovendien kan geen informatie over TCRα-profielen en dus de feitelijke samenstelling van de totale TCRαβ-receptor in een monster worden verkregen met behulp van een van deze benaderingen. Bovendien blijft het moeilijk om veranderingen in de diversiteit van het TCR'x003B1'repertoire te onderzoeken binnen een heterogene pool van T-cellen, of een laag-overvloedige populatie zoals antigeen-specifieke T-cellen zonder ze eerst te zuiveren of grote aantallen cellen te verwerven.

In de afgelopen jaren is eencellige transcriptomics een populaire benadering geworden en maakt het mogelijk om de heterogeniteit in genexpressie tussen individuele cellen en de ontdekking van kleine subpopulaties te detecteren (8). Onlangs is eencellige transcriptomics gecombineerd met TR-transcriptsequencing. Deze combinatie verschaft informatie over genexpressie en TCR-repertoire over een enkele celresolutie. Er bestaan ​​verschillende platforms voor eencellige gecombineerde TCR-repertoire en transcriptomics-analyse, waaronder 10xGenomics en meer recentelijk het ICELL8 Single-Cell System (9, 10). Eencellige transcriptomics vereist meestal 5� K-cellen (11�), maar er is weinig bekend over de mogelijkheden van het gebruik van deze op eencellige gebaseerde moleculaire tools voor het bevragen van klinisch relevante paucicellulaire monsters (9, 10).

Het doel van deze studie was het evalueren van gecombineerde eencellige transcriptoom- en TRA/TRB-repertoireanalyse met betrekking tot klinisch relevante monsters met lage celaantallen op het ICELL8 eencellige systeem. Hiertoe hebben we verschillende aspecten van de gecombineerde transcriptoom- en TR-repertoire-assay gevalideerd, met behulp van T-cellijnen met gedefinieerde TRA/TRB-klonotypes. We gebruikten ook klinische monsters van patiënten met nierziekte in het eindstadium voorafgaand aan niertransplantatie, en hun donoren, die eerder in detail waren gekarakteriseerd voor het TRB-repertoire met behulp van verschillende benaderingen.


Het eencellige transcriptionele landschap van zoogdierorganogenese

Zoogdierorganogenese is een opmerkelijk proces. Binnen een kort tijdsbestek transformeren de cellen van de drie kiemlagen in een embryo dat de meeste van de belangrijkste interne en externe organen omvat. Hier onderzoeken we de transcriptionele dynamiek van muisorganogenese bij eencellige resolutie. Met behulp van eencellige combinatorische indexering hebben we de transcriptomen van ongeveer 2 miljoen cellen geprofileerd die zijn afgeleid van 61 embryo's die zich in een enkel experiment bevonden tussen 9,5 en 13,5 dagen zwangerschap. De resulterende 'mouse organogenesis cell atlas' (MOCA) geeft een globaal beeld van ontwikkelingsprocessen tijdens dit kritieke venster. We gebruiken Monocle 3 om honderden celtypen en 56 trajecten te identificeren, waarvan er vele alleen worden gedetecteerd vanwege de diepte van de cellulaire dekking, en definiëren gezamenlijk duizenden overeenkomstige markergenen. We onderzoeken de dynamiek van genexpressie binnen celtypen en -trajecten in de tijd, inclusief gerichte analyses van de apicale ectodermale rand, mesenchym van ledematen en skeletspieren.

Figuren

Uitgebreide gegevens Afb. 1.. Prestaties en QC-gerelateerd...

Uitgebreide gegevens Fig. 1.. Prestatie- en QC-gerelateerde analyses voor sci-RNA-seq3.

Uitgebreide gegevens Fig. 2.. Identificatie van de belangrijkste...

Uitgebreide gegevens Fig. 2.. Identificatie van de belangrijkste celtypen en celsamenstellingsdynamiek tijdens muis ...

Uitgebreide gegevens Fig. 3.. Leuven clustering en…

Uitgebreide gegevens Fig. 3.. Leuven clustering en t-SNE visualisatie van subclusters van elk van...

Uitgebreide gegevens Fig. 4.. Analyse van cel...

Uitgebreide gegevens Fig. 4.. Analyse van celsubtypen tijdens de organogenese van muizen.

Uitgebreide gegevens Fig. 5.. Celtypecorrelatie...

Uitgebreide gegevens Fig. 5.. Analyse van celtypecorrelatie tussen atlassen van eencellige muis.

Uitgebreide gegevens Fig. 6.. Analyse van muis...

Uitgebreide gegevens Fig. 6. Analyse van muizenepitheel, endotheel en apicale ectodermale richelcellen van de ledematen.

Uitgebreide gegevens Fig. 7.. Karakterisering van cellulaire trajecten...

Uitgebreide gegevens Fig. 7.. Karakterisering van cellulaire trajecten tijdens mesenchymdifferentiatie van ledematen.

Uitgebreide gegevens Fig. 8.. Karakterisering van tien…

Uitgebreide gegevens Fig. 8.. Karakterisering van tien belangrijke ontwikkelingstrajecten die aanwezig zijn tijdens de organogenese van muizen.

Uitgebreide gegevens Fig. 9.. UMAP-visualisatie van…

Uitgebreide gegevens Fig. 9.. UMAP-visualisatie van de tien belangrijkste celtrajecten.

We hebben iteratief opnieuw geanalyseerd ...

Uitgebreide gegevens Afb. 10.. UMAP-visualisatie van…

Uitgebreide gegevens Fig. 10.. UMAP-visualisatie van de 56 deeltrajecten, gekleurd per ontwikkelingsstadium.

Uitgebreide gegevens Afb. 11.. UMAP-visualisatie van…

Uitgebreide gegevens Fig. 11. UMAP-visualisatie van de 56 subtrajecten, gekleurd door afgeleide pseudotijd.

Uitgebreide gegevens Fig. 12.. Gendynamiek in...

Uitgebreide gegevens Fig. 12.. Gendynamiek in het myogene traject.

path * sm.ns(Pseudotime, df=3)”, terwijl het “gereduceerde model” “

sm.ns(Pseudotijd, df=3)”. Differentieel tot expressie gebrachte genen (FDR < 1%, eenzijdige waarschijnlijkheidsverhoudingstest met aangepaste meerdere vergelijkingen) werden geclusterd via de methode van Ward en gevisualiseerd als een heatmap via het pheatmap-pakket. (B) Pseudotemporele kinetiek voor geselecteerde genen die betrokken zijn bij Robo/Slit-signalering. Rood geeft cellen op het Myod-pad aan, terwijl blauw overeenkomt met het Myf5-pad. Naast de expressiecurven voor elk worden de gestandaardiseerde expressiescores voor elk gen op het oorspronkelijke myogene traject weergegeven. Alleen cellen met detecteerbare expressie worden weergegeven om overplotting te voorkomen. (C) Modules van genen die differentieel tot expressie worden gebracht over het myogene traject. In totaal werden 2.908 genen geclusterd via hiërarchische clustering. Het dendrogram werd in 14 modules gesneden met behulp van de cutree-functie in R, en de totale expressie van genen in elke module werd berekend. Kleuren geven geaggregeerde UMI-tellingen voor elke module aan die zijn geschaald voor bibliotheekgrootte, log-getransformeerd en vervolgens toegewezen aan Z-scores om vergelijking tussen modules mogelijk te maken. Cellen zonder expressie van een bepaalde module worden uitgesloten om overplotting te voorkomen.

Fig. 1.. sci-RNA-seq3 maakt profilering van 2.072.011…

Fig. 1.. sci-RNA-seq3 maakt profilering mogelijk van 2.072.011 cellen van 61 muizenembryo's in 5 ontwikkelingsstadia.

Fig. 2.. Identificatie van de belangrijkste celtypen...

Fig. 2.. Identificatie van de belangrijkste celtypen van muisorganogenese.

( een ) t-SNE-visualisatie...

Fig. 3.. Identificatie en karakterisering van epitheliale...

Fig. 3.. Identificatie en karakterisering van subtypes van epitheelcellen en de apicale ectodermale rand van de ledematen...

Fig. 4.. Karakterisering van tien belangrijke ontwikkelingsstoornissen...

Fig. 4. Karakterisering van tien belangrijke ontwikkelingstrajecten die aanwezig zijn tijdens de organogenese van muizen.


Discussie

In dit manuscript hebben we de rol van MARCO gekarakteriseerd als een marker van pro-tumor macrofagen in GBM. In het bijzonder hebben we ontdekt dat deze subpopulatie die MARCO tot expressie brengt associeert met mesenchymale, hypoxische en ontstekingsremmende eigenschappen, evenals met een slechte klinische prognose. De mesenchymale aard van MARCO wordt ondersteund door de rol van MARCO bij het reguleren van de epitheliale-mesenchymale overgang buiten de context van kanker [41]. Ondertussen is de opregulatie van glycolyse- en hypoxie-gensets consistent met de verrijking van MARCO+-macrofagen in de tumorkern, waarvan bekend is dat deze geassocieerd is met pro-tumormacrofagen [52]. Bovendien is de lokalisatie van deze macrofagen in de hypoxische, necrotische kern consistent met de waarnemingen dat MARCO wordt opgereguleerd in gebieden van ischemische hersenen, wat een functionele rol suggereert van deze scavenger-receptor bij het opruimen van cellulair afval [53]. Onze bevinding van de oppositie van MARCO tegen inflammatoire genen en routes wordt ook gezien bij muizen, waar getolereerde BMDM's MARCO opreguleren [40]. In feite is de opmerkelijke neerwaartse regulatie van HLA klasse II-genen op MARCO+-macrofagen consistent met muizenonderzoeken waarbij MARCO-expressie wordt geassocieerd met een afname van het vermogen tot internalisatie van antigeen [42]. Hoewel MARCO eerder is gerapporteerd als een pro-tumor TAM-marker bij niet-kleincellige longkanker [43], longadenocarcinoom [54] en borstkanker [44], en in verband is gebracht met een slechte prognose bij periampullair adenocarcinoom [45] , is zijn rol niet eerder vermeld in GBM. Onze bevindingen van de pro-tumor TAM-kenmerken geassocieerd met MARCO in GBM bevestigen het belang ervan bij kankers.

Hier laten we zien dat MARCO+-macrofagen uit het bloed lijken te worden gerekruteerd via de opregulatie van een reeks factoren die worden uitgescheiden door tumorcellen, waaronder CSF1 en TGF-β. Van CSF1-expressie in tumorcellen is eerder aangetoond dat het verband houdt met hogere proporties van TAM's in GBM [17]. Met name werd waargenomen dat deze TAM's de verwante receptor CSF1R tot expressie brengen, die kan worden getarget door bestaande therapieën [11, 17]. Ondertussen is experimenteel aangetoond dat TGF-β de MARCO-expressie in M0 BMDM's [44] opreguleert, en voegt zich bij een groot aantal andere onderzoeken die TGF-β impliceren bij glioomprogressie [28, 55]. Hoewel deze rekruteringsfactoren potentiële doelwitten zijn, presenteert MARCO zelf ook een veelbelovend doelwit - anti-MARCO therapeutische antilichamen hebben effectiviteit aangetoond in muismelanoommodellen [44, 56]. Net als bij andere immunotherapieën verwachten we niet dat monotherapie met anti-MARCO-antilichamen de resultaten alleen aanzienlijk zal verbeteren. Het opnemen van anti-MARCO in combinatieregimes kan echter voordelig zijn. Hoewel de MARCO-expressie ongewijzigd blijft tijdens de standaardtherapie, hebben we vastgesteld dat de expressie ervan verandert in de loop van anti-PD1-immunotherapie, waarbij responders op de lange termijn na de behandeling een afname van MARCO vertoonden. Dit resultaat suggereert dat MARCO+-macrofagen schadelijk kunnen zijn voor checkpoint-immunotherapie, wat grotendeels niet succesvol is geweest bij GBM [57]. Gelijktijdige targeting van MARCO of de bijbehorende rekruteringsfactoren kan een veelbelovende mogelijkheid bieden om de polarisatie van macrofagen te manipuleren en daardoor de werkzaamheid van therapie met checkpointremmers te vergroten [58, 59]. Bovendien is er een grote behoefte aan markers voor respons op anti-PD1-therapieën. Eerder hadden we aangetoond dat mutaties in MAPK-genen en verlies van PTEN de respons op anti-PD1-immunotherapie voorspellen [7]. Er is echter geen huidige marker van respons na behandeling met anti-PD1-remmers. MARCO kan nuttig zijn om aan deze behoefte te voldoen, en validatie hiervan in prospectieve onderzoeken met anti-PD1-therapie zou nuttig kunnen zijn.


VERKLARING VAN BESCHIKBAARHEID GEGEVENS

Volgnummergegevens uit dit artikel zijn te vinden in de SRA-gegevensbibliotheek onder toegangsnummer PRJNA507350. Kiemplasma is op verzoek verkrijgbaar bij A.K. Pradhan 2 .

Figuur S1. Homoeologische relaties tussen Brassica A- en B-genomen.

Figuur S2. Correlatieplots voor zaadkwaliteit en morfologische kenmerken van 151 B. juncea toetredingen.

Figuur S3. Tocoferolgehalte in het zaad van 151 B. juncea toetredingen. Het aandeel van het totale tocoferolgehalte van α-, γ- en δ-tocoferol wordt weergegeven.

Figuur S4. Manhattan-plots met de resultaten van associatieve transcriptomics-analyse voor duizend zaadgewicht in 151 B. juncea toetredingen. (a) SNP-analyse. (b) GEM-analyse. Stippellijnen tonen 0,05 significantiedrempels berekend door valse ontdekkingssnelheid (blauw) en Bonferroni-correctie (cyaan).

Figuur S5. Manhattan-plots met de resultaten van associatieve transcriptomics-analyse voor proportie γ-tocoferol in zaad voor 151 B. juncea toetredingen. (a) SNP-analyse. (b) GEM-analyse. Stippellijnen tonen 0,05 significantiedrempels berekend door valse ontdekkingssnelheid (blauw) en Bonferroni-correctie (cyaan).

Figuur S6. Manhattan-plots met de resultaten van associatieve transcriptomics-analyse voor zaadkleur in 151 B. juncea toetredingen. (a) SNP-analyse. (b) GEM-analyse. Stippellijnen tonen 0,05 significantiedrempels berekend door valse ontdekkingssnelheid (blauw) en Bonferroni-correctie (cyaan).

Figuur S7. Voorspellingen van het zaadgewicht op basis van SNP Cab024377.1:1320:T. (a) Zaadgewichtsgegevens voor het 151 diversiteitspanel voor toetredingen en een testpanel van 24 niet-gerelateerde toetredingen. (b) Toevoegingen met alternatieve allelen, Mohan-8 en 27125, die een 4,6-voudig verschil in zaadgewicht hadden, vertonen ook een ongeveer 2,2-voudig verschil in zaadoppervlak.

Let op: De uitgever is niet verantwoordelijk voor de inhoud of functionaliteit van eventuele ondersteunende informatie die door de auteurs wordt aangeleverd. Alle vragen (behalve ontbrekende inhoud) moeten worden gericht aan de corresponderende auteur van het artikel.


MorphoSeq: volledige eencellige transcriptoomdynamiek tot gastrulatie in een akkoord

Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) biedt een sprong voorwaarts bij het oplossen van cellulaire diversiteit en ontwikkelingstrajecten, maar slaagt er niet in om de ruimtelijke organisatie en precieze cellulaire samenstelling van individuele embryo's volledig af te bakenen. Hier reconstrueren we op basis van scRNA-seq- en lichtbladbeeldgegevens een canoniek digitaal embryo dat het genoombrede genexpressietraject van elke afzonderlijke cel bij elke celdeling in de 18 geslachten tot gastrulatie in de ascidische Phallusia mammillata vastlegt. Door scRNA-seq met hoge dekking te gebruiken, bedenken we een computationeel raamwerk dat afzonderlijke cellen van individuele embryo's stratificeert in celtypen zonder voorafgaande kennis. Onpartijdige analyse van transcriptoomgegevens bracht de fysieke positie en afstammingsgeschiedenis van elke cel in kaart, wat de volledige geschiedenis van genexpressie op genoombreed niveau opleverde voor elke afzonderlijke cel in een zich ontwikkelend embryo. Een vergelijking van individuele embryo's onthult zowel een uitgebreide reproduceerbaarheid tussen symmetrische embryo-zijden als een grote inter-embryonale variabiliteit als gevolg van kleine verschillen in de timing van de embryogenese.

trefwoorden: ascidische cel lotspecificatie celtype classificatie embryogenese genexpressie ruis licht vel beeldvorming afstammingsreconstructie eencellige RNA-sequencing ruimtelijke reconstructie.

Copyright © 2020 De Auteur(s). Uitgegeven door Elsevier Inc. Alle rechten voorbehouden.

Belangenconflict verklaring

Belangenverklaring De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.


Resultaten

Eencellige RNA-sequencing van met SARS-CoV-2 geïnfecteerde colon- en ileum-organoïden

Een fractie van de COVID-19-patiënten vertoont darmsymptomen en het is aangetoond dat SARS-CoV-2 zich repliceert in het darmkanaal van patiënten (Xiao et al, 2020) en in menselijke primaire darmepitheelcellen (Lamers et al, 2020 Zhou et al, 2020a Zang et al, 2020 Stanifer et al, 2020b). Om SARS-CoV-2-interacties met primaire menselijke darmepitheelcellen (hIEC's) te karakteriseren, werden menselijke darmorganoïden geïnfecteerd door SARS-CoV-2. Om aan te pakken of organoïden die zijn afgeleid van verschillende delen van het darmkanaal verschillende gevoeligheid vertonen, werden van colon en ileum afgeleide organoïden in twee dimensies gezaaid (2D, plat als monolagen op kweekschalen) om toegang te krijgen tot de apicale kant van de cellen zoals het was eerder aangetoond dat SARS-CoV-2-infectie voornamelijk via de apicale zijde plaatsvindt vanwege de gepolariseerde distributie van ACE2 (Zang et al, 2020). Om te controleren of onze organoïden die in 2D waren gezaaid goed waren gedifferentieerd, volgden we de expressie van verschillende stamcellen en gedifferentieerde celmarkers in de loop van de tijd na verwijdering van WNT en het verlagen van de concentraties van R-Spondin en Noggin (Fig EV1A). We ontdekten dat organoïden goed konden differentiëren in 2D, zoals gekenmerkt door het verlies van stamcelmarkers en de verhoogde expressie van verschillende markers van gedifferentieerde cellen, wat consistent is met eerder werk (Ettayebi et al, 2016 Kolawole et al, 2019 Ding et al, 2020 Stanifer et al, 2020b , 2020c Zang et al, 2020). Gedifferentieerde 2D-organoïden waren geïnfecteerd met SARS-CoV-2 en hun reactie werd gevolgd tijdens het verloop van de infectie. Door directe visualisatie van geïnfecteerde organoïden zagen we dat vanaf 36 uur na infectie (hpi) cellen begonnen af ​​te sterven en dat bij 48 hpi de meeste cellen dood waren (Fig. EV1B). Als gevolg hiervan hebben we onze analyse van infectie beperkt tot 24 uur. Merk op dat slechts een klein deel van de cellen geïnfecteerd was met SARS-CoV-2, zelfs bij gebruik van een grotere hoeveelheid virus voor infectie, wat suggereert dat slechts een afzonderlijke populatie in organoïden infectie toelaat. Voor zowel colon- als ileum-afgeleide organoïden konden we de aanwezigheid van geïnfecteerde cellen al 4 uur na infectie (hpi) waarnemen, waarbij het aantal geïnfecteerde cellen tijdens de infectie toenam (Fig. EV1C en D). Dit werd bevestigd door een toename van intracellulair viraal RNA en de afgifte van de novo infectieuze virusdeeltjes in de loop van de tijd (Fig EV1E en F), waardoor efficiënte virusreplicatie en verspreiding van infectie in zowel colon- als ileum-organoïden wordt aangetoond. Om te karakteriseren hoe hIEC's reageren op SARS-CoV-2-infectie, hebben we de productie van type I IFN (IFNβ1) en type III IFN's (IFNλ1 en IFNλ2-3) overuren. SARS-CoV-2 induceerde geen significante productie van IFNβ1 in ileum of colonorganoïden, behalve een lichte opregulatie van IFNβ1 expressie in colonorganoïden bij 24 hpi (Fig EV1G). Integendeel, voor IFNλ2-3, werd een sterke opregulatie waargenomen in zowel colon- als ileum-organoïden na infectie door SARS-CoV-2 (Fig EV1I). Interessant, vergelijkbaar met IFNβ1, IFNλ1 werd niet opgereguleerd als reactie op infectie (Fig EV1H). Alles bij elkaar genomen laten deze resultaten zien dat een fractie (ongeveer 7-10% 24 hpi, Fig EV1D) van menselijke darmepitheelcellen SARS-CoV-2-infectie, replicatie, de novo productie van infectieuze virusdeeltjes en die infectie is geassocieerd met de opregulatie van type III IFN's (IFNλ2-3).

Figuur EV1. Van ileum en colon afgeleide organoïden ondersteunen SARS-CoV-2-replicatie en verspreiding Van ileum en colon afgeleide organoïden werden in 2D gezaaid

  • A. 48 uur na het zaaien differentiatiemedia werd aan cellen toegevoegd en de verandering in differentiatie werd gevolgd op aangegeven tijdstippen met behulp van q-RT-PCR voor markers van stamcellen, Paneth-cellen, Goblet-cellen en enterocyten. (N = 3 biologische replica's).
  • B. 2D-gezaaide organoïde culturen werden geïnfecteerd met SARS-CoV-2 en de hoeveelheid cellen werd in de loop van de tijd door microscopie gevolgd. (N = 3).
  • C–I. 2D-gezaaide organoïde culturen werden geïnfecteerd met SARS-CoV-2 en de infectie werd getest. (C) Bij 4, 8, 12, 16 en 24 hpi werden monsters gefixeerd en geanalyseerd door immunofluorescentie voor het SARS-CoV-2 N-eiwit (rood) en dsRNA (groen) en werden kernen gekleurd met DAPI (blauw). N = 3 biologische replica's van dezelfde donor werden uitgevoerd, representatieve afbeeldingen worden getoond. Schaalbalk = 100 um. (D) Kwantificering van C. N = 3 biologische replica's. (E) Op aangegeven tijden werd RNA geoogst en werd de hoeveelheid virusreplicatie gevolgd door q-RT-PCR. N = 3 biologische replica's van dezelfde donor werden uitgevoerd. (F). Op aangegeven tijdstippen werden supernatanten verzameld en werden de geproduceerde hoeveelheden de novo infectieuze virussen getitreerd op naïeve Vero-cellen. N = 4 biologische replica's werden uitgevoerd. (G-I). Op aangegeven tijdstippen werd RNA geoogst en de opregulatie van IFNβ1, INFλ1 en IFNλ2/3 werd geanalyseerd met q-RT-PCR. N = Er werden 3 biologische replica's van dezelfde donor uitgevoerd.

Gegevensinformatie: (A-F) Foutbalk geeft standaarddeviatie aan. P werd bepaald door ongepaarde t-toets.

Bepaling van SARS-CoV-2 darmepitheelceltropisme

Menselijke darmorganoïden zijn samengesteld uit meerdere celtypen die gedeeltelijk de cellulaire complexiteit van het menselijke darmepitheel recapituleren. Hoewel het duidelijk is dat SARS-CoV-2 het menselijke darmepitheel infecteert, welke specifieke celtypen door het virus worden geïnfecteerd, hoe infectie het transcriptionele landschap van elk afzonderlijk celtype beïnvloedt en hoe omstanders reageren op virale infectie, blijft onbekend. Om SARS-CoV-2-interacties met hIEC's op het transcriptionele niveau van eencellige cellen te karakteriseren, werden van colon en ileum afgeleide organoïden geïnfecteerd met SARS-CoV-2 zoals hierboven beschreven en onderworpen aan eencellige RNA-sequencing (scRNAseq) (Fig 1A ). Eencellige suspensies werden gegenereerd en 3'-scRNAseq werd uitgevoerd in zes biologische omstandigheden (mock, 12 hpi en 24 hpi voor zowel colon- als ileum-organoïden). scRNAseq leverde brede transcriptionele profielen voor ongeveer 2.000 cellen per aandoening met gemiddeld 5.000 en 6.000 genen geprofileerd per cel voor respectievelijk de dikke darm en het ileum (bijlage Fig S1A-H voor colonorganoïden en Bijlage Fig S1I-P voor ileum-organoïden).

Figuur 1. Eencellige sequencing van SARS-CoV-2-geïnfecteerde colon- en ileum-afgeleide menselijke organoïden

  1. Schematische weergave van de experimentele workflow.
  2. Uniforme spruitstukbenadering en projectie (UMAP) inbedding van eencellige RNA-Seq-gegevens van mock en SARS-CoV-2-geïnfecteerde colon-afgeleide (linkerpanelen) en ileum-afgeleide (rechterpanelen) organoïden gekleurd volgens het celtype. Kleine inzetstukken markeren in de UMAP de cel van nep- en geïnfecteerde organoïden bij 12 en 24 hpi (rood) en de rest van de cellen (grijs).
  3. Puntplot van de bovenste markergenen voor elk celtype voor (links) colon- en (rechts) ileum-afgeleide organoïden. De puntgrootte vertegenwoordigt het percentage cellen dat het gen tot expressie brengt, de kleur vertegenwoordigt de gemiddelde relatieve expressie over het celtype.
  4. Staafdiagram met het aandeel van elk celtype in nep- en geïnfecteerde organoïden (12 en 24 hpi).

Om de celtypen die aanwezig zijn in onze organoïden te identificeren, gebruikten we niet-gecontroleerde clustering en Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) -algoritme voor visualisatie van onze scRNAseq-gegevens (Fig EV2A en F). De clustering onthulde de aanwezigheid van meerdere celsubpopulaties. Met behulp van zowel differentieel tot expressie gebrachte celtype-specifieke markergenen (Fig. 1C en EV2B en G) als markers van eencellige atlassen van menselijke darmweefsels (Smillie et al, 2019) en van onze geannoteerde scRNAseq-gegevens van menselijke ileumbiopten (preprint: Triana et al, 2020), konden we de belangrijkste celtypen identificeren die in deze populaties worden vertegenwoordigd (Fig 1B). We identificeerden acht en negen hoofdpopulaties van cellen in respectievelijk de colon- en ileum-organoïden (figuur 1B). Stamcellen, voorbijgaande amplificerende (TA) cellen, enterocyten, slijmbeker- en entero-endocriene cellen bleken aanwezig te zijn in darmorganoïden (figuur 1B). Belangrijk is dat, hoewel het aandeel van elk celtype in onze organoïden vergelijkbaar was met het aandeel dat werd waargenomen in een ander rapport (Fujii et al, 2018), ontdekten we dat deze verhouding niet volledig identiek was aan die waargenomen in primaire weefsels (biopsieën), wat de beperking van organoïden benadrukt, hoewel ze het huidige beste primaire model zijn om de menselijke darm na te bootsen. Verschillende subpopulaties van enterocyten in ileum en colon (CLCA4+, ALDOB+, MUC13+), werden geïdentificeerd, namelijk enterocyten 1 (GUCA2A+, FABP6+, CA4+), enterocyten 2 (MMP7+, MUC1+, CXCL1+) evenals onrijpe enterocyten 1 en onrijpe enterocyten 2, waarbij de laatste waarschijnlijk cellen vertegenwoordigt die niet volledig zijn gedifferentieerd tot rijpe enterocyten. De aanwezigheid van twee verschillende populaties van enterocyten en hun onvolgroeide gerelateerde vormen is consistent met eerdere rapporten (Smillie et al, 2019). Belangrijk is dat infectie door SARS-CoV-2 de celclustering niet veranderde (Fig 1B, linker UMAP-inzetpanelen). Om het mogelijke verschil tussen de nep- en geïnfecteerde organoïden-celtypen aan te pakken, hebben we de correlatie berekend van klassegemiddelde transcriptionele profielen tussen celtypen van beide aandoeningen (Fig EV2D en I). Dit onthulde een algeheel hoge correlatie binnen elk celtype (R >. 0,99). Bovendien had SARS-CoV-2-infectie geen invloed op de verhoudingen van de verschillende celtypen die aanwezig zijn in zowel de colon- als ileum-organoïden (Fig 1D), waardoor we celtropisme kunnen onderzoeken.

Figuur EV2. Clustering en annotatie van colon- en ileum-organoïden

  • A. Uniforme spruitstukbenadering en projectie (UMAP) inbedding van eencellige RNA-Seq-gegevens van menselijke ileum-organoïden gekleurd door de niet-gecontroleerde clusters.
  • B. Heatmap van relatieve expressie van de top drie markergenen voor elk cluster.
  • C. UMAP gekleurd op celtype.
  • D. Heatmap met Pearson-correlaties tussen de gemiddelde expressie van elk gen over celtypen tussen geïnfecteerde en nepmonsters.
  • E. Mapping tussen celtypes van organoïden en transferlabel van weefselceltypes.
  • F-J. Hetzelfde als (A‒J) maar voor ileum-organoïden.

Om de gevoeligheid en het dynamische bereik bij het detecteren van het SARS-CoV-2-genoom en geselecteerde gastheergenen te vergroten, hebben we gebruik gemaakt van aanvullende gerichte scRNAseq (Schraivogel et al, 2020) uitgevoerd op dezelfde organoïde monsters. Gerichte scRNAseq is gevoeliger voor het detecteren van interessante genen, ongeacht hun expressieniveau en kwantificeert genexpressie met een hoger dynamisch bereik in vergelijking met conventionele 3'-scRNAseq (Schraivogel et al, 2020). We selecteerden 12 genen, waaronder het SARS-CoV-2-genoom, de SARS-CoV-2-receptor ACE2, een door interferon gestimuleerd gen (ISG15), en een panel van hIEC-type markers die we eerder hebben bepaald door scRNAseq van ileumbiopten en organoïden (APOA4, CHGB, FABP6, FCGBP, LYZ, MKI67, OLFM4, SLC2A2, SMOC2 en SST) (voordruk: Triana et al, 2020). Kijkend naar de relatieve expressie van het SARS-CoV-2-genoom in nep versus geïnfecteerde cellen (Fig EV3A en B), detecteerde klassieke 3'-scRNAseq het virale genoom in een deel van organoïde cellen (Fig EV3A (linker paneel)

75% bij 24 hpi), terwijl de gerichte aanpak werd gebruikt, werden SARS-CoV-2-tellingen gedetecteerd in vrijwel alle cellen in de geïnfecteerde monsters (Fig. EV3B). Tegelijkertijd zagen we dat het aantal SARS-CoV-2-tellingen per cel in de loop van de infectie toenam in zowel gerichte als hele transcriptoom-scRNAseq (Fig EV3A en B, rechterpanelen), consistent met actieve replicatie van het virus in organoïden gecontroleerd met behulp van q-RT-PCR (Fig EV1E). Omdat immunofluorescentiekleuring parallel aan de scRNAseq-monsters werd uitgevoerd en onthulde dat minder dan 10% van de cellen geïnfecteerd was (Fig. EV1C en D) (Lamers et al, 2020 Stanifer et al, 2020b ), the presence of SARS-CoV-2 genome in all cells likely does not reflect active viral replication, but could be explained by the presence of viruses attached to the cell's surface or by free-floating viral particles or RNA. This is also confirmed by the presence of viral transcripts in the empty droplets (Fig EV3C and D). Capitalizing on the high dynamic range provided by targeted scRNAseq, we defined cells having productive infection and replication as those with the SARS-CoV-2 counts higher than a baseline, calculated as the mean expression of SARS-CoV-2 measured by targeted scRNAseq in all cell-containing droplets (Fig EV3C and D, top panels). Cells with targeted scRNAseq SARS-CoV-2 expression levels below the estimated baseline level were defined as non-infected bystander cells. Following this approach, we could correct for the presence of contaminating viral RNA. Only a small fraction of cells (Colon: 4.5% and Ileum: 5.3% at 24 hpi) was defined as supporting SARS-CoV-2 infection (Fig EV3C and D) which is consistent with our immunofluorescence staining of SARS-CoV-2-infected organoids (Fig EV1C and D) and other reports (Lamers et al, 2020 Stanifer et al, 2020b ). Additionally, we evaluated SoupX (Young & Behjati, 2020 ) as an alternative method to threshold SARS-CoV-2 genome amounts and be able to determine infected vs bystander cells. However, using this approach we found that small cells became over-enriched for viral counts as SoupX uses the total count of transcripts per cell for the removal of their predicted contamination fraction (Appendix Fig S2). We therefore opted for our targeted scRNAseq and thresholding approaches based on the mean expression of SARS-CoV-2 as this does not bias our genome counts based on cell size and, most importantly, correlates with our quantification of number of infected cells using immunofluorescence.

Figure EV3. Identification of SARS-CoV-2 infected cells using targeted scRNAseq datasets

  • A, B. Proportion of cells infected with SARS-CoV-2 for each sample and violin plots displaying SARS-CoV-2 expression for the 10x genomics 3’ scRNAseq and for the targeted scRNAseq for mock-infected and SARS-CoV-2-infected colon and ileum organoid at 12 and 24 hpi.
  • C. (Top panels) SARS-CoV-2 expression as function of the number of genes per droplet from the targeted scRNAseq datasets of colon organoids at 12 and 24 hpi. Droplet types are colored for droplets containing cells and empty droplets. The vertical line represents the threshold for droplets containing < 2,000 genes per cell. The horizontal line represents the threshold used to define the baseline of infection at 12 and 24 hpi. (Bottom panels) Uniform manifold approximation and projection (UMAP) embedding of the scRNAseq data of infected colon organoids depicting SARS-CoV-2 infected cells. (Left) Relative expression of SARS-CoV-2 in non-corrected datasets. (Right) Relative expression of SARS-CoV-2 in corrected datasets using the thresholds determined in top panel dotplots.
  • D. Same as (C) but for ileum organoids.
  • E, F. (Top panels) Correlation of the expression of each gene in 10x genomics 3’ scRNAseq against their expression in targeted scRNAseq across conditions. (Bottom panels) SARS-CoV-2 expression in each infected cell in 10x genomics 3’ scRNAseq against targeted scRNAseq. Colon (E) and Ileum (F).

Comparing the targeted scRNAseq and the conventional 3’ scRNAseq approaches, we observed high correlation between the expression levels estimated by these technologies (Fig EV3E and F top panels), with targeted scRNAseq providing several orders of magnitude higher dynamic range, compared with the conventional 3’ scRNAseq (Fig EV3E and F bottom panels). The high positive correlation between the two sequencing approaches (except for SLCA2) serves as a quality control confirming that targeted scRNAseq could robustly quantify both viral and cellular genes.

While SARS-CoV-2 could be detected in most cell types in both colon and ileum organoids (Fig 2A), immature enterocytes 2 consistently represented the main virus-targeted cell type (Fig 2B). The proportion of infected immature enterocytes 2 and the number of SARS-CoV-2 genome copy per cell increased over the course of infection (Fig 2B) which is consistent with both the increasing number of infected cells observed by immunofluorescence and the increasing copies of SARS-CoV-2 genome over time (Figs EV1C–E, and EV3A and B). In ileum-derived organoids, TA cells in the secretory lineage were also found to be highly infected by SARS-CoV-2 (Fig 2B, right panel). Interestingly, these cells were infected mostly at 24 hpi, suggesting that they are secondary targets of infection. Taken together, these results suggest that immature enterocytes 2 are the primary target of SARS-CoV-2 infection in hIECs both in colon and ileum.

Figure 2. SARS-CoV-2 cell tropism in human colon- and ileum-derived organoids

  1. UMAP visualization of scRNAseq data of SARS-CoV-2-infected colon- (left) and ileum-derived organoids (right). Triangles represent infected cells and colors represent the corrected targeted normalized expression of SARS-CoV-2 determined using the targeted scRNAseq data.
  2. Proportion of cells infected with SARS-CoV-2 for each cell type and corresponding boxplot of the normalized expression values of SARS-CoV-2 for each infected cell in each individual cell type in colon (left) and ileum (right) infected organoid samples. Data are color coded for mock, 12 and 24 hpi. The boxes represent the interquartile range, the horizontal line in the box is the median, and the whiskers represent 1.5 times the interquartile range. (Colon Immature Enterocyte 2 12 h N = 15 & 24 h N = 47, Secretory TA 12 h N = 2 & 24 h N = 4, TA 12 h N = 7 & 24 h N = 21, Enterocyte 2 12 h N = 4 & 24 h N = 11, Immature Enterocyte 1 12 h N = 2 & 24 h N = 7, Stem Cells 12 h N = 1 & 24 h N = 3, Cycling TA 12 h N = 3 & 24 h N = 6, Enterocyte 1 12 h N = 0 & 24 h N = 4, Ileum Immature Enterocyte 2 12 h N = 31 & 24 h N = 50, Secretory TA 12 h N = 1 & 24 h N = 1, Enteroendocrine cells 12 h N = 3 & 24 h N = 1, Cycling TA 12 h N = 8 & 24 h N = 15, TA 12 h N = 5 & 24 h N = 5, Enterocyte 1 12 h N = 9 & 24 h N = 4, Immature Enterocyte 1 12 h N = 2 & 24 h N = 8, Stem Cells 12 h N = 2 & 24 h N = 1).
  3. Dot plots of known entry determinants across cell types. The dot size represents the percentage of cells expressing the gene the color represents the average relative expression across the cell type. Data are from mock-infected colon (left) and ileum organoids (right).

SARS-CoV-2 cell tropism and association with expression of ACE2 and TMPRSS2

The angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and the cellular protease type II transmembrane serine protease 2 (TMPRSS2) are known to be major determinants for SARS-CoV-2 infection. ACE2 is the cellular receptor of SARS-CoV-2-mediating viral entry (Hoffmann et al, 2020 ). TMPRSS2 is a cellular protease that processes the SARS-CoV-2 spike (S) protein which is an essential step for viral envelope fusion with the host membrane and release of viral contents in the cytosol of the cells. Combined conventional and targeted scRNAseq enabled us to investigate the link between SARS-CoV-2 genome copy numbers and expression of ACE2 in a cell type-specific manner. Different from what we have expected, immature enterocytes 2, the main site of SARS-CoV-2 infection in both colon and ileum organoids (Fig 2A and B), were not the cells displaying the highest levels of ACE2 (Fig EV4A and B). Analyse van ACE2 expression levels in all cell types revealed that cells with relatively high levels of ACE2 (e.g., enterocytes 1) were not susceptible to SARS-CoV-2 infection (Fig 2B and C). Similarly, we found that SARS-CoV-2 infection is not associated with the expression of the receptor structural homologue ACE, a candidate receptor for SARS-CoV-2 basigin (BSG, also known as CD147), as well as the cellular proteases furin, cathepsin L1 (CTSL), aminopeptidase ANPEP en DPP4 (MERS-CoV receptors) (Fig 2C). On the contrary, TMPRSS2 was found to be highly expressed in immature enterocytes 2 (Fig 2C). In summary, although ACE2 is a recognized receptor for SARS-CoV-2, we found no association between high ACE2 expression levels and increased susceptibility to infection on the single-cell level or across detected types of hIECs.

Figure EV4. Expression of SARS-CoV-2 and ACE2 in colon- and ileum-derived organoids

  1. Uniform manifold approximation and projection (UMAP) embedding of the scRNAseq data of infected colon organoids at 12 and 24 hpi, colored by the corrected targeted normalized expression of SAR-Cov-2. Colon (left) and Ileum (right).
  2. Same as (A) but for ACE2 and TMPRSS2 relative expression for mock-infected.
  3. Total transcript counts in each cell type for mock-infected and SARS-CoV-2-infected and bystanders cells in colon and ileum organoids at 12 hpi and 24 hpi. The boxes represent the interquartile range, the horizontal line in the box is the median, and the whiskers represent 1.5 times the interquartile range (Colon Enterocyte 1 Mock Non-Infected N = 326, 12 h Bystander N = 481, 24 h Infected N = 4 & 24 h Bystander N = 375, Cycling TA Mock Non-Infected N = 273, 12 h Infected N = 3, 12 h Bystander N = 361, 24 h Infected N = 6 & 24 h Bystander N = 420, Immature Enterocyte 1 Mock Non-Infected N = 414, 12 h Infected N = 2, 12 h Bystander N = 571, 24 h Infected N = 7 & 24 h Bystander N = 448, Enterocyte 2 Mock Non-Infected N = 402, 12 h Infected N = 4, 12 h Bystander N = 350, 24 h Infected N = 11 & 24 h Bystander N = 245, TA Mock Non-Infected N = 244, 12 h Infected N = 7, 12 h Bystander N = 324, 24 h Infected N = 21 & 24 h Bystander N = 293, Stem Cells Mock Non-Infected N = 268, 12 h Infected N = 1, 12 h Bystander N = 324, 24 h Infected N = 3 & 24 h Bystander N = 207, Immature Enterocyte 2 Mock Non-Infected N = 208, 12 h Infected N = 15, 12 h Bystander N = 152, 24 h Infected N = 47 & 24 h Bystander N = 169, Secretory TA Mock Non-Infected N = 36, 12 h Infected N = 2, 12 h Bystander N = 53, 24 h Infected N = 4 & 24 h Bystander N = 67. Ileum Immature Enterocyte 2 Mock_Non-Infected N = 459, 12 h_Infected N = 31, 12 h_Bystander N = 476, 24 h_Infected N = 50 & 24 h_Bystander N = 332, Stem Cells Mock_Non-Infected N = 248, 12 h_Infected N = 2, 12 h_Bystander N = 310, 24 h_Infected N = 1 & 24 h_Bystander N = 166, TA Mock_Non-Infected N = 272, 12 h_Infected N = 5, 12 h_Bystander N = 269, 24 h_Infected N = 5 & 24 h_Bystander N = 144, Immature Enterocyte 1 Mock_Non-Infected N = 465, 12 h_Infected N = 2, 12 h_Bystander N = 616, 24 h_Infected N = 8 & 24 h_Bystander N = 282, Cycling TA Mock_Non-Infected N = 320, 12 h_Infected N = 8, 12 h_Bystander N = 464,24 h_Infected N = 15 & 24 h_Bystander N = 393, Enterocyte 1 Mock_Non-Infected N = 253, 12 h_Infected N = 9, 12 h_Bystander N = 370, 24 h_Infected N = 4 & 24 h_Bystander N = 138, Goblet Cells Mock_Non-Infected N = 36, 12 h_Bystander N = 60 & 24 h_Bystander N = 31, Secretory TA Mock_Non-Infected N = 19, 12 h_Infected N = 1, 12 h_Bystander N = 80, 24 h_Infected N = 1 & 24 h_Bystander N = 10, Enteroendocrine cells Mock_Non-Infected N = 35, 12 h_Infected N = 3, 12 h_Bystander N = 38, 24 h_Infected N = 1 & 24 h_Bystander N = 26).

SARS-CoV-2 infection induces downregulation of ACE2 expression in intestinal organoids

ACE2 has been reported to act as an interferon-stimulated gene (ISG) resulting in an increased expression level upon viral infection and interferon stimulation of nasal and lung epithelial cells (Ziegler et al, 2020 ). Similarly, in COVID-19 patients, ACE2 expression was shown to be upregulated in lung epithelial cells compared with control patients (Chua et al, 2020 ). To investigate whether the expression of either ACE2 or other putative receptors and key cellular proteases is upregulated upon SARS-CoV-2 infection or upon SARS-CoV-2-mediated immune response in primary hIECs, we compared their expression levels in mock-infected cells vs. both SARS-CoV-2-infected and non-infected bystander cells. Although we did not observe any association between ACE2 expression in non-infected cells and their propensity to be infected by SARS-CoV-2 (Figs 2B and C, and EV4A and B), differential gene expression analysis revealed that upon SARS-CoV-2 infection the ACE2 expression levels were downregulated (Fig 3A and B). In colon organoids, visible downregulation of ACE2 expression was observed in infected cells, progressing from 12 hpi to 24 hpi, as compared to mock-infected cells (Fig 3B, left panel). Importantly, no significant difference of ACE2 expression in the bystander cells was observed (Fig 3B). In ileum-derived organoids, ACE2 expression was also downregulated in the infected cells. However, in contrast to colon organoids, ACE2 expression in bystander cells of ileum organoids was also downregulated as compared to mock-infected cells (Fig 3B, right panels). Importantly, ACE2 expression was found to be negatively correlated with the presence of the viral genome (Fig 3C and D). The downregulation of ACE2 expression was not only observed in immature enterocytes 2 which were identified as the primary site of SARS-CoV-2 infection (Fig 2B), but it was also observed in most other cell types present in ileum-derived organoids over the course of SARS-CoV-2 infection (Fig 3E). This is unlikely to be a product of global transcriptional repression as the gene detection rate does not change between conditions (Fig EV4C). Expression levels of the other SARS-CoV-2 putative receptors and of key cellular proteases (e.g. TMPRSS2, furin, en CTSL) were also found to be reduced in both infected and bystander cells in ileum-derived organoids as compared to mock-infected cells (Fig 3B, right panel). Interestingly, when considering colon-derived organoids, the expression levels of these cellular genes were found slightly increased at 12 hpi and decreased at 24 hpi (Fig 3B, left panel). Altogether, these data suggest that ACE2 expression is downregulated in colon- and ileum-derived hIECs upon SARS-CoV-2 infection but with fundamental differences between bystander and infected cells. These differences in the SARS-CoV-2-induced downregulation of ACE2 between colon and ileum highlight that host/pathogen interactions and mechanisms of pathogenesis can be distinct between different sections of the gastrointestinal tract. To validate this observation, we performed multiplex single-molecule fluorescence ter plaatse hybridization (FISH) on SARS-CoV-2-infected organoids. At 12 and 24 hpi, organoids were fixed and evaluated using transcript-specific probes directed against the SARS-CoV-2 genome and ACE2. Fluorescence microscopy analysis confirmed that infected cells indeed display lower expression levels of ACE2 at both 12 hpi and 24 hpi (Fig 3F, white arrow). Quantification of the relative expression levels of SARS-CoV-2 genome and ACE2 transcripts in the RNA FISH images at the single-cell level again confirmed a negative correlation between SARS-COV-2 and ACE2 (Fig 3G). Altogether, our data strongly suggest that the expression levels of ACE2 decrease in both colon and ileum hIECs upon SARS-CoV-2 infection.

Figure 3. Downregulation of ACE2 upon SARS-CoV-2 infection

  1. Volcano plots of genes that are differentially expressed in infected cells relative to mock-infected cells at 12 hpi and 24 hpi in ileum organoids. The statistical significance (-log10 of the adjusted P-value) is shown as a function of the log2 fold change. MAST tests were used to generate P-values, bonferroni multiple hypotheses correction was used to compute FDR values. Labeled dots in all panels are gene names of selected differentially expressed genes between the compared two populations.
  2. Dot plots displaying the expression changes of known SARS-CoV-2 entry determinants for both infected and bystander cells during the course of infection (mock, 12 and 24 hpi) in colon (left) and ileum organoids (right). The dot size represents the percentage of cells expressing the gene the color represents the average relative expression across the cell type excluding zeros.
  3. Pearson correlation of gene expression values with the amount of SARS-CoV-2 genome (y-axis) vs the maximal log2 fold change (x-axis) across conditions. This plot is generated by comparing both 12 and 24 hpi to mock. Top 5 high correlated and anticorrelated genes and known SARS-CoV-2 entry determinants are highlighted in blue.
  4. Correlation of SARS-CoV-2 expression with ACE2 expression across all infected cell types from ileum organoids at 24 hpi. (N = 146) Gray area represents the standard error to the fitted line.
  5. Global-scaled log normalized expression values of ACE2 in each cell type for mock-infected and SARS-CoV-2-infected cells in ileum organoids at 12 hpi and 24 hpi. The boxes represent the interquartile range, the horizontal line in the box is the median, and the whiskers represent 1.5 times the interquartile range (Immature Enterocyte 2 Mock N = 377, 12 h N = 390 & 24 h N = 270, Stem Cells Mock N = 184, 12 h N = 219 & 24 h N = 115, TA Mock N = 248, 12 h N = 241 & 24 h N = 128, Immature Enterocyte 1 Mock N = 452, 12 h N = 559 & 24 h N = 280, Cycling TA Mock N = 187, 12 h N = 240 & 24 h N = 214, Enterocyte 1 Mock N = 249, 12 h N = 374 & 24 h N = 140, Goblet Cells Mock N = 12, 12 h N = 24 & 24 h N = 5, Secretory TA Mock N = 7, 12 h N = 59 & 24 h N = 2, Enteroendocrine cells Mock N = 26, 12 h N = 30 & 24 h N = 15).
  6. Multiplex ter plaatse RNA hybridization of ACE2 and SARS-CoV-2 of mock-infected and infected 2D ileum organoids at 12 hpi and 24 hpi. White arrows point at SARS-CoV-2-infected cells. A representative image is shown.
  7. Correlation of the relative expression SARS-CoV-2 and ACE2 for infected cells from the multiplex ter plaatse RNA hybridization shown in (F). Each dot represents a cell.

SARS-CoV-2 induces a pro-inflammatory response in hIECs

To evaluate the response of hIECs to SARS-CoV-2 infection, we performed a comparative gene expression analysis between mock-infected and infected organoids. For the infected organoids, we considered separately the infected cells (those with SARS-CoV-2 genome detected) and the bystander cells (those without SARS-CoV-2 genome). In colon organoids, already at 12 hpi hIECs display a strong NFκB and TNF response to infection with this response becoming even more pronounced at 24 hpi (Fig EV5A and B). When comparing mock to bystander cells, we noticed that at 24 hpi, the response of bystander cells mostly followed an IFN-mediated immune response characterized by the presence of multiple ISGs (Fig EV5C and D). This observation suggests that infected cells generate a pro-inflammatory response while bystander cells likely respond to the secreted IFN in a paracrine manner. This is supported by the differential gene expression analysis of bystander vs. infected cells showing that infected cells have a stronger NFκB- and TNF-mediated response compared with bystander cells (Fig EV5E and F). Similar results were found in SARS-CoV-2 infected ileum-derived organoids (Fig EV5G–L). Interestingly, at 24 hpi, some interferon-stimulated genes (ISGs) (e.g., IFIT1-3, MX1, CXCL10, IRF1) were found to be also upregulated in infected cells but to a much lesser extent compared with bystander cells (Fig EV5G–J). Additionally, while infected cells in ileum-derived organoids were found to generate a similar NFκB/TNF-mediated response compared with the colon-derived organoids (Fig EV5B and H), ileum-derived bystander cells had a stronger IFN-mediated response which can be seen by the overall higher expression of ISGs in ileum organoids compared with colon organoids upon SARS-CoV-2 infection (Fig EV5D and J). Together, these comparative gene expression analyses revealed that upon SARS-CoV-2 infection of human intestinal epithelial cells, both strong pro-inflammatory and IFN-mediated responses are generated.

Figure EV5. Differential response of infected and bystander cells to SARS-CoV-2 infection

  • A–F. Volcano plots displaying the genes that are differentially expressed upon SARS-CoV-2 infection of colon organoids. (A, B) infected vs. mock-infected cells at 12 hpi (A) and 24 hpi (B), (C, D) bystander vs. mock-infected cells at 12 hpi (C) and 24 hpi (D), and (E, F) infected vs. bystander cells at 12 hpi (E) and 24 hpi (F). The statistical significance (-log10 adjusted P-value) is shown as a function of the log2 fold change. MAST tests were used to generate P-values, bonferroni multiple hypotheses correction was used to compute FDR values. Labeled dots in blue in all panels are gene names of selected differentially expressed genes between the compared two populations. Labeled dots in red in all panels are gene corresponding to interferon if detected.
  • G–L. Same as (A–F) but for ileum organoids.

Cell type-specific immune response in infected vs. bystander cells

Taking into account the differences in the susceptibility of the different hIEC types to SARS-CoV-2, with immature enterocytes 2 constituting the main site of SARS-CoV-2 infection (Fig 2), we compared the response of each individual cell type with SARS-CoV-2 infection. Similar to the analysis of all cell types taken together (Fig EV5), differential gene expression analysis of colon-derived infected immature enterocytes 2 revealed a strong NFκB/TNF-mediated response while bystander immature enterocytes 2 mostly display an IFN-mediated response (Fig 4A–C and Appendix Fig S3A). Similarly, in ileum-derived organoids, infected immature enterocytes 2 also showed a strong NFκB/TNF-mediated response (Fig 4F and H, and Appendix Fig S3B) while bystander cells were characterized by their response to secreted IFNs leading to ISG expression (Fig 4G and Appendix Fig S3B).

Figure 4. Intrinsic innate immune response generated by immature enterocytes 2 upon SARS-CoV-2 infection

  • A–C. Volcano plots displaying the genes that are differentially expressed in immature enterocytes 2 upon SARS-CoV-2 infection of colon organoids. (A) infected vs. mock-infected cells, (B) bystander vs. mock-infected cells and (C) infected vs. bystander cells. The statistical significance (-log10 adjusted P-value) is shown as a function of the log2 fold change. MAST tests were used to generate P-values, bonferroni multiple hypotheses correction was used to compute FDR values. Labeled dots in blue in all panels are gene names of selected differentially expressed genes between the compared two populations. Labeled dots in red in all panels are gene corresponding to interferon if detected.
  • D. Dot plot of the top 42 most differentially expressed genes upon SARS-CoV-2 infection in mock, infected and bystander cells at 12 and 24 hpi. The dot size represents the percentage of cells expressing the gene the color represents the average relative expression across the cell type.
  • E. Same as in (D) but for the top 30 most differentially expressed ISGs.
  • F–J. Same as (A–E) but for ileum organoids. Labeled dots in blue in all panels are gene names of selected differentially expressed genes between the compared two populations. Labeled dots in red in all panels are gene corresponding to interferon if detected.

Pathway analysis confirmed that the bystander response was mostly an IFN-related response while the infected cell response was mostly pro-inflammatory (Appendix Fig S4). Comparison of the transcriptional response to SARS-CoV-2 infection in infected vs. bystander immature enterocytes 2 further confirmed that infected cells mount a strong pro-inflammatory response characterized by the upregulation of NFκB and TNF (Fig 4C and D, and H and I). Analysis of the top 30 differentially expressed ISGs in colon-derived organoids clearly shows that at 24 hpi, bystander cells respond to IFN by upregulating the expression of a large panel of ISGs (Fig 4E). Similar findings were observed in immature enterocytes 2 from ileum organoids, although infected cells were also found to express more ISGs compared with their colon-derived counterparts. Importantly, in both colon and ileum organoids, bystanders showed higher levels of expression for all considered ISGs compared with infected cells (Fig 4E and J). These results are consistent with the observation that ileum-derived organoids are more immune-responsive compared with colon-derived organoids (Fig EV5D and J). Together these data show that upon SARS-CoV-2 infection, infected cells mount a strong NFκB/TNF-mediated pro-inflammatory response and display a limited production of ISGs while bystander cells mount a strong IFN-mediated response through a strongly upregulated expression of a broad panel of ISGs.

To determine whether the characterized NFκB/TNF-high and IFN-low immune response is specific to immature enterocytes 2, we also looked individually at each infected cell type. While it is hard to draw strong conclusion on how infected cells behave for all cell types due to their low permissivity to SARS-CoV-2 infection (low number infected cells) and low level of viral transcripts, we can observe that infected cells display a strong NFκB/TNF-mediated response (Appendix Figs S5–S8). Interestingly, we observed that bystander cells from different cell types produce different patterns of ISGs (Appendix Figs S5–S8). Since our targeted scRNAseq analysis revealed the presence of background viral RNA in the samples (Fig EV3), we asked whether the observed immune response is indeed cascading to bystander cells through type III interferon secreted by infected cells or is caused by the direct action of non-replicating viral particles on bystander cells. To address this, colon and ileum organoids were infected with either live or UV-inactivated SARS-CoV-2. Results revealed that upon infection with live SARS-CoV-2 both IFNs and ISGs were produced (Appendix Fig S9). On the contrary, exposure of organoids to UV-inactivated SARS-CoV-2 did not lead to virus replication and cells failed to produce both IFN and ISGs (Appendix Fig S9). This demonstrates that active replication is required for the described immune response and allowed us to rule out the exposure to non-replicating viral particles as being the cause of this response. Altogether, our results show that infected and bystander cells respond differently to SARS-CoV-2 infection where infected cells mount a NFκB/TNF-mediated response while bystander cells mount a IFN-mediated response.

Signaling activity in infected vs. bystander cells

To characterize the signaling that underpins the distinct immune response of infected and bystander cells upon SARS-CoV-2 infection, we inferred the pathway signaling activity from scRNAseq data with PROGENy (Fig 5A and B). For both colon and ileum organoids, infected cells show a strong activation of the MAPKs, NFκB, and TNFα pathways. In line with the enrichment analysis (Appendix Fig S3), these pathways were found to be less activated in bystander cells with higher scores in ileum compared with colon (Fig 5A and B). Interestingly and in accordance with our differential gene expression analyses (Figs 4 and EV5 and Appendix Fig S3), the JAK-STAT signaling pathway was found to be activated mostly in bystander cells (Fig 5A and B). To further elucidate the signaling activity at the single-cell level, we generated diffusion maps of all single cells based on the scRNAseq expression of interferon-related genes (Fig 5C and D). In both ileum and colon, we observed a clear bifurcation of all cells into two distinct branches, one branch representing mainly infected cells and another branch representing mainly bystander cells. Calculation of transcription factor activities (TFA) based on the gene expression of their target can provide a more robust measure of the effect of transcription factors (TFs) when compared to only gene expression. Hence, we calculated the TFA of selected transcription factors for all single cells using SCENIC and mapped the inferred activities onto the single-cell diffusion maps (Fig 5C and D, right insets). We found that the transcription factors STAT1 and IRF1 were activated mainly in bystander cells (branch along DC1) while JUN was activated in infected cells (branch along DC2) (Fig 5C and D, left panels). Extending this analysis to transcription factors whose activity pattern is highly correlated to either DC1 or DC2 revealed that globally, transcription factors that are critical for IFN-mediated signaling (d.w.z. the ISGF3 complex: STAT1/STAT2/IRF9 and IRF1) are highly active in bystander cells (Fig 5E and F). Similarly, the ETS variant transcription factor 7 (ETV7) which is an ISG acting as a negative regulator of IFN-mediated signaling (preprint: Froggatt et al, 2019 ) and the Early Growth Response Gene 1 (EGR1) which enhances type I IFN signaling (Zhu et al, 2018 ) were also found to be activated in bystander cells (Fig 5E and F). Upregulation of the EGR1- and JUN-dependent pathways was consistent with the findings of the previous work investigating SARS-CoV-2 infection of the human lung and intestinal epithelial cell lines Calu-3 and Caco-2 (preprint: Wyler et al, 2020 ).

Figure 5. Differential signaling activity of infected vs. bystander cells upon SARS-CoV-2 infection

  • A, B. Heatmaps of scaled relative pathway signaling activity inferred by PROGENy for (A) colon and (B) ileum organoids.
  • C, D. Diffusion maps embeddings showing mock, bystander, and infected cells (big panels) and activities for selected transcription factors STAT1, IRF1, and JUN (small panels) for (C) colon and (D) ileum organoids. Case color scales represent absolute score values in arbitrary units.
  • E, F. Heatmaps of transcription factor activities along bifurcating trajectories of the corresponding diffusion maps for (E) colon and (F) ileum organoids. Column top annotations represent the infection status of each cell (infected, bystander, and mock). The dimensions DC1 and DC2 represent the first two eigenvectors of the Markovian transition matrix and were calculated separately for either colon or ileum organoids. Case color scales represent absolute score values in arbitrary units.

SARS-CoV-2 inhibits IFN-mediated ISG expression

To validate that the IFN-mediated response is specific to bystander cells, ileum-derived organoids were infected with SARS-CoV-2. At 12 and 24 hpi, single-molecule RNA FISH was performed using probes specific for the SARS-CoV-2 genome and for ISG15 which was found to be highly upregulated upon infection and has the highest -log10 P-value in the differential analysis comparing bystander cells vs mock-infected cells (Fig 4G). Microscopy images revealed that bystander cells (non-infected) were indeed positive for ISG15 (Fig 6A). Interestingly, SARS-CoV-2 infected cells were found to express little to no ISG15 (Fig 6A, white arrows). Quantification confirmed that cells which displayed the highest expression of ISG15 were negative for SARS-CoV-2 genome (Fig 6B). These results support the model that bystander cells respond to SARS-CoV-2 infection by mounting an IFN-mediated response. On the other hand, as shown by using both scRNAseq (Fig 4) and RNA FISH (Fig 6A), infected cells do not mount an IFN-mediated response (low-to-no expression of ISGs) suggesting that infected cells are refractory to IFN. To address whether SARS-CoV-2 infection can indeed impair IFN-mediated signaling, we directly monitored ISG production in response to IFN treatment in either infected or non-infected cells. However, while it is well known that ISGs are made in a JAK-STAT-dependent manner downstream the IFN receptors, there is growing evidence that a subset of ISGs can be made downstream IRF3 following viral recognition by PRRs. To alleviate this unwanted IRF3 mediated production of ISGs, we generated a human intestinal cell line (T84) depleted of IRF3. Infection of the IRF3 KO T84 did not result in the production of ISGs as monitored by q-RT–PCR of ISG15 (Fig 6D). IRF3 KO T84 cells were mock-infected or infected with SARS-CoV-2, at 24 hpi cells were treated with IFN and 12 h post-treatment production of ISG15 was assessed by q-RT–PCR and normalized to the housekeeping gene (TBP) (Fig 6C). Results show that mock-infected IRF3 KO T84 cells were responsive to IFN demonstrating that genetic depletion of IRF3 does not alter IFN-mediated signaling (Fig 6D). Interestingly, in SARS-CoV-2 infected IRF3 KO T84 cells, production of ISG15 upon IFN treatment was significantly downregulated (Fig 6D). To confirm that this impaired induction of ISG15 upon IFN treatment was specific to SARS-CoV-2 infection, IRF3 KO T84 cells were infected with astrovirus at an MOI of 3 to achieve full infection (Fig 6E). Contrary to SARS-CoV-2 infection, infection of IRF3 KO T84 cells by astrovirus did not impair IFN-mediated signaling as a similar upregulation of ISG15 was observed in both mock-infected and astrovirus-infected cells upon IFN treatment (Fig 6D). In a second validation approach, to fully demonstrate that only infected cells have an altered IFN-mediated signaling, we developed an assay based on a fluorescent reporter of ISG expression (Fig 6F). For this, we generated a T84 cell line transduced with a reporter made of the promoter region of the ISG MX1 driving the expression of the fluorescent protein mCherry. Mx1 is known to be made strictly downstream of the IFN receptor in a JAK-STAT-dependent manner but not downstream of IRF3. Upon IFN treatment, about 30–40% of cells expressing this reporter were responsive and became fluorescent (Fig 6G). Following infection with SARS-CoV-2 at a multiplicity of infection (MOI) of 3, most of the cells were found to be infected (Fig 6G). However, when cells were treated 24 hpi with IFN, most infected cells did not respond to IFN and very few became double-positive for both virus and MX1 driven mCherry (Fig 6G, left panel). To control that non-infected bystander cells could indeed respond to IFN and express mCherry, we repeated this experiment but using an MOI of 1 for SARS-CoV-2 infection. About 40% of the cells were found to be infected. Supplementing IFN affected mainly non-infected cells, as can be seen from the increase in MX1-positive cells and no change in the number of double-positive cells (both infected and MX1-positive) (Fig 6G, right panel).

Figure 6. SARS-CoV-2 infection impairs interferon-mediated signaling

  1. Human ileum-derived organoids were seeded in 2D on iBIDi chamber slides. 12 and 24 hpi cells were fixed and the amount of SARS-CoV-2-infected cells (red) and the induction of ISG15 (white) was analyzed by single-molecule RNA FISH. Nuclei were visualized with DAPI (blue). White arrows indicate SARS-CoV-2-positive cells. N = 3 biological samples. Representative image is shown. Scale bar=100 um.
  2. Quantification of the mean fluorescence intensity of samples in (A). Each dot represents a cell.
  3. Schematic depicting the infection and interferon addition to evaluate ISG15 induction following SARS-CoV-2 and astrovirus infection.
  4. T84 IRF3 knockout cells were infected with SARS-CoV-2 or human astrovirus 1 at an MOI=3. 24 hpi, cells were incubated in the presence or absence of 2,000 IU/ml of IFNβ1. 12 h post-treatment RNA was harvested and the induction of ISG15 was analyzed by q-RT–PCR and normalized to the housekeeping gene TBP. N = 3 biologische replica's. Error bar indicates standard deviation. Statistics were determined by unpaired t-test.
  5. T84 IRF3 knockout cells were infected with SARS-CoV-2 or human astrovirus 1 at an MOI=3. 24 hpi, cells were fixed and stained for either the SARS-CoV-2 N protein or for human astrovirus 1 (HAstV1) capsid protein. N = 3 biologische replica's. Representative image is shown. Scale bar=100 um.
  6. Schematic depicting the T84 MX1 mcherry expressing cells and their response to IFN or SARS-CoV-2 infection.
  7. T84 MX1 mcherry were infected with SARS-CoV-2 at an MOI=3 or MOI=1. 24 hpi cells were incubated in the presence or absence of 2,000 IU/ml of IFNβ1. 12 h post-treatment cells were fixed and stained for SARS-CoV-2 N protein. The number of MX1 positive, SARS-CoV-2 positive, and double-positive cells was quantified. N = 3 biological replicates were performed. Error bar indicates standard deviation.

Altogether, our results provide a strong evidence that upon infection with SARS-CoV-2 primary human intestinal cells generate a strong NFκB/TNF-mediated response and produce IFN. This IFN acts in a paracrine manner onto bystander cells that leads to the upregulation of IFN-stimulated genes. Importantly, SARS-CoV-2 infection renders infected cells refractory to IFN as they show little-to-no increase in the activity of the JAK-STAT signaling pathways and fail to upregulate IFN-stimulated gene expression.


Development and validation of EST-SSR markers of Magnolia wufengensis using de novo transcriptome sequencing

Key message An EST-SSR database of Magnolia wufengensis was first generated by transcriptome sequencing, the SSRs related to flower pigment synthesis were validated, and the transferability of the EST-SSR markers to other species was additionally investigated. Magnolia (M.) wufengensis is a distinct ornamental species endemic to China and is famous for its gorgeous flower color. However, the limitation of understanding genetic resources has restricted its conservation and breeding. This study used RNA-Seq to generate thousands of expressed sequence tags (ESTs) with which thousands of functional markers were developed. Of the 9567 simple sequence repeats (SSRs) identified, 8306 contained unigene sequences. Among the different SSR motif types, dinucleotide repeats (50.8%) were the most abundant, followed by trinucleotide repeats (32.4%). AG/CT (37.8%) and AAG/CTT (11.8%) were the most enriched repeat motifs. A total of 5203 EST-SSR novel primer pairs were designed to construct a reference database, from which 33 related to floral pigment formation were PCR-validated by testing them on the five cultivars of M. wufengensis. Twenty-two primer pairs displayed clear PCR products in the verification. Moreover, the number of alleles per marker ranged from 1 to 6 with an average of 3.41, and the polymorphic bands ranged from 0 to 6 with an average of 2.77. Additionally, the genetic distances were positively correlated with certain phenotypic indexes, including anthocyanin and flavonoid contents. Furthermore, applying these EST-SSR markers to other related species showed that 50.0–68.1% of the markers were transferable. The identified EST-SSRs will not only inspire future molecular-assisted breeding in Magnoliaceae but also facilitate targeted research in marker-trait association for floral pigment formation and genetic diversity analysis.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


These authors contributed equally: Go-Eun Yu and Younhee Shin.

Voorkeuren

Genomics Division, National Institute of Agricultural Sciences, Jeonju, 54874, Korea

Go-Eun Yu, Sang-Ho Kang, Si-Myung Lee & Chang-Kug Kim

Research and Development Center, Insilicogen Inc., Yongin-si 16954, Gyeonggi-do, Republic of Korea

Younhee Shin & Sathiyamoorthy Subramaniyam

Crop Foundation Research Division, National Institute of Crop Science, RDA, Wanju, 55365, Korea

Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 29 Geumgu-gil, Jeongeup, 56212, Korea

Department of Radiation Science and Technology, University of Science and Technology, Daejeon, 34113, Korea

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

Bijdragen

G.E.U. and C.C. prepared plant materials and sequencing data. Y.S., S.H.K. and S.S. annotated the transcriptome sequence and performed bioinformatics analyses. S.M.L. and S.S.L. provided advice and associated information. C.K.K. and Y.S. wrote the manuscript. All authors have read and approved the final manuscript.

Corresponderende auteur


Bekijk de video: Cel en leven: DNA het besturingssysteem van de cel (December 2021).