Informatie

Osmotische druk


Osmotische druk wordt gedefinieerd als:

De druk die op een zuiver oplosmiddel zou moeten worden uitgeoefend om te voorkomen dat het door osmose in een bepaalde oplossing terechtkomt.

En toch gaat water van lage osmotische druk naar hoge osmotische druk. Zou een hoge osmotische druk osmose niet moeten voorkomen? Het zou echt nuttig zijn als deze definitie werd uitgelegd.


De definitie in uw eerste alinea komt niet overeen met uw begrip in de tweede. Als de osmotische druk hoog is in "A" ten opzichte van "B", zou u: moet fysieke druk uitoefenen op "A" om te voorkomen dat oplosmiddel van B naar A . gaat. Als zo'n druk niet wordt uitgeoefend, beweegt het oplosmiddel wel van B naar A. De osmotische druk en fysieke druk zijn afzonderlijke en tegengestelde krachten.

Ik beschouw osmotische druk liever als een soort "vacuüm" dat oplosmiddel ernaartoe "trekt" (het is natuurlijk niet echt een vacuüm, dus ga niet te ver in deze analogie...). De definitie werkt nog steeds gezien deze vorm van denken: je zou zoveel externe druk moeten uitoefenen om het "vacuüm" te evenaren om geen beweging van opgeloste stof te hebben.


De tweede alinea van de vraag beschrijft twee oplossingen, gescheiden door een semipermeabel membraan (een membraan dat water doorlaat, maar niets dat in het water is opgelost). Zoals het zegt, zal water onder die omstandigheden van het gedeelte met lage osmotische druk naar de oplossing met hoge osmotische druk gaan.

Osmotische druk is, net als andere colligatieve eigenschappen, evenredig met de concentratie van opgeloste stoffen in een oplossing. Je kunt er dus aan denken dat het een maat is voor hoeveel andere dingen er in het water zitten. Lage osmotische druk betekent lage concentratie opgeloste stoffen. Hoge osmotische druk betekent een hoge concentratie opgeloste stoffen. Water dat over een semipermeabel membraan beweegt van een gebied met een lage concentratie aan opgeloste stoffen naar een gebied met een hoge concentratie aan opgeloste stoffen, kan iets intuïtiever zijn. Gegeven een barrière voor opgeloste stoffen maar niet voor water, zal water bewegen op een manier die de concentratie gelijk maakt.

Kom nu terug naar de definitie van osmotische druk. De definitie begint met het opzetten van een heel speciale reeks voorwaarden om ons in staat te stellen de druk te meten -- puur oplosmiddel in het ene compartiment, een bekende concentratie in een ander compartiment, en het belangrijkste verschil, druk om voorkomen water niet beweegt zoals het anders zou doen.


Samenvatting

  • In de celbiologie verwijst '8216membraantransport' naar de verzameling mechanismen die de doorgang van opgeloste stoffen, zoals ionen en kleine moleculen, door biologische membranen (dubbellagen van lipiden waarin eiwitten zijn ingebed) reguleren.
  • De regulering van de doorgang door het membraan is het resultaat van selectieve membraanpermeabiliteit - een kenmerk van biologische membranen waardoor ze stoffen van verschillende chemische aard kunnen scheiden. Met andere woorden, ze kunnen wel doorlaatbaar zijn voor bepaalde stoffen, maar niet voor andere.
  • Er zijn verschillende soorten membraantransport, afhankelijk van de eigenschappen van de te transporteren stof en de transportrichting.
  • Bij eenvoudige diffusie passeren kleine niet-geladen moleculen of in vet oplosbare moleculen tussen de fosfolipiden om de cel binnen te gaan of te verlaten, van gebieden met een hoge concentratie naar gebieden met een lage concentratie (ze bewegen langs hun concentratiegradiënt). Zuurstof, koolstofdioxide en de meeste lipiden gaan de cellen binnen en verlaten door eenvoudige diffusie.

  • Osmose is een vorm van eenvoudige diffusie waarbij watermoleculen door een selectief permeabel membraan diffunderen van gebieden met een hoge waterconcentratie naar gebieden met een lagere waterconcentratie. (Merk op dat hoe meer deeltjes er in een oplossing zijn opgelost, hoe minder water er in zit, dus osmose wordt soms beschreven als de diffusie van water van gebieden met een lage concentratie aan opgeloste stoffen naar gebieden met een hoge concentratie aan opgeloste stoffen).
  • Osmotische druk is de druk die de diffusie van water door semi-permeabele membranen veroorzaakt. Het neemt toe als gevolg van een toename van de concentratie van opgeloste stoffen in de oplossing.
  • Er zijn drie soorten osmose-oplossingen: de isotone oplossing, hypotone oplossing en hypertone oplossing.
  • Een isotone oplossing is wanneer de concentratie van de opgeloste stof in evenwicht is met de concentratie in de cel. In een isotone oplossing beweegt de waterbeweging nog steeds tussen de oplossing, maar de snelheden zijn in beide richtingen hetzelfde, dus de waterbeweging is in evenwicht tussen de binnenkant van de cel en de buitenkant van de cel.
  • Een hypotone oplossing is wanneer de concentratie van de opgeloste stof lager is dan de concentratie in de cel. In een hypotone oplossing beweegt het water de cel in en kan de cel opzwellen. Cellen die geen celwand hebben, zoals dierlijke cellen, kunnen in dit type oplossing exploderen.
  • Een hypertone oplossing is wanneer de concentratie van de opgeloste stof hoger is dan de concentratie in de cel. In een hypertone oplossing beweegt het water uit de cel en zorgt ervoor dat de cel verschrompelt.

Resultaten van diffusie op een cel

Wanneer diffusie door celmembranen plaatsvindt, zijn er drie mogelijke resultaten die afhankelijk zijn van het type moleculen dat diffundeert en het type celmembranen.top↑

1) wanneer diffusie door het celmembraan plaatsvindt, laten sommige membranen geen moleculen door. Een rubberen membraan laat bijvoorbeeld geen watermoleculen of kopersulfaatmoleculen door. Dit type membranen die geen oplosmiddel- of opgeloste moleculen doorlaten, worden genoemd: ondoordringbaar membraan.

2) Sommige membranen, zoals filtreerpapier, laten alle moleculen door, dit soort membranen die moleculen volledig doorlaten, worden genoemd Volledig permeabel membraan.

3) En het laatste resultaat, sommige membranen zullen de doorgang van watermoleculen toestaan, maar niet van opgeloste moleculen, bijvoorbeeld kopersulfaatoplossing. Dit type membraan dat de doorgang van één type moleculen mogelijk maakt, maar niet van andere typen, wordt genoemd Semipermeabel membraan.top↑

Er zijn twee voorbeelden van een semi-permeabel membraan, namelijk een niet-levend en een levend semi-permeabel membraan.

Voorbeelden van niet-levend semi-permeabel membraan dat doorlaatbaar is voor water maar geen oplosmiddel, bijvoorbeeld kopersulfaatoplossing, zijn viskingbuis, perkament en cellofaan.

Voorbeelden van levend semi-permeabel membraan zijn schapen- of varkensblaas, yam knol, Ierse aardappel, celmembraan, onrijpe papaja en tonoplast, enz.

Opmerking : Osmose is een speciaal type diffusie, dat wil zeggen, het is de diffusie van watermoleculen of oplosmiddelmoleculen door een semi-permeabel membraan.top↑


Verschillende cellen hebben verschillende mechanismen voor het regelen van het celvolume

Dierlijke cellen zullen opzwellen wanneer ze in een hypotone oplossing worden geplaatst (d.w.z. een waarin de concentratie van opgeloste stoffen lager dan in het cytosol). Sommige cellen, zoals erytrocyten, zullen zelfs barsten als water ze binnenkomt door osmotische stroom. Breuk van het plasmamembraan door een stroom van water in het cytosol wordt genoemd osmotische lysis. Onderdompeling van alle dierlijke cellen in een hypertone oplossing (d.w.z. een waarin de concentratie van opgeloste stoffen hoger dan in het cytosol) zorgt ervoor dat ze krimpen als water ze verlaat door osmotische stroming. Daarom is het essentieel dat dierlijke cellen in een isotoon medium worden gehouden, dat een concentratie aan opgeloste stoffen heeft die dicht bij die van het celcytosol ligt (zie figuur 5-22).

Zelfs in een isotone omgeving hebben alle dierlijke cellen een probleem bij het handhaven van hun celvolume. Cellen bevatten een groot aantal geladen macromoleculen en kleine metabolieten die ionen met tegengestelde lading aantrekken (bijv. K+, Ca 2+, PO4 3− ). Bedenk ook dat er een langzame lekkage is van extracellulaire ionen, met name Na+ en Cl − , in cellen langs hun concentratiegradiënt. Als gevolg van deze factoren zou, bij afwezigheid van een compenserend mechanisme, de cytosolische opgeloste stofconcentratie toenemen, wat een osmotische instroom van water en uiteindelijk cellyse zou veroorzaken. Om dit te voorkomen, exporteren dierlijke cellen actief anorganische ionen zo snel als ze naar binnen lekken. De export van Na+ door de ATP-aangedreven Na+/K+-pomp speelt de belangrijkste rol in dit mechanisme om celzwelling te voorkomen. Als gekweekte cellen worden behandeld met een remmer die de productie van ATP voorkomt, zwellen ze op en barsten ze uiteindelijk, wat het belang aantoont van actief transport bij het in stand houden van het celvolume.

In tegenstelling tot dierlijke cellen zijn planten-, algen-, schimmel- en bacteriële cellen omgeven door een stijve celwand. Vanwege de celwand leidt de osmotische instroom van water die optreedt wanneer dergelijke cellen in een hypotone oplossing (zelfs zuiver water) worden geplaatst, tot een toename van de intracellulaire druk, maar niet van het celvolume. In plantencellen is de concentratie van opgeloste stoffen (bijvoorbeeld suikers en zouten) meestal hoger in de vacuole dan in het cytosol, dat op zijn beurt een hogere concentratie opgeloste stoffen heeft dan de extracellulaire ruimte. De osmotische druk, genaamd turgordruk, gegenereerd door het binnendringen van water in het cytosol en vervolgens in de vacuole, duwt het cytosol en het plasmamembraan tegen de resistente celwand. Celverlenging tijdens de groei vindt plaats door een hormoongeïnduceerde gelokaliseerde loslating van een gebied van de celwand, gevolgd door instroom van water in de vacuole, waardoor deze groter wordt (zie figuur 22-33).

Hoewel de meeste protozoën (zoals dierlijke cellen) geen starre celwand hebben, bevatten vele een samentrekkende vacuole waardoor ze osmotische lysis kunnen voorkomen. Een contractiele vacuole neemt water op uit het cytosol en voert, in tegenstelling tot een plantenvacuole, periodiek zijn inhoud af door fusie met het plasmamembraan (Figuur 15-31). Dus hoewel water continu de protozoaire cel binnenkomt door osmotische stroming, voorkomt de samentrekkende vacuole dat te veel water zich ophoopt in de cel en deze opzwelt tot het barstpunt.

Afbeelding 15-31

De contractiele vacuole in Paramecium caudatum, een typisch trilharig protozoa, zoals onthuld door Nomarski-microscopie van een levend organisme. De vacuole wordt gevuld door uitstralende kanalen die vloeistof uit het cytosol verzamelen. Als de vacuole vol is, smelt hij voor (meer.)


Osmoregulatoren en Osmoconformers

Personen die verdwaald zijn op zee zonder vers drinkwater, lopen het risico op ernstige uitdroging omdat het menselijk lichaam zich niet kan aanpassen aan het drinken van zeewater, dat hypertoon is in vergelijking met lichaamsvloeistoffen. Organismen zoals goudvissen die slechts een relatief smal zoutgehalte kunnen verdragen, worden stenohaline genoemd. Ongeveer 90 procent van alle beenvissen is beperkt tot zoet- of zeewater. Ze zijn niet in staat tot osmotische regulatie in de tegenovergestelde omgeving. Het is echter mogelijk dat een paar vissen, zoals zalm, een deel van hun leven in zoet water en een deel in zeewater doorbrengen. Organismen zoals de zalm en molly die een relatief breed scala aan zoutgehalte kunnen verdragen, worden euryhaline-organismen genoemd. Dit is mogelijk omdat sommige vissen zijn geëvolueerd osmoregulerend mechanismen om te overleven in allerlei soorten wateromgevingen. Als ze in zoet water leven, hebben hun lichamen de neiging om water op te nemen omdat de omgeving relatief hypotoon is, zoals geïllustreerd in figuur 22.3. een . In dergelijke hypotone omgevingen drinken deze vissen niet veel water. In plaats daarvan geven ze veel zeer verdunde urine af en bereiken ze een elektrolytenbalans door actief zouten door de kieuwen te transporteren. Wanneer ze naar een hypertoon marien milieu gaan, beginnen deze vissen zeewater te drinken. Ze scheiden de overtollige zouten uit via hun kieuwen en hun urine, zoals geïllustreerd in figuur 22.3 B . De meeste ongewervelde zeedieren daarentegen kunnen isotoon zijn met zeewater ( osmoconformers ). Hun lichaamsvloeistofconcentraties komen overeen met veranderingen in de zeewaterconcentratie. De zoutsamenstelling van kraakbeenvissen in het bloed is vergelijkbaar met beenvissen, maar het bloed van haaien bevat de organische verbindingen ureum en trimethylamineoxide (TMAO). Dit betekent niet dat hun elektrolytsamenstelling vergelijkbaar is met die van zeewater. Ze bereiken isotoniciteit met de zee door grote concentraties ureum op te slaan. Deze dieren die ureum afscheiden, worden ureotelic dieren genoemd. TMAO stabiliseert eiwitten in de aanwezigheid van hoge ureumniveaus, waardoor de verstoring van peptidebindingen wordt voorkomen die zouden optreden bij andere dieren die aan vergelijkbare niveaus van ureum worden blootgesteld. Haaien zijn kraakbeenachtige vissen met een rectale klier die zout afscheidt en helpt bij de osmoregulatie.

Figuur 22.3. Vissen zijn osmoregulatoren, maar moeten verschillende mechanismen gebruiken om te overleven in (a) zoetwater- of (b) zoutwateromgevingen. (credit: wijziging van het werk door Duane Raver, NOAA)


Resultaten en discussie

Met kleurstof geladen liposomen werden bereid door een eenvoudige extrusiemethode (Figuur S1). Droge dunne POPC-films op de binnenwanden van een glazen flesje werden eerst gehydrateerd met een gemengde waterige oplossing van ATTO 488 (donor) en ATTO 542 (acceptor) kleurstoffen, wat resulteerde in multilamellaire aggregaten. Liposomen die de donor ("D") en acceptor ("A") kleurstoffen bevatten, hierna "POPC-DA" genoemd, werden vervolgens verkregen door extrusie (zie SI) en verwijdering van extra-liposomale vrije kleurstoffen werd bereikt door spoelen en centrifugeren. De gemiddelde hydrodynamische diameter in water, gemeten door dynamische lichtverstrooiing (DLS) was ≈1 m (Figuur 1b). Het zeta-potentieel (Figuur 1 c) bleek ≈−25 mV te zijn, vergelijkbaar met dat van POPC-liposomen zonder kleurstoflading (Figuur S2) en consistent met eerdere rapporten. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) -beelden laten zien dat sommige POPC-D-A-liposomen multi-lamellair en multi-compartimenten zijn (Figuur 1 d), maar de morfologie kan veranderen na drogen.

ATTO 488 (MW=804 g mol 1) en ATTO 542 (MW=1028 g mol 1) werden gekozen als respectievelijk de donor- en acceptorfluoroforen vanwege hun uitstekende oplosbaarheid in water, hoge fluorescentie kwantumopbrengst en hoge fotostabiliteit, 36 evenals verwaarloosbare interactie met zwitterionische lipide dubbellagen. 37 Bovendien vertonen het fluorescentiespectrum van ATTO 488 en het absorptiespectrum van ATTO 542 in water een aanzienlijke overlap (Figuur 2a), wat een vereiste is voor FRET. 38 De sterke afhankelijkheid van de FRET-efficiëntie van de afstand tussen donoren en acceptoren 38 (als de inverse zesde macht van de afstand) vormt de basis voor het nut van dit fenomeen bij detectie. In een waterige oplossing van FRET-paarkleurstoffen bij een vaste stoichiometrie zijn de donor-acceptorafstanden relevant voor de kleurstofconcentratie. Om de gevoeligheid van de FRET-efficiëntie tussen ATTO 488 en ATTO 542 voor veranderingen in het volume (dwz afstand) te bestuderen, werden de fluorescentiespectra van waterige ATTO 488, ATTO 542 en 1:1 gemengde oplossingen gemeten voor een reeks concentraties, met behulp van een vaste excitatie golflengte van λ=440 nm (Figuur S3, Figuur 2b).

Sensing van osmotische druk. a) Genormaliseerde UV/Vis-absorptiespectra en fluorescentie-emissiespectra van ATTO 488 (donor) en ATTO 542 (acceptor) kleurstoffen in water. b) Fluorescentie-emissiespectra van ATTO 488-ATTO 542 mengsel (1:1 molaire verhouding) in water met verschillende concentraties (0,781-1100 m) bij een vaste excitatiegolflengte van 440 nm. c) Emissieverhouding: R als functie van de kleurstofconcentratie in een molaire verhouding van 1:1 in een waterige bulkoplossing. De ononderbroken lijn is een lineaire aanpassing aan de gegevenspunten (determinatiecoëfficiënt = 0,998). NS) R verkregen met POPC-D-A liposomen geladen met een kleurstofconcentratie van 50 m (1:1 molaire verhouding) als functie van de externe osmotische druk gegenereerd door verschillende concentraties van NaCl, GB of PEG. De excitatiegolflengte was 440 nm. e, f) Cryo-SEM-beelden van POPC-D-A-liposomen in water (e) en NaCl-oplossing (0,35%, 0,27 MPa) (f). Blauwe pijlen geven individuele POPC-D-A-liposomen aan.

In de fluorescentiespectra van de mengsels neemt de bijdrage van de acceptoremissie systematisch toe ten opzichte van de donoremissie met toenemende concentratie (Figuur 2b). Deze waarneming bevestigt duidelijk de gesensibiliseerde emissie van de acceptor (ATTO 542). Om de FRET-efficiëntie te kwantificeren, werd de verhouding (gesensibiliseerde acceptoremissie) / (donoremissie) gebruikt, hier gedefinieerd als de verhouding tussen de emissie-intensiteiten bij 562 nm en 520 nm. In het volgende wordt deze verhouding de emissieverhouding genoemd: R. Figuur 2 c toont R als functie van de kleurstofconcentratie in een molaire verhouding van 1:1, die monotoon toeneemt met de concentratie. In het onderzochte concentratiebereik is de toename zelfs verrassend lineair. De ononderbroken lijn in figuur 2 c is een lineaire aanpassing (determinatiecoëfficiënt = 0,998) met R=43.33 + 1.34C, waar C is de kleurstof (donor/acceptor) molariteit in μ m . Excitatie bij 458 nm (Figuur S4) gaf vergelijkbare resultaten als die verkregen met 440 nm-excitatie. Ruwe schattingen van de gemiddelde next-buurafstand tussen twee kleurstofmoleculen (aangenomen dat ze zich gedragen als ideale opgeloste stoffen) en van de waarschijnlijkheidsverdeling van next-buurafstanden bevestigen dat donoren en acceptors een aanzienlijke kans hebben om relatief dicht bij elkaar te zijn (<10 nm), zie Ondersteunende informatie. Bovendien kunnen de fluorofoordiffusie en het fluorofoorgrootte-effect (de diameter van een typische kleurstofchromofoor is 10-15 Å) worden overwogen om kleine donor-acceptorafstanden verder te bevorderen. 31 Mogelijke interacties tussen de donor en de acceptor-fluoroforen, zoals elektrostatische aantrekking, kunnen de donor-acceptorafstand en daarmee de FRET-efficiëntie beïnvloeden. 31a Deze effecten worden echter empirisch vastgelegd door de ijkcurven op basis waarvan de emissieverhoudingen worden geïnterpreteerd.

In de volgende onderzoeken werd een vaste kleurstofconcentratie van 50 m (1:1 molaire verhouding) gebruikt om de met kleurstof beladen POPC-D-A-liposomen te bereiden. Om de osmotische respons te bepalen, natriumchloride (NaCl), de meest voorkomende opgeloste stof in extracellulaire vloeistof glycine betaïne (GB), een typische intracellulaire organische osmolyt die eiwitten 39 en polyethyleenglycol kan stabiliseren (PEG, gemiddeld MW = 20 000 g mol −1 ), een inert macromolecuul dat veel wordt gebruikt bij de beheersing van osmotische drukken, 26a, 40 werden gebruikt. Voor elk type opgeloste stof werd een reeks oplossingen met onafhankelijk gemeten osmotische drukken bereid (Figuur S5). De POPC-D-A-liposomen werden vervolgens blootgesteld aan de respectieve oplossingen en de FRET-efficiëntie werd bepaald uit de geregistreerde fluorescentiespectra. Figuur 2 d toont R van de intra-liposomale kleurstoffen als functie van de osmotische druk in het bereik van 0 Π ≤0,3 MPa voor alle drie de soorten opgeloste stoffen. Bij Π=0 is de emissieverhouding (R≈125%) is vergelijkbaar met die in een bulkoplossing van dezelfde kleurstoffen bij 50 μm (R≈115 %, zie figuur 2 c). Deze consistentie geeft aan dat de kleurstoffen zich ongeveer gelijkmatig verdelen binnen en buiten de liposomen tijdens het bereidingsproces en is in overeenstemming met het ratiometrische karakter van het FRET-mechanisme, dat de invloed van de monstergeometrie en van de totale hoeveelheid kleurstof in een monster elimineert. Dezelfde consistentie wordt waargenomen bij het vergelijken van liposomen geladen met 25 μm kleurstoffen (R≈85 %, zie afbeelding S6) met een bulkoplossing van 25 μm (R≈80 %, zie figuur 2 c). Moleculaire energieoverdracht kan in het algemeen plaatsvinden via stralings- en niet-stralingsmechanismen. 41 In het onderhavige geval kan het niet-stralingsmechanisme FRET als dominant worden beschouwd op basis van de bovenstaande resultaten en soortgelijke gerapporteerde gevallen. 31a, 31b, 42

Ongeacht het type opgeloste stof, de emissieverhouding R neemt monotoon toe met Π, eerst ongeveer lineair bij lage drukken (Π ≲ 0,2 MPa) en vervolgens naar een zwakkere drukafhankelijkheid bij hogere drukken (Π >0,2 MPa). Gezien de vrijwel lineaire concentratieafhankelijkheid van R in bulk (Figuur 2 c), geeft deze waarneming aan dat de volumetrische respons van de liposomen op de externe osmotische druk niet-lineair is. De liposomen worden gemakkelijker vervormd wanneer ze in hun oorspronkelijke bolvorm zijn dan wanneer ze al gedeeltelijk leeggelopen zijn, een gedrag dat moet worden toegeschreven aan de buigstijfheid van de lipidedubbellaag. De vormveranderingen van de liposomen werden waargenomen met cryo scanning elektronenmicroscopie (cryo-SEM), waaruit bleek dat de oorspronkelijke liposomen bijna bolvormig zijn in zuiver water (Figuur 2e, aangegeven met blauwe pijlen) en afgeplat bij hoge osmotische drukken (Figuur 2 f, aangegeven met blauwe pijlen). De schijfachtige vormen die hier worden waargenomen, zijn kwalitatief consistent met de eerder experimenteel waargenomen en theoretisch voorspelde vormen onder de aanname van een geconserveerd dubbellaags oppervlak. 17, 26b, 43 Aannemende dat de fluoroforen in de liposomen zich gedragen als in een bulkkleurstofoplossing, kan de relatieve volumeverandering (d.w.z. waterverlies) worden geschat uit de bulkkleurstofconcentratie waarbij dezelfde emissieverhouding wordt waargenomen. Bijvoorbeeld voor POPC-D-A-liposomen die onderhevig zijn aan Π=0,1 MPa, waarbij de emissieverhouding R≈160 % (zie figuur 2 d), de equivalente kleurstofbulkconcentratie is Cequiv≈85 μm (zie figuur 2 c). De bijbehorende volumereductie is dan 1−C0/Cequiv≈41%, waar C0= 50 m is de kleurstoflaadconcentratie. De gemiddelde fluorofoorafstand kan ruwweg worden geschat binnen de Wigner-Seitz-benadering. Verder rekening houdend met de effecten van fluorofoordiffusie, grootte en interacties, kunnen de FRET-waarschijnlijkheden worden geschat, indien gewenst, met behulp van specifieke statistische methoden zoals de theorie van Gösele. 31c

Belangrijk is dat de emissieverhouding bij een bepaalde osmotische druk consistent is tussen de drie soorten opgeloste stoffen (Figuur 2 c). Kleine afwijkingen tussen PEG aan de ene kant en de twee andere soorten opgeloste stoffen aan de andere kant moeten worden toegeschreven aan systematische onzekerheden bij de bepaling van de osmotische druk, die op verschillende manieren wordt gemeten voor macromoleculen en kleine opgeloste stoffen (zie Ondersteunende informatie). Dit resultaat toont aan dat de POPC-D-A-liposomen even ondoordringbaar zijn voor alle onderzochte osmotische middelen en dus dezelfde reactie op osmotische stress vertonen, ongeacht de bron ervan. Herhaalde experimenten met dezelfde batch liposomen vertoonden een goede reproduceerbaarheid van de osmotische detectie onder dezelfde omstandigheden (Figuur S7). De omkeerbaarheid van de osmotische respons werd bevestigd in herverdunningsexperimenten (zie figuur S8).

Alles bij elkaar genomen zijn de verkregen resultaten in overeenstemming met de schematische illustratie van het osmotische drukdetectieprincipe in figuur 1a: De liposomen krimpen als gevolg van de osmotisch aangedreven uitwaartse stroming van water door de lipidedubbellaag, zodat de kleurstofconcentratie in de liposoomholte verhoogt, en op zijn beurt de FRET-efficiëntie. In feite zou het aanpassen van de dubbellaagse buigstijfheid, de spectrale overlap tussen de gekozen fluoroforen, de initiële intra-liposomale kleurstofconcentratie en geladen osmotisch actieve opgeloste stoffen aan de binnenkant het mogelijk moeten maken om sensoren te produceren die zijn geoptimaliseerd voor een breed scala aan osmotische drukken. Het osmotische drukbereik kan bijvoorbeeld gemakkelijk worden uitgebreid naar fysiologische zoutconcentraties en verder door liposomen te laden met osmotisch actieve opgeloste stoffen aan de binnenkant, zoals voorbeeldig getoond voor 0,1% NaCl (Figuur S9). De toename van het bereik van toegankelijke osmotische drukken komt echter als een afweging met gevoeligheid, zoals blijkt uit de verminderde helling van emissieverhouding versus osmotische druk (Figuur S9), wat de mogelijkheid en de noodzaak benadrukt om de sensoren te optimaliseren om het vereiste drukbereik.

Met het detectieprincipe vastgesteld, werd de mogelijkheid van spatiotemporele beeldvorming van osmotische drukken met POPC-D-A-liposomen onderzocht. Confocale laser scanning microscopie (CLSM) werd gekozen voor gesensibiliseerde emissie FRET-beeldvorming bij een excitatiegolflengte van λ= 458 nm (zie SI voor de details). Bij hoge vergroting (oculair 630 ×) kunnen goed verspreide individuele liposomen worden waargenomen die donoremissie, gesensibiliseerde acceptoremissie en directe acceptoremissiesignalen vertonen (Figuur 3a). In de volgende stap werd een druppel POPC-DA-liposoomsuspensie op een glasplaatje afgebeeld met een lagere vergroting door de donor-fluoroforen te exciteren en de emissie van de donor (donorsignaal, figuur 3b linkerbovenpaneel) en de acceptor-fluoroforen op te nemen (gesensibiliseerd acceptoremissiesignaal, figuur 3b rechterbovenpaneel) afzonderlijk. De directe acceptoremissie (Figuur 3b linkerpaneel) werd onderzocht via selectieve acceptorexcitatie met een langere golflengte (λ=561nm). Volgens vastgestelde procedures, 29d, 32a, 44 wordt het FRET-rendement dan opnieuw gemeten in de vorm van de verhouding R tussen de gesensibiliseerde acceptoremissie en de donoremissie voor elke pixel (Figuur 3b rechtsonder). Figuur 3 c toont emissieverhoudingsbeelden van POPC-D-A-geladen druppeltjes NaCl-oplossingen met systematisch toenemende NaCl-concentraties die overeenkomen met osmotische drukken in het bereik tussen 0 en -0,31 MPa. De emissieverhouding, gemiddeld in een interessegebied aangegeven met een rode rechthoek, neemt systematisch toe met toenemende osmotische druk, van R≈53 % (bij Π=0) tot R≈87 % (bij Π≈0,31 MPa). Kwantitatieve analyse leverde een kalibratiecurve op (Figuur 3 d), waarvan de vorm consistent is met die verkregen in de spectrofluorometer (Figuur 2 d). Merk echter op dat de R-waarden verkregen uit de fluorescentiemicroscopie kunnen niet kwantitatief worden vergeleken met die verkregen uit de fluorescentiespectroscopie vanwege verschillende verzamelings- en berekeningsmethoden van het signaal. De ruimtelijke resolutie waarmee de osmotische druk kan worden afgebeeld, is voornamelijk gerelateerd aan de gemiddelde afstand tussen individuele sensor-liposomen in het monster en kan worden verbeterd door de liposoomconcentratie te verhogen.

Toepassing van POPC-D-A liposomen voor beeldvorming met osmotische druk. a) Confocale laser scanning microscopie (CLSM) beelden van individuele POPC-DA liposomen in water bij hoge vergroting, met het donoremissiesignaal aan de linkerkant (Ex 458 nm, Em 468-538 nm), het gesensibiliseerde acceptoremissiesignaal in het midden (Ex 458 nm, Em 571-700 nm), en het directe acceptoremissiesignaal aan de rechterkant (Ex 561 nm, Em 571-700 nm). b) CLSM-beelden bij lagere vergroting. De afbeelding rechtsonder toont de emissieverhouding R in elke pixel. c) Emissieverhouding (R) afbeeldingen van POPC-D-A-liposomen in NaCl-oplossingen van verschillende osmotische drukken. d) Kalibratiecurve geregistreerd bij verschillende osmotische drukken. De ononderbroken lijn is een empirische tweede-orde polynoom die past bij de gegevenspunten (determinatiecoëfficiënt = 0,998).

Om de haalbaarheid van het in situ in kaart brengen van ruimtelijk verdeelde osmotische drukken te illustreren, werden eerst twee druppeltjes waterige POPC-DA liposoomsuspensies, één met zuiver water en één met een NaCl-oplossing van Π=0,285 MPa, eerst in de buurt gebracht (zie figuur). 4a voor het emissieverhoudingsbeeld) en vervolgens tot coalescentie gebracht (Figuur 4b). De ruimtelijk afhankelijke verdeling van emissieverhouding (R) waarden onthullen de tijdelijke vorming van een osmotische drukgradiënt (aangegeven met de gele pijl) over de contactzone. Bovendien kunnen gebieden met verhoogde osmotische druk duidelijk worden geïdentificeerd langs de randen van de oplossing (aangegeven met witte pijlen). Ze kunnen worden beschouwd als manifestaties van steile osmotische drukgradiënten als gevolg van waterverdamping onder stationaire omstandigheden.

FRET-beeldvorming voor de in situ spatiotemporele meting van osmotische drukken. a) Emissieverhouding (R) afbeelding van twee druppeltjes waterige POPC-D-A liposoomsuspensies met verschillende osmotische drukken. Ze vertonen duidelijk verschillende FRET-efficiënties. b) Emissieverhouding (R) beeld na druppelcoalescentie met duidelijke osmotische drukgradiënten. c) Monitoring van osmotische drukveranderingen van een NaCl-oplossing tijdens het verdampingsproces. d) Spatiotemporele beeldvorming van een osmotische drukgradiënt gegenereerd door gelokaliseerde coalescentie van een waterdruppel en een druppel NaCl-oplossing. De aangegeven osmotische drukken worden berekend met behulp van de kalibratiecurve (Figuur 3 d).

In de volgende stap werd de in situ spatiotemporele meting van osmotische drukken door time-lapse fluorescentiebeeldvorming en daaropvolgende kwantitatieve analyse verder onderzocht. Hiertoe werden de liposomen gebruikt voor real-time in situ monitoring van dynamisch veranderende osmotische drukken tijdens een verdampingsproces van NaCl-oplossing. Een druppel NaCl-oplossing met matige osmotische druk (-0,095 MPa) die POPC-D-A-liposomen bevatte, werd op de glazen bodem van een schaal van 20 mm met deksel geplaatst en liet verdampen. Time-lapse fluorescentiebeeldvorming laat zien dat de emissieverhouding R nam in de loop van de tijd geleidelijk toe binnen 1 uur (Figuur 4 c, Figuur S10). Met de kalibratiecurve (Figuur 3 d) bij de hand, werden de osmotische drukken berekend en weergegeven in Figuur 4 c. De oplossingsconcentraties (Tabel S1) werden verder berekend volgens de kalibratiecurve van de osmotische druk-massafractie (Figuur S5d), waarbij werd gezien dat de osmotische druk en de NaCl-concentratie in de loop van de tijd monotoon toenamen. Deze resultaten tonen duidelijk aan dat de POPC-D-A liposoomsensoren kunnen worden gebruikt om dynamisch veranderende osmotische drukken in situ te meten. Een mogelijke verstoring van de liposoomverdeling in de druppels als gevolg van koffieringeffect en Marangoni-stroom heeft geen invloed op de meting van osmotische drukken als gevolg van het ratiometrische karakter van FRET-microscopie. Soortgelijke sensoren kunnen in feite worden gebruikt om meer inzicht te krijgen in deze twee fenomenen.

In een continue oplossing met een aanvankelijke osmotische drukgradiënt, vertoont de osmotische drukverdeling een spatiotemporele evolutie totdat een evenwicht is bereikt via diffusie van oplosmiddel en opgeloste stof. Zoals weergegeven in figuur 4 d, kan ook dit proces worden gevolgd met behulp van de POPC-D-A liposoomsensoren. Met een zelfgemaakt apparaat (Figuur S11) werd een aanvankelijk steile osmotische drukgradiënt gegenereerd door gelokaliseerde coalescentie van een waterdruppel en een druppel NaCl-oplossing (Π≈0,285 MPa, concentratie van 0,375 %), beide met POPC-DA-liposomen . Time-lapse emissieverhouding (R) beeldvorming maakte het mogelijk om de evolutie van de osmotische drukverdeling en van het evenwichtsproces te volgen (Figuur 4 d, Figuur S12 a-c). Op elk punt in de ruimte kan de momentane osmotische druk worden berekend volgens de kalibratiecurve (Figuur 3 d). Dit gebeurde voorbeeldig binnen de vier rechthoeken die zijn aangegeven in figuur 4 d (afbeelding rechts, opgenomen na 86,8 s). De verkregen osmotische drukken voor deze vier punten langs de osmotische gradiënt en over een afstand van ongeveer 1 mm zijn respectievelijk 0,185, 0,138, 0,060 en 0,030 MPa, wat overeenkomt met NaCl-concentraties van 0,249 %, 0,189 %, 0,092 % en 0,053 % , respectievelijk (Tabel S2). Ruimtelijk beter opgeloste osmotische druk- en concentratiegegevens worden gerapporteerd in figuur S12 d en tabel S2. De steilheid van de osmotische drukgradiënt bleek geleidelijk af te nemen met de tijd totdat een constante osmotische druk werd bereikt na -30 min (Figuur S12).

De spatiotemporele evolutie van de FRET-efficiëntie wordt in principe niet alleen bepaald door de spatiotemporele evolutie van de osmotische druk, maar ook door de temporele respons van de liposomen op osmotische drukveranderingen. Om de rol van de laatste te schatten, is de temporele respons van de emissieverhouding R werd bepaald in "druksprongexperimenten", waarbij de liposomen werden toegevoegd aan homogene oplossingen met gedefinieerde osmotische drukken, gevolgd door snelle FRET-metingen. Zoals weergegeven in figuur S13, is de evenwichtswaarde van R is already reached when the first FRET measurement was finished after 2 s. This finding is consistent with the reported virtually “immediate” osmotic response of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) liposomes 17 and suggests that the spatiotemporal evolution of the FRET efficiency indeed reflects primarily the spatiotemporal evolution of the osmotic pressure. Moreover, the time-dependent measurements also show that the emission ratio does not change within the time frame of 1 h (Figure S13), demonstrating that photobleaching does not visibly affect the data obtained under our experimental conditions.


Assorted References

…be able to contend with osmotic pressure. This pressure arises if two solutions of unequal solute concentration exist on either side of a semipermeable membrane such as the skin. Water from the solution with a lower solute concentration will cross the membrane diluting the more highly concentrated solution until both…

…a specific amount, called the osmotic pressure. The Dutch-born chemist Jacobus Henricus van ’t Hoff showed in 1886 that if the solute is so dilute that its partial vapour pressure above the solution obeys Henry’s law (i.e., is proportional to its concentration in the solution), then osmotic pressure varies with…

chemical equilibrium, and osmotic pressure.

Effect on

…pressure difference is called the osmotic pressure of the solution.

A third colligative property, osmotic pressure, helped to establish the fundamentals of modern physical chemistry and played a particularly important role in the early days of solution theory. Osmosis is especially important in medicine and biology, but in recent years it has also…

Regulation by

…adaptations to regulate the blood’s osmotic pressure. Osmotic pressure can be described as the pressure of a water solution of salts exerted in either direction against a semipermeable membrane. This pressure is caused by differences between the concentrations of dissolved salts within the body and those outside, in the sea.…

This presents a problem of osmotic regulation in waters of different salinities. The physiology of most fishes is fixed for life in fresh water or in the sea, but most of the freshwater salmoniforms are able to live in the sea because they can excrete excess salts through cells in…

Role in

…loss of electrolytes (salt), the osmotic pressure of the extracellular fluids becomes higher than in the cells. Since water passes from a region of lower to a region of higher osmotic pressure, water flows out of the cells into the extracellular fluid, tending to lower its osmotic pressure and increase…

In order to understand the advantages of the excretion of uric acid over urea it is necessary to know something about the behaviour of molecules in solution. Molecules of a solute (bijv. salt, sugar) in water tend to move by diffusion from a…

…to volume, chemical composition, and osmotic pressure. Under the drive of arterial pressure, water and salts are filtered from the blood through the capillaries of the glomerulus into the lumen, or passageway, of the nephron, and then most of the water and the substances that are essential to the body…

…to establish equilibrium is called osmotic pressure. Water moves from a region of low osmotic pressure to a region of high osmotic pressure.


Methods in Tau Cell Biology

Peter J. Chung , . Cyrus R. Safinya , in Methods in Cell Biology , 2017

5.4 SAXS Osmotic Pressure Samples

One of the unique advantages of in situ sample measurements is the ability to add noninteracting polymeric depletants to samples to induce osmotic pressure between colloidal objects (in our case, microtubules) ( Fig. 4 ). As the force applied can be calculated via osmotic depletants added and the change in distance between microtubules measured by SAXS analysis, a force–distance diagram can be obtained. This reveals valuable information with regard to the nature and magnitude of interactions between microtubules while also replicating the macromolecular crowded conditions of the cell.

Afb. 4 . Paclitaxel-stabilized microtubules with Tau may still be bundled under the influence of osmotic pressure, with structure deducible via the SAXS. (A–C) While paclitaxel-stabilized microtubules do not have a higher-order structure and are, instead, nematically aligned (A), under osmotic pressure microtubules can transition to a buckled rectangular phase (B) and a hexagonal phase (C). (D,E) While microtubules coated with Tau isoforms with the shortest projection domain (4RS Tau to tubulin ratio, Φ4RS = 1/10) exhibit a standard transition from nematic to buckled rectangular to hexagonally bundled microtubules, microtubules coated with Tau isoforms with the longest projection domain (4RL Tau to tubulin ratio Φ4RL = 1/10) require a much higher osmotic pressure for the columnar phase to begin and, even then, only exhibit the hexagonally bundled phase.

Adapted from Chung, P. J., Choi, M. C., Miller, H. P., Feinstein, H. E., Raviv, U., Li, Y., et al. (2015). Direct force measurements reveal protein Tau confers short-range attractions and isoform-dependent steric stabilization to microtubules. Proceedings van de National Academy of Sciences van de Verenigde Staten van Amerika, 112(47), E6416–E6425. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.1513172112 .

Briefly, this “depletion force” is an attractive, entropic force between large colloidal particles as a result of being suspended in a dilute solution of smaller solutes or depletants ( Asakura & Oosawa, 1958 ). Often, depletants are preferentially excluded near the vicinity of colloidal particles owing to an entropically favorable reduction in the colloidal excluded volume, causing the colloids to “attract” as a function of colloidal geometry, depletant size, and depletant concentration. While this technique was first used in biological reconstitutions to measure the forces between lipid bilayers ( Parsegian, Fuller, & Rand, 1979 ) and DNA macroions ( Parsegian, Rand, Fuller, & Rau, 1986 ), it has been extended to measure the forces between elements in cytoskeletal networks, such as neurofilaments ( Beck, Deek, Jones, & Safinya, 2010 Deek, Chung, Kayser, Bausch, & Safinya, 2013 Safinya, Deek, Beck, Jones, & Li, 2015 ) and microtubules ( Chung et al., 2015, 2016 Needleman, Ojeda-Lopez, Raviv, Ewert, et al., 2004 ).

5.4.1 Choice of depletant

The osmotic pressure that can be effected by the depletant will depend on the following variables, some of which must be evaluated in tandem:

The depletant should not directly interact with the colloids being depleted thus, the choice of PEG/PEO as the depletant of choice for many systems as it is considered to be biologically inert. (As an aside, poly(ethylene glycol), or PEG, and poly(ethylene oxide), or PEO, are chemically equivalent, but PEG is usually used for polymers with molecular mass ≤ 20,000 Da, while PEO is used for polymers with molecular mass > 20,000 Da). Should the depletant have known direct interactions with the colloid, a semi-permeable membrane is required (physically segregating colloids and depletants), which is technically challenging for capillary samples.

The size of the depletant should be equal to or larger than the intercolloidal distances being probed. Tau-mediated microtubule bundles can have intermicrotubule spacings of

40 nm, requiring depletants equal to or larger than

40 nm for direct force measurements. Prior work ( Devanand & Selser, 1991 ) measured the radius of gyration (RG) as a function of PEG molecular mass (MW):

The effective depletant radius (een) can be thus calculated:

The prior variable must be balanced against the desired osmotic pressure range to be probed. Normally, smaller depletants (e.g., PEG with lower molecular masses) are ideal for probing higher osmotic pressures as an equivalent w/v% of a lower molecular mass PEG means higher number density of PEG molecules can be achieved, thus increasing the dynamic range of the depletion force. However, if the depletant is not sufficiently large, the depletant will penetrate the intercolloidal space and result in inaccurate force–distance measurements.

Prior osmotic pressure characterization of the depletant chosen is ideal, especially at the desired temperature. It is also possible to calculate the osmotic pressure effect of the depletant, without prior characterization, as a virial expansion with theoretical/calculated virial coefficients, but direct experimental observation is preferred.

5.4.2 Calculating osmotic pressure from depletant concentration

Sometimes (but not often!) the amount of depletant solution will make the overall depletant concentration match a prior measurement. For example, suppose that 10 μL of 25 w/v% stock solution of PEG8k has been added to 40 μL of sample solution set to 35°C. According to available osmotic pressure data ( Stanley & Strey, 2003 ), this 5 w/v% solution of PEG8k (overall) has the equivalent osmotic pressure of 37,800 Pa.


DMCA-klacht

Als u van mening bent dat inhoud die beschikbaar is via de Website (zoals gedefinieerd in onze Servicevoorwaarden) een of meer van uw auteursrechten schendt, dient u ons hiervan op de hoogte te stellen door middel van een schriftelijke kennisgeving (“Inbreukmelding”) met de hieronder beschreven informatie aan de aangewezen onderstaande makelaar. Als Varsity Tutors actie onderneemt als reactie op een Kennisgeving van Inbreuk, zal het te goeder trouw proberen contact op te nemen met de partij die dergelijke inhoud beschikbaar heeft gesteld door middel van het meest recente e-mailadres, indien aanwezig, dat door een dergelijke partij aan Varsity Tutors is verstrekt.

Uw kennisgeving van inbreuk kan worden doorgestuurd naar de partij die de inhoud beschikbaar heeft gesteld of naar derden zoals ChillingEffects.org.

Houd er rekening mee dat u aansprakelijk bent voor schade (inclusief kosten en advocatenhonoraria) als u een materiële verkeerde voorstelling van zaken geeft dat een product of activiteit inbreuk maakt op uw auteursrechten. Als u er dus niet zeker van bent dat inhoud die zich op de Website bevindt of waarnaar wordt gelinkt door uw auteursrecht schendt, moet u overwegen eerst contact op te nemen met een advocaat.

Volg deze stappen om een ​​melding in te dienen:

U moet het volgende opnemen:

Een fysieke of elektronische handtekening van de eigenaar van het auteursrecht of een persoon die gemachtigd is om namens hen op te treden Een identificatie van het auteursrecht waarvan wordt beweerd dat het is geschonden Een beschrijving van de aard en exacte locatie van de inhoud waarvan u beweert dat het inbreuk maakt op uw auteursrecht, in voldoende detail om Varsity Tutors in staat te stellen die inhoud te vinden en positief te identificeren, we hebben bijvoorbeeld een link nodig naar de specifieke vraag (niet alleen de naam van de vraag) die de inhoud bevat en een beschrijving van welk specifiek deel van de vraag - een afbeelding, een link, de tekst, enz. - uw klacht verwijst naar uw naam, adres, telefoonnummer en e-mailadres en een verklaring van u: (a) dat u te goeder trouw gelooft dat het gebruik van de inhoud waarvan u beweert dat deze inbreuk maakt op uw auteursrecht, is niet door de wet is geautoriseerd, of door de eigenaar van het auteursrecht of de vertegenwoordiger van een dergelijke eigenaar (b) dat alle informatie in uw kennisgeving van inbreuk juist is, en (c) op straffe van meineed, dat u ofwel de eigenaar van het auteursrecht of een persoon die gemachtigd is om namens hen op te treden.

Stuur uw klacht naar onze aangewezen agent op:

Charles Cohn Varsity Tutors LLC
101 S. Hanley Rd, Suite 300
St. Louis, MO 63105