Informatie

Hoe goed kunnen eiwitten onderscheid maken tussen ATP en GTP? Kan ATP fungeren als een GTP-nabootser?


GTP en ATP zijn vergelijkbare structuren waarbij de adenosine- en guanosinegroepen verschillen. Beide zijn betrokken bij een breed scala aan biologische functies.

Het is echter aangetoond dat in bepaalde gevallen GTP en water kan nabootsen van ATP (Niefind et al., 1999).

Zijn er voorbeelden waarbij ATP heeft gehandeld als een nabootser van GTP? Of met andere woorden, zijn er eiwitten die niet zo goed onderscheid kunnen maken tussen GTP en ATP?


Beide kanten nu: meerdere interacties van ATP met pannexin-1 hemikanalen. Focus op 𠇊-permeant dat de permeatieporie reguleert: remming van pannexine 1-kanalen door ATP”

hoe atp en andere nucleotiden worden vrijgemaakt uit intacte cellen is een fundamentele vraag, gezien het bestaan ​​van meerdere purinerge receptorsignaleringscascades die werkzaam zijn in de meeste weefsels van gewervelde dieren (25). Het is algemeen bekend dat neuronen en neuro-endocriene cellen ATP afgeven via klassieke mechanismen waarbij Ca2+-afhankelijke exocytotische afgifte betrokken is van nucleotiden die samen met andere neurotransmitters zijn verpakt in gespecialiseerde secretoire blaasjes of granules. Veel, inderdaad de meeste, niet-exciteerbare celtypen geven echter lokaal ATP af via niet-lytische mechanismen die geen duidelijke of gemakkelijk gemeten exocytose van nucleotide-bevattende blaasjes of korrels omvatten. Een alternatief mechanisme voor niet-lytische ATP-afgifte is de gefaciliteerde efflux uit het cytosolische compartiment door plasmamembraantransporteiwitten. Verschillende membraantransporteiwitten of functioneel gekarakteriseerde permeabiliteitsroutes zijn voorgesteld als "ATP-kanalen", waaronder enkele ATP-bindende cassette (ABC) -familie transporters, volume-gereguleerde anionkanalen, plasmamembraanvarianten van het mitochondriale spanningsafhankelijke anionkanaal (VDAC ) porines en maxianionkanalen (31). Bovendien geeft een sterke en groeiende hoeveelheid gegevens aan dat ATP-afgifte uit veel celtypen wordt gemedieerd door zogenaamde hemikanalen die zijn samengesteld uit eiwitsubeenheden van de goed gekarakteriseerde connexine (Cx) -familie of de recent beschreven pannexine (Panx) -familie (19, 23, 26). Hemikanalen kunnen fungeren als kanalen met lage weerstand voor de efflux van ATP en andere cytosolische metabolieten (59). De alomtegenwoordige expressie van het Panx1-gen in de meeste weefsels en celtypen suggereert dat Panx1-hemikanalen een van de meest gebruikte effluxroutes voor ATP-afgifte in verschillende paracriene en autocriene signaalreacties kunnen zijn (4, 30). Met name extracellulair ATP zelf, dat via bepaalde P2Y- of P2X-receptoren werkt, kan intracellulaire signalen opwekken die het poorten van hemikanalen naar de open toestand bevorderen. Dit vergemakkelijkt een pad van wat kan worden aangeduid als "ATP-geïnduceerde ATP-afgifte" gekoppeld aan paracriene signaal"golven" die meerdere cellen in een weefsel in staat stellen proactief te reageren op omgevingsstress (bijv. Metabole remming, mechanische afschuiving en microbiële invasie) door slechts een paar cellen op de directe plaats van belediging of stimulatie van de omgeving (51). Dit soort paracriene signalering kan een positieve rol spelen bij adaptieve reacties, zoals ischemische preconditionering, verlichting van mechanische stress of het doden van binnendringende pathogenen, met duidelijk fysiologisch voordeel voor het hele dier. Een cascade van P2-receptoractivering gekoppeld aan het poorten van ATP-permeabele hemikanalen omvat echter ook een positieve feedbacklus die, indien ongeremd, zou kunnen leiden tot onaangepaste en kwaadaardige uitputting van intracellulaire ATP-voorraden, ineenstorting van ionische gradiënten en celdood. Er is dus veel aandacht besteed aan de identificatie van endogene factoren die de poorten/geleiding van hemikanalen kunnen remmen of beperken. In een paper van Qui en Dahl (40a) beschrijven ze een hoogst nieuw mechanisme dat gebaseerd is op een directe remmende werking van extracellulair ATP op de poorting en/of activiteit van pannexine-1 hemikanalen.


Invoering

DNA-moleculen zijn de substraten voor een verscheidenheid aan processen, waaronder replicatie, transcriptie en recombinatie. Er zijn veel positieve regulerende mechanismen beschreven die de selectie van bepaalde DNA's als substraten voor een van deze processen bevorderen. In sommige situaties kunnen de positieve eigenschappen van een DNA echter worden overschreven door negatieve regulerende mechanismen. Sommige transcriptionele eenheden worden bijvoorbeeld 'tot zwijgen gebracht' door ze te verpakken in gespecialiseerde chromatinestructuren die interacties met RNA-polymerase voorkomen (Lo en Rine, 1995). Eukaryotische oorsprongen van replicatie worden ook 'stil' na het initiëren van DNA-replicatie, als onderdeel van de celcycluscontrole die het mogelijk maakt dat een oorsprong één keer en slechts één keer vuren tijdens de S-fase (Muzi-Falconi et al., 1996 Wuarin en Nurse, 1996).

Negatieve regulerende mechanismen kunnen ook van invloed zijn op de selectie van doellocaties bij omzetting. De bacteriële transposons Tn3 en Tn7 en de bacteriofaag Mu zijn gevoelig voor een proces dat doelwitimmuniteit wordt genoemd, waarbij wordt voorkomen dat een doelwitmolecuul dat al een kopie van een van deze elementen bevat, verdere inserties van dat element ontvangt ( Robinson et al., 1977 Hauer en Shapiro, 1984 Reyes et al., 1987 ). Het doel-DNA wordt dus 'stil' of 'immuun' voor de omzettingsmachinerie.

Het signaal dat immuniteit verleent aan een doelwit-DNA wordt geleverd door de uiteinden van de residente Tn3, Tn7 of Mu-element. Transposon-uiteinden bevatten speciale sequenties die de substraten zijn voor de DNA-breuk- en verbindingsreacties die het element van het ene DNA-molecuul naar het andere verplaatsen. Transposon-uiteinden bevatten ook bindingsplaatsen voor transposase, het enzym dat de DNA-breuk- en verbindingsreacties uitvoert (beoordeeld door Mizuuchi, 1992). De aanwezigheid van Tn3, Tn7 of Mu eindigt in een doelplasmide vermindert de frequentie van transpositie in dat plasmide 100- tot 1000-voudig in vivo de transpositie in andere doelmoleculen die geen transposon-uiteinden bevatten, wordt echter niet geremd (Lee et al., 1983 Darzins et al., 1988 Arciszewska et al., 1989 ). Daarom is doelimmuniteit in wezen een cis-werkend fenomeen dat voorkomt dat nieuwe inserties 'dicht' bij transposon-uiteinden plaatsvinden.

Hoe dichtbij is ‘dichtbij’? In het geval van Tn7, grote (60 kb) afgeleiden van de Escherichia coli F-plasmide zijn beschermd tegen Tn7 transpositie wanneer het plasmide Tn . bevat7 eindsequenties ( Arciszewska et al., 1989 ). Over nog grotere afstanden wordt de omzetting in de E coli chromosoom: de aanwezigheid van Tn7 uiteinden bleek inserties in chromosomale plaatsen op 190 kb afstand te verminderen (DeBoy en Craig, 1996). Echter, transpositie naar een doellocatie 1,9 Mb van de Tn7 uiteinden was niet aangetast, wat aantoont dat de Tn7 uiteinden veroorzaken geen globale remming van transpositie (DeBoy en Craig, 1996).

Het vermogen om onderscheid te maken tussen doelen die 'dichtbij' en 'ver' van Tn . zijn7 uiteinden kunnen nuttig zijn bij het bevorderen van de verspreiding en overleving van Tn7. Transpositiegebeurtenissen op korte afstand zouden in plaats daarvan worden ontmoedigd, de verspreiding van het transposon naar verre plaatsen in het chromosoom en nieuwe plasmiden zouden worden bevorderd. Immuniteit zou ook gebeurtenissen ontmoedigen die mogelijk Tn . zouden kunnen vernietigen7, zoals intramoleculaire transpositiegebeurtenissen of het springen van één kopie van Tn7 in een ander. Doelimmuniteit speelt dus een sleutelrol bij het bepalen op welke doelwitplaatsen de Tn7 omzettingsmachines zullen selecteren.

de Tn7 transpositiemachines evalueren ook een potentieel doelwit-DNA op positieve kenmerken. Tn7 transpositie vindt plaats met hoge frequentie naar een enkele plaats in de E coli chromosoom genaamd attTn7 (Barth) et al., 1976 Lichtenstein en Brenner, 1982). Plasmiden die conjugatie ondergaan, zijn ook voorkeursdoelen voor Tn7 omzetting ( Wolkow et al., 1996 ). Dus, attTn7 en conjugerende plasmiden bevatten positieve signalen die de transpositiemachinerie naar deze doel-DNA's aantrekken. Verschillende combinaties van de Tn7-gecodeerde eiwitten TnsA, TnsB, TnsC, TnsD en TnsE worden gebruikt om deze verschillende doelen te selecteren: TnsABC+D bevordert de transpositie in attTn7, terwijl TnsABC + E de transpositie in conjugerende plasmiden bevordert ( Rogers et al., 1986 Waddell en Craig, 1988). Doelimmuniteit wordt waargenomen in zowel de TnsABC+D- als de TnsABC+E-transpositieroutes (Arciszewska et al., 1989), wat suggereert dat het negatieve signaal van een Tn7 end is dominant voor de positieve signalen die ook aanwezig kunnen zijn op een potentieel doelwitmolecuul.

Tn7 omzetting in attTn7 is opnieuw samengesteld in vitro met behulp van gezuiverde eiwitten (Bainton et al., 1993), en de rollen van de Tns-eiwitten bij het uitvoeren van Tn7 omzetting zijn onderzocht. TnsA en TnsB werken onderling afhankelijk om de chemische stappen van Tn . te katalyseren7 transpositie, dus TnsA+B vormt de Tn7 transposase (mei en Craig, 1996 Sarnovsky et al., 1996 ). TnsB bindt specifiek aan de transposon-uiteinden (Arciszewska en Craig, 1991 Arciszewska et al., 1991 Tango et al., 1991), terwijl TnsA waarschijnlijk wordt gerekruteerd naar de transposon-uiteinden door eiwit-eiwit-interacties met TnsB.

De TnsA+B-transposase is op zichzelf niet katalytisch actief TnsC, TnsD en een geschikt doelwit-DNA is ook vereist (Bainton et al., 1993 Gary et al., 1996 ). TnsD is een attTn7-specifiek DNA-bindend eiwit dat TnsC, een ATPase dat ook een ATP-afhankelijk DNA-bindend eiwit is, rekruteert om attTn7 doelen. TnsC–TnsD–attTn7 complexen op hun beurt interageren met de TnsA+B-transposase en activeren de breuk- en verbindingsactiviteiten ervan (Gamas en Craig, 1992 Bainton et al., 1993 A.Stellwagen en N.L.Craig, in voorbereiding). Er is voorgesteld dat TnsC een sleutelconnector is tussen de doelsite en de TnsA+B-transposase, en de hypothese is dat de ATP-toestand van TnsC zijn vermogen om die verbinding te smeden reguleert (Bainton et al., 1993 , Stellwagen en Craig, 1997).

Tn7 transpositie vindt plaats door een knip-en-plakmechanisme, waarbij het element eerst uit een donorplaats wordt weggesneden en vervolgens in een doel-DNA wordt ingebracht (Bainton et al., 1991 ). De aard van het doel-DNA regelt beide stappen in vitro: als een attTn7 doelmolecuul wordt weggelaten uit de reactie, er worden vrijwel geen transpositietussenproducten of -producten gezien. Doelimmuniteit wordt gereproduceerd in de in vitro Tn7 omzettingsreactie ( Bainton et al., 1991 , 1993 ) de evaluatie van Tn7 eindbevattende doelen komen ook vroeg in het verloop van de reactie voor. Er worden geen transpositieproducten of tussenproducten waargenomen wanneer het doel-DNA bevat attTn7 maar draagt ​​ook een Tn7 rechter uiteinde. Daarom, Tn7 eindbevattende doel-DNA's zijn immuun voor Tn7 transpositie niet omdat ze er niet in slagen uitgesneden transposons te vangen, maar omdat ze er in de eerste plaats niet in slagen om de uitsnijding van de transposon uit te lokken.

In vitro benaderingen zijn eerder gebruikt om doelimmuniteit bij Mu-transpositie te onderzoeken. Adzuma en Mizuuchi (1988, 1989) toonden aan dat Mu-doelimmuniteit resulteert uit de herverdeling van het regulerende eiwit MuB van doel-DNA's die Mu-uiteinden bevatten naar doel-DNA's zonder uiteinden. Deze herverdeling wordt bevorderd door het MuA-transposase en vereist ATP-hydrolyse. Het was echter onduidelijk of dit mechanisme uniek zou zijn voor Mu of dat het van toepassing zou zijn op andere transposons. Het was met name onduidelijk hoe Tn7- met zijn meerdere eiwitten en meerdere selectieroutes voor doelwitten - zou dit immuniteitsmechanisme kunnen aanpassen.

In dit werk hebben we het mechanisme van Tn . onderzocht7 doel immuniteit. We vinden dat de belangrijkste eiwitten die verantwoordelijk zijn voor Tn7 doelimmuniteit zijn TnsB, het transposon-eindbindende eiwit, en TnsC, het ATP-afhankelijke doel-DNA-bindende eiwit. Wanneer TnsB en TnsC zich in een hoge lokale concentratie bevinden (d.w.z. wanneer beide gelokaliseerd zijn op een Tn7 eindbevattend doelwit-DNA), wordt immuniteit aan dat doelwit opgelegd. Een aantrekkelijk model dat uit dit werk naar voren komt, is dat TnsB de dissociatie van TnsC van Tn bevordert7 eindbevattende doel-DNA's, via een ATP-afhankelijk mechanisme. TnsB lijkt dus doelimmuniteit op te leggen door de verdeling van TnsC over potentiële doelwit-DNA's te beïnvloeden. We bespreken de overeenkomsten tussen de mechanismen waarmee Tn7 en Mu bereiken doelimmuniteit, en we bespreken hoe Tn7 maakt gebruik van dit mechanisme, niet alleen om immuundoelen te vermijden, maar ook om voorkeursdoelen voor Tn . te selecteren7 omzetting.


Celstructuur en functie QUIZ

Twee types:
1) Ruwe ER
- "Ruw" omdat het bezaaid is met ribosomen --> betrokken bij co-translationele translocatie
- Uitgebreid in cellen die veel afscheiden (bijv. pancreas)
- Initiële plaats van N-gebonden glycosylering

Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)--> Multipass ABC transporter chloridekanaal

Wild type --> 70% van het CFTR-gen produceert --> verkeerd gevouwen --> afgebroken

Verkeerd gevouwen eiwit --> blootgestelde hydrofobe gebieden

2) Sorteren (Glyco-code)
- Geglycosyleerde toestand geeft progressie door het endomembraansysteem aan --> gebruikt als een sorteersignaal voor beweging door het systeem

3) Proteolytische bescherming:
- bijv. Slijmvlies (proteoglycaan)

1) Timer
- Eiwitten die te veel tijd in ER doorbrengen --> waarschijnlijk verkeerd gevouwen

Omdat eiwit in het ER zit --> Glucose en mannose trimmen van de glycosylering vindt plaats --> Als een "core" mannose wordt getrimd, zal mannosidase (MNS1) eiwit uit ER transporteren --> eiwitafbraak

2) Markeringen voor vouwen met hulp van chaperonne

Ongevouwen eiwitten worden geglucosyleerd --> geglucosyleerde eiwitten worden herkend door chaperonne (calnexine) --> poging vouwen -->>>

Als vouwen correct is --> Eiwit verlaat ER

COPII-jas bevordert beweging van ER --> Golgi

Membraaneiwitten (zoals ladingreceptoren) hebben een KKXX-motief dat COPI-coating direct bindt --> Budding, transport naar ER

1) Het kan niet tegelijkertijd lading binden en worden opgenomen in COPII-blaasjes

Sterk gecompartimenteerd --> elke cisterna heeft een specifieke functie (niet onthouden)

1) Cis --> kijkt naar de ER --> sorteert verkeer terug naar ER
2) Trans --> kijkt weg van de ER --> transport elders

1) Verwerking
- N-gekoppelde glycoproteïnen (geglycosyleerd in het ER) ondergaan een reeks modificaties aan de N-gekoppelde kern --> leveren diverse reeks suikergroepen op --> meerdere functies

2) Secretoire blaasje
- Vereist een signaal --> vormt een secretieblaasje --> induceerbare secretie (bijv. synaptische blaasjes)

Lysosoom micro-omgeving (lage pH) gecreëerd door V-type ATPase --> lage pH activeert trans-Golgi netwerk afgeleide zure hydrolasen (inactief bij neutrale pH)

2) Autofagosomen
- Dubbele membraangebonden organellen gevormd rond ter ziele gegane organellen of in door voedingsstoffen uitgehongerde cellen

M6P-receptor wordt opgehaald -->>>>

1) Constitutief
- Vereist geen specifiek signaal --> Altijd voorkomend (lading of niet)
- Vervangt membraancomponenten die verloren zijn gegaan door endocytische processen

1) Fagocytose --> materialen groter dan 250 uM in grootte --> op clathrine gebaseerd

Cholesterol is verpakt als LDL-deeltjes wanneer het in het bloed wordt vervoerd

2) Transcytose (signaal vereist)
- Voer het recycling-endosoom in --> Overgebracht naar de andere kant van de cel

Dit zijn in wezen blaasjes die zich vormen in endosomen --> de transmembraankatalytische activiteit van receptoren in quarantaine en toegang geeft tot cytosolische katalytische gebieden die anders niet in het lumen zouden zijn

2) Ophalen van oppervlaktemembraan (endocytische route)
- Betreft opname van macromoleculen --> voor biosynthese en recycling van membraancomponenten

Vanwege de grote hoeveelheid blaasjes --> Minder dicht

Bijvoorbeeld sex1-cellen accumuleren blaasjes, sec 22 hebben ER gezwollen, hoe zien sec1/sec22 dubbele mutanten eruit

Als dubbele mutant lijkt op sec1 --> accumulatie van blaasjes vindt eerst plaats

Als dubbele mutant lijkt op sec22 --> gezwollen ER treedt eerst op

Na splitsing --> Hydrolyse van GTP --> Moleculen dissociëren

Twee delen gebruikt in combinatorische herkenning:

1) BAR-domeinen - zijn gevoelig voor membraankromming --> hogere affiniteit voor sterk gekromde gebieden van het membraan

Binding van v-SNARE met t-SNARE dehydrateert polaire kopgroepen --> is exclusief water

SNARE's gekoppeld aan het membraan met lipide-ankers --> fusie wordt niet voltooid

Transmembraandomeinen van SNARE zijn belangrijk --> eiwitvorm kan de lipidesamenstelling en -pakking en de algehele membraankromming veranderen

Oliezuur --> kegelvormig --> stimuleert membraanfusie

1) Golflengte van het licht

Weinig verlichting --> kleine hoeveelheid deeltjes --> verduisterd door statistische fluctuaties

Weefsels moeten zijn:
1) vast --> verbindt alle eiwitten (formaldehyde) --> dringt door in de cel (opent gaten om kleurstof toe te laten)
2) Gedehydrateerd --> verlengt de houdbaarheid (alcohol)

Hematoxyline (blauw) --> bindt arginine/lysine --> Nucleï

grootte van celorganellen <0.5 um --> iets sterks nodig

Twee types:
1) Opgeladen paar apparaatcamera's (CCD's)
2) Aanvullende metaaloxide-halfgeleidersensoren (CMOS)

Bij microscopie wordt een fluorescerende marker aan het antilichaam bevestigd --> waardoor visualisatie/lokalisatie van dat doelantigeen mogelijk is

Visualisatie van de interne structuur vereist fixatie om het membraan doorlaatbaar te maken --> laat antilichaam toe in de cel

Gebruikt als een reportermolecuul
-->-gen kan aan een ander gen worden vastgemaakt (fusie-eiwit)
--> eiwit kan aan een antilichaam worden gehecht

Gebruikt computeralgoritmen om de optische diffractie van licht dat binnenkomt van zowel het focusvlak als de vlakken boven en onder de focus te verminderen (hoewel nog steeds beperkt door de diffractielimiet)

Een ander gaatje wordt voor de detector geplaatst (confocaal met het oplichtende gaatje) --> precies waar de stralen die door het monster worden uitgezonden, worden gefocust

Preactivatie- absorptiepiek in het bereik van 400 nm --> absorptie van deze golflengte activeert deze

Gebruikt Photoactivated (PA)-GFP

Gebruikt lasers om achtereenvolgens (bijv. bijna-ultraviolet licht) een schaarse subset van fluorescerende moleculen in te schakelen --> Afbeeldingen --> Bleaches subset --> activeert volgende subset

Werkt in vacuüm
Gebruikt magneten als "lens"

Stelt voor dat op een bepaald moment in de geschiedenis een prokaryoot een andere prokaryoot overspoelde (fagocytose)

Stelt voor dat de invaginatie van het buitenmembraan --> Nucleus

Een of meer nucleoli per eukaryote kern --> vertegenwoordigt hoge niveaus van rRNA-synthese die nodig zijn voor cellulaire groei

Resultaten in bloedarmoede door twee mogelijke mechanismen:
1) Activering van tumorsuppressorgen TP53 --> apoptose van erytroïde voorlopers --> anemie

Functie in structurele integriteit van de kern, organisatie van poriën en genregulatie (via porieregulatie)

Zeer compact en rijk aan histonmodificaties geassocieerd met repressie

De meest actieve DNA-sequenties bevinden zich in de buurt van de nucleaire porie

1) GFP-gelabelde Lac-repressor met een FKBP3-eiwit-attach
2) eGFP-lac-repressor-FKBP3-eiwit bindt aan --> Operator van het Lac-operon --> Operon onderdrukt --> geen genexpressie
3) Toevoeging van rapamycine maakt binding van FKBP3 --> aan het FRB-domein van mTOR mogelijk (dat transcriptionele activator VP16 bevat)
4) Heterodimerisatie van FKBP3 naar FRB --> maakt het mogelijk dat transcriptiefactor VP16 activiteit uitoefent op de Operon --> Operon wordt tot expressie gebracht --> genexpressie is AAN

Geen Rapamycine --> geen genexpressie --> GFP-gelabelde loci blijven in de periferie

Deze signalen worden vaak gevonden aan het N-uiteinde van de polypeptideketen --> veel daarvan worden verwijderd door signaalpeptidasen zodra het sorteerproces is voltooid

Elk bevat waterige passages --> laat kleine in water oplosbare moleculen diffunderen

Diffusiesnelheid wordt bepaald door de grootte van deze moleculen (kleiner zijn sneller)

Ze hebben allemaal een gemeenschappelijk kenmerk --> hebben FG (fenylalanine-glycine) herhalende eiwitten --> hydrofoob van aard


Betekenis van Ras-signalering bij kanker en strategieën voor de bestrijding ervan

Ras is een GTP-bindend eiwit en is het meest bestudeerde oncoproteïne. Om zijn biologische activiteit te bereiken, moet het een modificatie na de vertaling ondergaan. Ras fungeert als een typische moleculaire schakelaar. Het GTP-gebonden Ras kan verschillende stroomafwaartse effectorroutes activeren. Ras-signalering reguleert veel belangrijke fysiologische processen in een cel, zoals celcyclusprogressie, overleving, apoptose, enz. Verschillende onderzoeken hebben mutaties gevonden in Ras of zijn effectoren in verschillende soorten tumoren. Daarom kunnen Ras of zijn stroomafwaartse effectoren aantrekkelijke medicijndoelen zijn tegen verschillende soorten tumoren in kankertherapieën. Sommige therapeutische middelen tegen Ras-effectoren, zoals Raf, MEK1/2, PI3K, AKT enz., zijn erin geslaagd om fase I- en II-onderzoeken in te gaan. Dit gerichte medicijnontwerp zou op hoofdzakelijk vier manieren kunnen worden overwogen, zoals preventie van Ras-GTP-vorming, covalente vergrendeling van het GDP-gebonden Ras, remming van Ras-effector-interacties of verslechtering van post-translationele modificatie van Ras. In deze review vatten we de normale Ras-signalering samen, evenals de afwijkende signalering in tumoren en verschillende strategieën om Ras-signalering te remmen.

Trefwoorden

Ras-signalering, oncoproteïne, effectoren, apoptose

Artikel:

H-Ras, K-Ras en N-Ras zijn de belangrijkste leden van de Ras-superfamilie, die kleine moleculen GTP en GDP onderling uitwisselbaar binden en GTP kunnen hydrolyseren tot GDP. De Ras-superfamilie bestaat uit meer dan 150 eiwitten en deze kunnen worden ingedeeld in ten minste vijf subfamilies, namelijk: de Ras-, Rab-, Rho-, Ran- en Arf-families. 1 Ras-oncoproteïnen fungeren als typische moleculaire schakelaar door afwisselend te binden aan GTP- en GDP-molecuul en hebben intrinsieke GTPase-activiteit. Het blijft in een actieve toestand wanneer het gebonden is aan GTP en schakelt over naar een inactieve toestand door te binden aan GDP en regelt zo de expressie van de stroomafwaartse genen. Ras-signalering is een belangrijke intracellulaire signaalroute die een rol speelt bij cellulaire proliferatie en differentiatie, overleving en genexpressie. 2-4 Ras-oncoproteïne is ook betrokken bij de ontwikkeling van kanker door ofwel een verhoogde intensiteit ofwel een langdurig signaleringsmechanisme. 5 Dit kan gebeuren ofwel door een mutatie in het Ras-GTPase-domein, waardoor het constitutief inactief wordt (GDP-gebonden toestand), ofwel door een activerende mutatie in groeifactorreceptoren die stroomopwaarts van Ras werken, ofwel door afwijkende activering van RAS-effector. Vanwege het verhoogde niveau van Ras-signalering bij tumorgroei en -progressie, kunnen Ras-eiwitten en de stroomafwaartse effector-eiwitten ervan dienen als veelbelovende therapeutische doelen tegen kanker. In dit overzichtsartikel werpen we licht op normale Ras-signalering en de afwijkende signalering ervan in tumoren en stelden we verschillende strategieën voor de remming ervan voor.

Normale Ras-signaleringsroutes
De drie menselijke RAS-genen coderen voor vier eiwitten met een grootte van

21 kDa: H-Ras, N-Ras en de splitsingsvarianten K-Ras4A en K-Ras4B. Een nieuw gesynthetiseerd Ras-eiwit is een oplosbaar cytoplasmatisch eiwit, dat post-translatiemodificaties moet ondergaan om te associëren met een bepaald lipidemembraan. Deze modificaties vinden plaats in het carboxyl-terminale 'CAAX'-vak (dat de aminozuursequentie cysteïne-alifatisch-alifatisch-X-residu aanduidt). De eerste betrokken stap is de hechting van 15 koolstoffarnesyl aan het cysteïneresidu van de 'CAAX'-box.6 Vervolgens splitst een endopeptidase Rce1 drie terminale aminozuurresiduen af ​​en het resulterende geïsoprenyleerde cysteïneresidu wordt gemethyleerd door het isoprenylcysteïnecarboxylmethyltransferase (ICMT ) zoals weergegeven in figuur 1. 7 H-Ras en K-Ras ondergaan aanvullende palmitoyleringsmodificatie.8 Deze post-translationele modificaties zijn nodig voor binding aan lipidemembraan om hun biologische functies uit te voeren.

De driedimensionale structuren van Ras-eiwitten met gebonden GTP en GDP en hun mutante varianten werden in 1990 bepaald door middel van röntgenkristallografie. 9-11 Het Ras-eiwit bestaat uit een hydrofobe kern van zes β-platen en vijf α-helices die met elkaar verbonden zijn door een reeks van 10 lussen. Vijf van deze lussen bepalen de nucleotide-interacties met hoge affiniteit van Ras en reguleren de GTPase-activiteit. Het GTP-fosfaat wordt gestabiliseerd door interacties die tot stand komen met de residuen Lys16, Tyr32, Thr35, Gly60 en


Gln61 van lussen. Gln61 is een sleutelresidu dat de overgangstoestand van GTP-hydrolyse naar GDP stabiliseert, naast het deelnemen aan de oriëntatie van de nucleofiele aanval die nodig is voor deze reactie. Er is waargenomen dat oncogene mutaties van Gln61 de intrinsieke GTP-hydrolysesnelheid verlagen, waardoor het Ras-eiwit constitutief actief wordt. De structurele verschillen in BBP-gebonden Ras (inactieve toestand) en GTP-gebonden Ras (actieve toestand) liggen voornamelijk in zeer dynamische regio's genaamd Switch I (residuen 30-40) en Switch II (residuen 60-70), zoals weergegeven in Figuur 2, die nodig zijn voor de interactie van Ras met zowel stroomopwaartse als stroomafwaartse partners. De binding van GTP brengt verandering in de structurele conformatie van de zijketen van Switch I, via binnenwaartse heroriëntatie van de zijketen van Thr35, wat de interactie met het GTP-γ-fosfaat en het Mg2+-ion vergemakkelijkt. Evenzo induceert het γ-fosfaat significante veranderingen in de conformatie van Switch II door de interactie die het tot stand brengt met Gly60. 12

Naast de normale functie, zoals cellulaire proliferatie en differentiatie, overleving en genexpressie, zijn gain-of-function-mutaties van H-, N-, K-Ras gevonden in verschillende soorten menselijke kankers. 12,13 Bovendien is afwijkende Ras-signalering ook betrokken bij verschillende ontwikkelingsstoornissen, bekend als de cardio-facio-cutane ziekten (d.w.z. neurofibromatose-type I [NF-1], Costello-syndroom en Noonan-syndroom). 14

De normale biologische werking van RAS-eiwitten zoals eerder beschreven, vereist post-translationele modificatie, geleid door veel eerder beschreven belangrijke enzymen. Deze RAS-voorbewerkingsenzymen kunnen dienen als aantrekkelijke doelwitten voor geneesmiddelen. De activiteit van RAS wordt grotendeels bepaald door het type cofactoren dat het bindt. Wanneer het aan GTP is gebonden, is het actief en kan het stroomafwaartse doeleiwitten rekruteren, maar wanneer het GDP bindt, wordt het inactief gemaakt en kan het geen interactie aangaan met de stroomafwaartse effectoren. Deze associatie van RAS met GTP of GDP wordt gemedieerd door twee enzymen: guanine-nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEF's) en GTPase-activerende eiwitten (GAP's). GEFS's katalyseren de uitwisseling van BBP voor GTP, terwijl GAP's de snelheid van GTP-hydrolyse verhogen tot BBP plus fosfaat. 15

Het geactiveerde RAS-eiwit kan stroomafwaartse effectoren binden en activeren, die uiteindelijk geschikte signalen produceren, zoals celproliferatie, overleving en andere fysiologische functies door de activering van verschillende routes (zie figuur 3).

Een van de eerste zoogdiereffector van RAS, die goed is bestudeerd en gekarakteriseerd, is het eiwit serine/threoninekinase, is RAF. 16,17 Er zijn drie nauw verwante RAF-eiwitten, CRAF1, BRAF en ARAF, waarvan bekend is dat ze worden geactiveerd door RAS-gebonden GTP.18 Het geactiveerde RAF kan de stroomafwaartse doelen fosforyleren en activeren, zoals door mitogeen geactiveerde eiwitkinasen 1 en 2 (MEK1 en MEK2).19 MEK1 en MEK2 kunnen vervolgens door mitogeen geactiveerde proteïnekinasen (MAPK's) fosforyleren en activeren, zoals extracellulaire signaalgereguleerde kinasen 1 en 2 (ERK1 en ERK2). De substraten voor ERK1/2 omvatten zowel nucleaire als cytosolische eiwitten, waarvan transcriptiefactoren uitgebreid zijn bestudeerd. 20,21 ERK-fosforylaat (ELK1) behoort tot de transcriptiefactoren van de ETS-familie, die op hun beurt de expressie van FOS reguleren. 22 Daarnaast kan ERK ook c-JUN fosforyleren. 23 De activering van al deze transcriptiefactoren bevordert uiteindelijk de voortgang van de celcyclus. 24

Naast de RAF/MAPK-effectorroute kan RAS ook een interactie aangaan met andere goed gekarakteriseerde effectoren, namelijk fosfatidylinositol 3-kinasen (PI3K's). 25,26 Het geactiveerde PI3Ks fosforyleert fosfatidylinositol 4,5-bisphosphosphate (PtdIns(4,5)P2) produceert een second messenger fosfatidylinositol-3,4,5-trifosfaat (PtdIns(3,4,5)P3), dat een interactie aangaat met verschillende andere eiwitten door middel van pleckstrin-homologie en andere domeinen. 27 PI3K oefent dus zijn controle uit op een groot aantal stroomafwaartse doeleiwitten. PI3K reguleert de activiteit van twee belangrijke kinasen PDK1 (3-fosfoinositide-afhankelijke eiwitkinase-1) en AKT. 28,29 PDK1 is belangrijk voor de activering van veel eiwitkinasen van de AGC-familie, waaronder AKT/PKB, p70S6K, sommige PKC's en RSK's. 30-33 AKT heeft een anti-apoptotische functie en is belangrijk gebleken voor overlevingssignalen die door RAS worden gegenereerd. 34,35 Bovendien leidt PI3K-activering ook tot de activering van RAC, een RHO-familie-eiwit dat niet alleen het actine-cytoskelet reguleert, maar ook transcriptiefactoren, zoals nucleaire factor-kappa B (NF-KB). 36-38 RAC-activering lijkt ook belangrijk te zijn bij door RAS geïnduceerde transformatie. 39,40

De derde bekende effector van RAS omvat drie uitwisselingsfactoren voor RAS-gerelateerde RAL-eiwitten: RAL guanine-nucleotide-dissociatiestimulator (RALGDS), RGL2/RLF, RALGDS-achtig gen (RGL/RSB2). 41–43 Met behulp van deze eiwitten kan RAS RAL activeren, dat op zijn beurt fosfolipase D1, CDC42/RAC-GAP-RAL bindend eiwit1 (RALBP1) activeert. 44,45 Deze RALGDS-route draagt ​​samen met AKT bij aan de remming van FORKHEAD-transcriptiefactoren. Deze zijn betrokken geweest bij het stoppen van de voortgang van de celcyclus door activering van cycline-afhankelijke kinaseremmer, KIPI (ook bekend als p27), en apoptose door expressie van de BIM- en FAS-liganden. 47,48

Fosfolipase Cε is een andere effector van Ras. 49 Het hydrolyse van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaten tot diacylglycerol en inositol-1,4,5-trifosfaat, wat leidt tot activering van PKC en calciummobilisatie. 50

Door de gezamenlijke inspanningen van RAS en zijn effectoren is het in staat een breed scala aan functies te reguleren, zoals cellulaire proliferatie, overleving, apoptose en andere belangrijke fysiologische processen.

Abnormale RAS-signalering bij tumoren
Mutatie activeren in RAS

De afwijkende RAS-signalering in tumoren kan worden veroorzaakt door verschillende mutaties, meestal activerende mutatie in tumorcellen: 85% in K-RAS, 15% in N-RAS en 10%) werd gevonden in tumoren, zoals colon (adenocarcinoom) , leukemieën (AML), lymfomen (Hodgkin-lymfoom), long (grootcellig carcinoom en niet-kleincellig carcinoom) en schildklier (anaplastisch en folliculair carcinoom). Uit tabel 1 blijkt ook dat de oncogene mutatie voornamelijk de K-Ras-locus aantast, waarbij oncogene K-Ras-mutaties worden gedetecteerd variërend van 16 tot 36% in verschillende gescreende humane tumoren. De activerende mutaties beïnvloeden meestal de GTPase-activiteit van RAS, wat leidt tot accumulatie van RAS-gebonden GTP. 51,52 Deze GTP-gebonden RAS kunnen andere stroomafwaartse effector-eiwitten hyperactiveren die eerder zijn besproken voordat dit leidt tot constitutieve abnormale signalering en anarchie in de tumorcel. Het verminderde vermogen van Ras-mutanten om GTP te hydrolyseren, hetzij intrinsiek, hetzij als reactie op GAP's, is verantwoordelijk voor de oncogene aard van mutaties op residuen G12, G13 en Q61 in de actieve plaats. 53

Ras blijft geactiveerd door verlies van GAP-versnelde GTP-hydrolyse. Een typisch voorbeeld van een GAP-mutatie zijn de GAP's, neurofibromine die wordt gecodeerd door het NF1-tumorsuppressorgen. 54 Patiënten met neurofibromatose type I erven slechts één functioneel NF1-gen en worden vervolgens vatbaar voor kanker door volledig verlies van NF1.

Activering van groeifactorreceptoren
Het is ook bekend dat Ras-signalering wordt geactiveerd in tumoren waarin groeifactorreceptortyrosinekinase tot overexpressie is gebracht. Het meest voorkomende voorbeeld zijn epidermale groeifactorreceptor (EGFR) en receptortyrosine-eiwitkinase erbB-2 (ERBB2) die worden geactiveerd en tot overexpressie worden gebracht in vele soorten kanker, waaronder borst-, eierstok- en maagcarcinomen. 55

Mutatie of amplificatie van Ras-effectoren Er is gevonden dat BRAF gewoonlijk wordt geactiveerd door mutatie in menselijke tumoren, zoals melanomen en coloncarcinoom. Een studie van 923 kankermonsters onthult dat missense-mutaties vaak voorkomen in de BRAF


gen in ongeveer 70% van de menselijke maligne melanoom en 15% van de colorectale kankers. 56 De belangrijkste mutatie die in tumoren wordt gevonden, is V559E, een substitutie van valine door glutaminezuur, dat optreedt in het kinase-activeringsdomein, resulterend in activatie van BRAF. 56

Van de PI3K-route is bekend dat deze wordt geactiveerd door amplificatie of mutatie van PIK3CA coderende katalytische p110α-subeenheid van PI3K in ovarium- en cervicale tumoren. 57,58 Deze mutaties komen vaak voor in twee geconserveerde gebieden van het gen, die coderen voor de kinase en helix

domeinen van het eiwit. Deze 'hot spot'-mutaties, H1047R, E545K en E542K, zijn niet-synonieme missense-mutaties die constitutieve kinase-activiteit verlenen. 59,60 Tweede mechanisme van PI3K-activering vindt plaats door amplicatie van zijn stroomafwaartse doelwit AKT2 in ovarium- en borsttumoren. 61 Een somatische missense mutatie in het pleckstrin homologie (PH) domein van AKT1 (E17K) was geïdentificeerd in borst-, colorectale en eierstokkanker. 62 Bovendien kan PI3K direct worden geactiveerd door verlies van tumorsuppressorgen PTEN (fosfatase- en tensine-homoloog verwijderd op chromosoom tien). Dit gen codeert voor een lipidefosfolipase dat fosfatidyl-3,4,5-trifosfaat defosforyleert op positie 3 van de inositolring, wat de accumulatie van deze tweede boodschappers veroorzaakt door PI3K omkeert en dus de PI3K-activiteit negatief reguleert. PTEN is een van de meest gemuteerde genen in menselijke kankers. 63,64

Ras-remmingsstrategieën

De betrokkenheid van afwijkende Ras-signalering bij verschillende soorten tumoren bij mensen vereist de ontwikkeling van therapeutische middelen, die een normale functie in tumorcellen kunnen herstellen. De ontwikkelingen van therapieën ertegen zijn al begonnen en sommige zijn er met succes in geslaagd om fase I-II klinische proeven in te gaan (zie tabel 2). Het richten op de afwijkende Ras-signalering is grotendeels afkomstig van indirecte remming van Ras-effectoren, zoals AKT, MEK-1/2, PI3K, Raf, enz. Deze remmingsstrategieën voor Ras-signalering kunnen worden onderverdeeld in de volgende vier remmingsstrategieën (Figuur 4) elk wordt hieronder kort besproken.

Preventie van Ras-GTP-vorming
Vroege studies onderzochten de potentie van ATP-competitieve kinaseremmers, waarvan verwacht werd dat ze zouden worden gebruikt voor het remmen van nucleotidebinding aan Ras. Hoewel de affiniteit van kinasen voor ATP gewoonlijk in het micromolaire bereik ligt, bemoeilijken 65 picomolaire nucleotide-affiniteiten van Ras in combinatie met millimolaire intracellulaire nucleotidepools het gebruik van GTP-competitieve remmers. 66 Bijgevolg werden strategieën onderzocht die de initiële vorming van het Ras-GTP-complex voorkomen.

Bibliotheken van GTP-analogen met afwisselingen aan de ribose- of nucleotide-eenheid 66 en van pyrazolo[3,4-b]chinoline-ribosides 67 leverden moleculen op met een matig verhoogde affiniteit in vergelijking met GDP en een relatief zwakke remmende potentie.

Covalente vergrendeling van de BBP-gebonden staat

Vanwege de hoge affiniteit van Ras voor GDP, vereist nucleotide-uitwisseling hulp van GEF-eiwitten zoals Son of Sevenless (SOS) of het nauw verwante RasGRF1 om het laden van GTP te vergemakkelijken. Vroege voorbeelden van GEF-remmers werden geïdentificeerd uit een verbindingsbibliotheek waarvan de leden oorspronkelijk waren ontworpen om te concurreren met GDP voor nucleotidebinding. SCH53239 en zijn derivaten richten zich op een hydrofobe pocket dichtbij de nucleotidebindingsplaats en remmen de intrinsieke nucleotide-uitwisseling. 68,69 Op basis van deze studies werd een reeks derivaten ontworpen met verbeterde potentie en oplosbaarheid in water die in staat zijn om de RasGRF1-gekatalyseerde nucleotide-uitwisseling in vitro te remmen (halve maximum in remmende concentratie [IC50] = 35-320 μM ). 70,71 De hierboven beschreven orthostere Ras-GEF-interactieremmers maken geen onderscheid tussen gemuteerd en wildtype Ras. In een benadering om deze beperking voor gemuteerd K-RasG12C te overwinnen, werd de thiolfunctie van cysteïne 12 gebruikt om remmers covalent te vangen. Een set van van GDP afgeleide remmers werd ontwikkeld om de nucleotidebindingsplaats direct te targeten. 72 De meest actieve verbinding, SML-8-73-1, bindt covalent aan K-RasG12C, zelfs in de aanwezigheid van millimolaire concentraties GDP en GTP. SML-10-70-1 vertoont antiproliferatieve activiteit in Ras-afhankelijke cellen die K-RasG12C tot expressie brengen (EC50 = 27−47 M). 73

Ostrem et al. 74 rapporteerden covalente remmers die selectief zijn voor mutant cysteïne ten opzichte van het wildtype, omdat het afhankelijk is van het vangen van de thiolgroep in Cys12 in de gemeenschappelijke oncogene mutant (K-Ras G12C) met behulp van een op disulfide-l-fragment gebaseerde screeningbenadering. Binding van deze remmers aan K-Ras (G12C) destabiliseert de natieve nucleotidevoorkeur om GDP boven GTP te bevoordelen en belemmert binding aan Raf.

Remming van Ras-effector-interacties
Eiwit-eiwitinterfaces (PPI's) tussen Ras-GTP en effectoren initiëren verschillende stroomafwaartse signaalcascades. Opmerkelijk is dat Ras-GTP in ten minste twee verschillende conformationele toestanden bestaat, die onderling worden omgezet met snelheidsconstanten op de milliseconde tijdschaal. 75 Terwijl toestand 2 een conformatie vertegenwoordigt met hoge affiniteit voor effectorbinding, zijn de affiniteiten voor effectoren die in toestand 1 worden vertoond verminderd. 76,77 Staat 1 vertoont echter oppervlakteholten die mogelijk toegankelijk zijn voor kleine moleculen die deze conformatie zouden kunnen stabiliseren en daardoor interacties met effectoreiwitten kunnen remmen. Zn2+-cyclen-, Cu2+-cyclen- en bis(2-picolyl)aminecomplexen binden H-Ras–'GTP' met millimolair affiniteit en stabiliseren de 'niet-effectorbinding'-toestand 1. 78,79 De haalbaarheid van remming van orthosterische Ras-effectorinteractie werd aangetoond met antilichaamfragmenten die effectorinteractieplaatsen van H-Ras-GTP blokkeren. 80 In deze opstelling is verstoring van mutante Ras-effector-interacties voldoende om tumorinitiatie in een transgeen muismodel van longkanker te voorkomen.81 Kleine op peptiden gebaseerde remmers zonder medicijnachtige eigenschappen zijn gebruikt om Raseffector-interacties te verstoren. 82,83

Aantasting van post-translationele modificatie van Ras
Ras-afhankelijke signalering vereist de juiste intracellulaire lokalisatie van Ras-eiwitten, voornamelijk op het plasmamembraan, gemedieerd door membraanverankerende lipideresiduen aan het C-uiteinde. Daarom is onderzocht of verslechtering van de Ras-lokalisatie de oncogene Ras-signalering remt. 84 Ras-eiwitten zijn uitgerust met lipidegroepen door een reeks post-translationele modificaties, waaronder cysteïne S-farnesylering, proteolyse en carboxymethylering aan het C-uiteinde van alle Ras-isovormen en extra cysteïne S-palmitoylering van H-Ras en N-Ras . 85

FarnesyltransfeRase-remmers (FTI's) onderbreken deze biosynthetische sequentie, wat leidt tot niet-gelipideerd cytosolisch Ras. Verschillende FTI's bereikten klinische onderzoeken in een laat stadium, maar faalden uiteindelijk, voornamelijk vanwege alternatieve geranylgeranylering van de K-Ras- en N-Ras-isovormen. 86 Behandeling met

geranylgeranyltransferaseremmers 87 of dubbele prenyleringsremmers 88 vertoonden geen klinische werkzaamheid. Een aantal studies rapporteert echter veelbelovende preklinische en klinische resultaten voor FTI's als enkelvoudige middelen of in combinatie met andere conventionele middelen tegen kanker. 89 FTI's kunnen ook positieve klinische reacties vertonen bij de behandeling van H-Ras-afhankelijke kankers en tumoren die afhankelijk zijn van andere gefarnesyleerde eiwitten om te overleven. 87

Conclusie
Ras-signaleringsroutes vormen centrale aanjagers van de ontwikkeling van kanker en daarom is er gezocht naar strategieën voor de ontwikkeling van krachtige Ras-remmers die ook in vivo effectief zijn. Sommige remmers tegen Ras-effectoren zoals Raf, MEK1/2, PI3K, AKT, enz. zijn al in klinische onderzoeken getreden, wat de relevantie van Ras-signaleringsroutes in kankertherapieën suggereert. Aangezien de Ras-signaleringsroute een complex netwerk is dat wordt bestuurd door verschillende feedbacklussen, is het blokkeren van een enkele route mogelijk niet voldoende om een ​​reductie van de Ras-signalering tot een therapeutisch significant niveau te bereiken. Daarom kunnen gelijktijdige gecombineerde therapieën die gericht zijn op Ras en andere oncoproteïnen nodig zijn om tumoren onder controle te houden.

Artikelinformatie:
Openbaring

Arun Bahadur Gurung, MSc, en Atanu Bhattacharjee, PhD, hebben niets te melden met betrekking tot dit artikel. Bij de publicatie van dit artikel is geen financiering ontvangen.


Materialen en methodes

Materialen

Anti-SRP54 was een geschenk van B. Dobberstein (ZMBH, Heidelberg, Duitsland), terwijl anti-Hsp40- en anti-Hsp70-antilichamen van Stressgen waren. Canine SRP werd bereid met behulp van gevestigde protocollen (Walter en Blobel, 1983b), maar waarbij lage concentraties van het detergens Nikkol in eventuele buffers werden weggelaten. Pancreasmicrosomen van honden (Walter en Blobel, 1983a) waren ontdaan van endogeen SRP (aanvullend materiaal Fig. S1A) door te wassen in buffer met hoog zoutgehalte (Walter en Blobel, 1983b). Hsc70 werd gezuiverd uit runderhersenen door chromatografie op DEAE-cellulose, ATP-agarose en hydroxyapatiet (aanvullend materiaal Fig. S2). Recombinant menselijk Hsp40 en Hsp90 werden verkregen van Stressgen. Het C-terminale domein van humaan Bag-1M [C-BAG, residuen 151-264) in de vector pPROEXHTa (Invitrogen)] werd tot expressie gebracht in BL21(DE3) E coli en gezuiverd door Ni-Sepharose en Mono Q-chromatografie (aanvullend materiaal Fig. S2) zoals eerder beschreven (Sondermann et al., 2001).

Transcriptie

cDNA's die coderen voor humaan Sec61β en rattensynaptobrevin 2 werden gekloneerd in pSPUTK (Abell et al., 2004) en transcriptietemplates die een C-terminaal glycosyleringslabel bevatten of het hydrofobe staartankergebied vervangen, werden bereid door PCR met behulp van geschikte reverse primers (zie aanvullende materiaal Tabel S1). Sec61βOPG werd gecreëerd in pCDNA5 (Invitrogen) door mutagenese en de transcriptiesjabloon verkregen door PCR uit het resulterende construct (aanvullend materiaal Tabel S1). In alle gevallen misten de mRNA's een stopcodon waardoor de resulterende polypeptiden na synthese geassocieerd bleven met het ribosoom (zie Fig. 1A voor eiwitsequenties). Transcripten werden gesynthetiseerd met behulp van SP6- of T7-RNA-polymerase, volgens de instructies van de fabrikant (respectievelijk New England Biolabs of Promega).

Translatie en membraaninsertie

Eiwitten werden gesynthetiseerd met behulp van konijnenreticulocytlysaat met incubaties bij 30°C in aanwezigheid van [35S]-methionine, volgens de instructies van de fabrikant (Promega). Puromycine werd gebruikt bij 1 mM met daaropvolgende incubatie gedurende 5 minuten bij 30°C om efficiënte afgifte van de vastgelopen peptidyl-tRNA's uit het ribosoom teweeg te brengen (Abell et al., 2004). SRP-verarmde microsomen (K-RM) werden toegevoegd tot een eindconcentratie van 1,5-2,0 OD280 per ml, en werden geanalyseerd op TA-eiwitinsertie op basis van relatieve N-glycosyleringsefficiëntie na terugwinning door centrifugatie door 100 l HSC (500 mM sucrose, 500 mM KOAc, 5 mM Mg(OAc)2, 50 mM Hepes-KOH pH 7,9) bij 100.000 G voor 10 minuten of 132.000 G Voor 5 minuten. Waar aangegeven werd de resulterende membraanpellet opnieuw gesuspendeerd in 100 μl koude 0,1 M Na2CO3, gedurende 10 minuten op ijs geïncubeerd en teruggewonnen door centrifugatie bij 132.000 G gedurende 5 minuten om de membraanintegratie te bevestigen. Deglycosylering werd uitgevoerd met endoglycosidase H (EndoH) volgens de instructies van de fabrikant (New England Biolabs).

Nucleotide uitputting

Reticulocytenlysaat werd ontdaan van nucleotiden door 70 μl op een Biospin 6-kolom (Bio-Rad) te laden die was geëquilibreerd met LSC-buffer (100 mM sucrose, 100 mM KOAc, 5 mM Mg(OAc)2, 50 mM Hepes-KOH pH 7,9, 1 mM DTT), volgens de instructies van de fabrikant, waarbij het proces eenmaal wordt herhaald. Een parallelle depletie met behulp van een translatie van Syb2 toonde een herstelpercentage van 49% en een dubbel volume verarmd lysaat werd gebruikt voor vergelijkende experimenten met niet-verarmd lysaat.

Crosslinking en immunoprecipitatie

Na behandeling met puromycine werden de translatieproducten 5 minuten bij 30°C behandeld met 1 g apyrase per 40 l volume, vervolgens 5 minuten op ijs geïncubeerd gevolgd door 5 minuten incubatie bij 30°C met ofwel 1 mM disuccinimidylsuberaat (DSS Pierce), 1 mM succinimidyl trans-4-(maleimidylmethyl)cyclohexaan-1-carboxylaat (SMCC Pierce) of bismaleimidohexaan (BMH Pierce) verdund uit een 20 mM voorraad in DMSO. Verknoping werd gestopt met 50 mM glycine (DSS), 10 mM 2-mercapto-ethanol (BMH) of beide (SMCC). Monsters werden gedenatureerd met SDS, tenzij anders vermeld, werden specifieke adducten gewonnen door middel van immunoprecipitatie (Abell et al., 2003).

Reconstitutie van ER-integratie

Ribosoom-ontluikende-ketencomplexen (RNC's) werden gegenereerd door transcripties zonder stopcodon gedurende 7 minuten te vertalen. Reacties van 200 l werden aangevuld met 2,5 mM cycloheximide en 500 mM KOAc, en het uiteindelijke monster van 240 l werd gelaagd over 400 μl HSCC (HSC met 2,5 mM cycloheximide en 1 mM DTT), gevolgd door centrifugatie bij 213.000 G gedurende 20 minuten. De pellet werd opnieuw gesuspendeerd in 50 l HSCC met gereduceerde sucrose (100 mM), gelaagd op 150 μl HSCC en gecentrifugeerd bij 213.000 G gedurende 20 minuten. De pellet werd uiteindelijk opnieuw gesuspendeerd in 40 l LSC. Membraan-insertiereacties omvatten 2 l geïsoleerde RNC's, aangevuld tot een eindvolume van 10 l door LSC en verschillende toevoegingen. Hsp40 werd toegevoegd bij 3 M, Hsc70 werd toegevoegd bij 1.7 M, Hsp90 werd toegevoegd bij 1.3 M, TRiC (geschenk van Judith Frydman, James Clark Center, Stanford University, CA) werd toegevoegd bij 0.6 M, SRP werd toegevoegd bij -12.5 nM , voorgesponnen reticulocytlysaat werd toegevoegd met 20% v/v en verarmd lysaat werd toegevoegd met 40% v/v. ATP of GTP werd toegevoegd bij 1 mM. Na de toevoeging van alle cytosolische richtfactoren en behandelingen, werd puromycine toegevoegd bij 1 mM en het monster werd gedurende 5 minuten bij 30°C geïncubeerd. Membraan-insertie werd bereikt door incubatie met K-RM's (eindconcentratie van 1,5-2,0 OD280 per ml) bij 30°C.

Gelelektroforese

Monsters werden gedurende 10 minuten tot 70°C verwarmd in SDS-PAGE-monsterbuffer en vervolgens gescheiden op 16% polyacrylamide Tris-glycinegels onder denaturerende omstandigheden. Gels werden gefixeerd, gedroogd en vervolgens blootgesteld aan fosforafbeeldingsplaten, die werden afgelezen met behulp van een Fuji BAS-3000 fosforimager. Radioactief gemerkte producten gescheiden door SDS-PAGE werden gekwantificeerd met behulp van Aida-software.


Biologische schakelaars en de tweede wet van de thermodynamica

Je zou kunnen stellen dat het concept van een enkelvoudige AAN- of UIT-toestand in een moleculaire schakelaar de tweede wet van de thermodynamica zou kunnen schenden. De tweede wet vereist dat biochemische systemen van de ene toestand naar de andere gaan door een reeks microscopisch omkeerbare stappen. Dit idee is gebaseerd op statistische mechanica omdat het wordt toegepast op een systeem in evenwicht, dat a priori moet worden toegepast op door enzymen gekatalyseerde biologische processen. Het is gemakkelijk om de oorsprong van het principe van microscopische omkeerbaarheid te visualiseren door de gevolgen te overwegen als het NIET waar zou zijn. Als bijvoorbeeld de snelheid van A → B groter zou zijn dan B → A bij evenwicht, zou elk van de snelheden B → C, C → D en D → A ook groter moeten zijn dan hun omgekeerde snelheden om ophoping van de concentratie van welke soort dan ook, die bij evenwicht niet is toegestaan. In dit geval zou er een voorkeursrichting van de reactiecyclus zijn. Zo'n spontane cyclus in een systeem in evenwicht (d.w.z. een motor die spontaan werk produceert) is niet consistent met de drang naar maximale entropie die in de Tweede Wet is vervat.

Er is geen overtreding van de Tweede Wet als de overgang van een UIT naar AAN-toestand (of vice versa) omkeerbaar plaatsvindt. De moleculaire basis voor dit type microscopische omkeerbaarheid kan worden gevisualiseerd voor de hMSH2-hMSH6- en G-eiwitschakelaars als omkeerbare nucleotidebinding en als intermediaire eiwitconformatieveranderingen die optreden tijdens het passeren van de extreme toestanden. Het zijn deze conformationele overgangen die de interactie met effectoren bepalen, die uiteindelijk wordt betaald door de hydrolyse van NTP. Belangrijker is dat men het evenwicht van elke toestand experimenteel kan beïnvloeden door de verhouding van NDP/NTP te veranderen in de afwezigheid van enige hydrolyse (zie Fig. 6 in Gradia et al. 1997). Het is ook belangrijk op te merken dat microscopische omkeerbaarheid direct is aangetoond voor de gated maxi K + ionenpomp, een moleculaire schakelaar die wordt bestuurd door vergelijkbare conformationele overgangen (Song en Magleby 1994). Moleculaire schakelaars zijn dus zowel omkeerbaar als, bij evenwicht, duidelijk een fundamentele huurder van thermodynamica behouden.


Rol van RNA bij eiwitsynthese | Microbiologie

De bewerkte RNA-moleculen nemen met behulp van ribosomen deel aan de eiwitsynthese.

Alle drie soorten RNA's zijn betrokken bij de eiwitsynthese in de volgende hoofdstappen:

(i) Activering van aminozuren,

(ii) Overdracht van aminozuur naar tRNA,

(iii) Initiatie van eiwitsynthese,

(iv) Verlenging van de polypeptideketen.

Tijdens het translatieproces wordt de genetische informatie gecodeerd in mRNA-transcripten in de vorm van codons die op hun beurt specifiek worden gelezen door anticodon van tRNA en worden gebruikt om een ​​polypeptidemolecuul met een gedefinieerde functie te vormen.

1. Opladen van tRNA:

(i) Activering van aminozuren:

Bij de eiwitsynthese nemen alleen L-aminozuren deel. De D-aminozuren worden gescreend op alle 20 aminozuren. Bovendien zijn de andere aminozuren die niet worden gebruikt bij de eiwitsynthese citrulline, alanine, β-alanine, enz. Elk aminozuur heeft een specifiek aminoacyl-tRNA-synthetase (opladend enzym) en een specifiek tRNA. Er zijn ten minste 32 tRNA's nodig om alle aminozuurcodons te herkennen, maar sommige cellen gebruikten er meer dan 32.

Dit kan echter meer dan één soort tRNA zijn voor een specifiek aminozuur, maar er is slechts één opladend enzym voor elk aminozuur. De carboxylgroep activeert de aminozuren door te worden gekatalyseerd door zijn eigen specifieke activerende enzym (aminoacyl-tRNA-synthetase) in aanwezigheid van ATP. Dientengevolge wordt een aminoacyl-AMP-synthetasecomplex gevormd dat in gebonden vorm blijft met het activerende enzym.

(ii) Overdracht van aminozuur naar tRNA:

Het proces van overdracht van geactiveerde aminozuren naar tRNA wordt opladen van tRNA genoemd. De tRNA's zijn specifiek voor hun specifieke aminozuur. Daarom worden tRNA's genoemd volgens een specifiek aminozuur zoals tRNA ala (voor alanine), tRNA val (voor valine), enz. Daarom wordt het geactiveerde aminozuur overgebracht naar zijn specifieke tRNA.

Het aminoacyl-AMP-synthetasecomplex gevormd zoals hierboven wordt overgebracht naar tRNA zoals hieronder:

Aminoacyl-AMP-synthetasecomplex + tRNA → Aminoacyl-'8211-tRNA + AMP + aminoacyl-tRNA-synthetase De structuur van aminoacyl-tRNA wordt gegeven in Fig. 10.14. Het aminoacyl-AMP-synthetase reageert met specifiek tRNA en vormt een aminoacyl-tRNA-complex door het enzym aminoacyl-tRNA-synthetase vrij te geven.

Dit toont aan dat het enzym tRNA-synthetase twee specifieke plaatsen heeft. De ene plaats herkent de specifieke aminozuren en de andere plaats herkent het specifieke tRNA-molecuul. Het tRNA-synthetase brengt dus het specifieke aminozuur en het tRNA-molecuul samen.

Deze herkenningseigenschappen zijn echter essentieel om ervoor te zorgen dat het specifieke aminozuur op het juiste tRNA-molecuul wordt geladen. Op dezelfde manier bestaat het tRNA-molecuul ook uit twee specifieke plaatsen, één plaats voor het herkennen van zijn specifieke aminoacyl-tRNA-synthetase en de tweede (het anticodon) voor codon aanwezig op het mRNA-molecuul.

Voor de opname van een aminozuur op de juiste positie in de polypeptideketen is herkenning van codon op mRNA door het specifieke anticodon op tRNA vereist.

2. Initiatie van polypeptidesynthese:

Er zijn verschillende specifieke en complexe processen (Fig. 10.15) die betrokken zijn bij de initiatie en voortzetting van de verlenging van de polypeptidesequentie. De essentiële componenten die nodig zijn voor initiatie zijn: initiatiefactoren, ribosoom, mRNA, guanosinetrifosfaat (GTP) en aminoacyl-tRNase.

Fig. 10.15: Initiatie van translatie.

(i) Initiatiefactoren:

Er zijn bepaalde initiatiefactoren (IF) die nodig zijn voor de initiatie van eiwitsynthese. In prokaryoten zijn drie IF (dwz IF-1. 9.000 MW IF-2, 1.15.000 MW en IF-3.22.000 MW) betrokken bij het initiatieproces, terwijl in eukaryoten geen IF equivalent aan IF-1 en IF-2 zijn gevonden.

IF-2 is echter functioneel equivalent aan eukaryote eIF-2 en elF-2'8242 en IF-3 is equivalent aan eukaryote eIF-3. De IF-1, IF-2 en IF-3 zijn aanwezig in de 30S-subeenheid van het ribosoom. IF-1 en IF-2 helpen bij de binding van initiatie-tRNA (tRNA met) aan de 30S-ribosoomsubeenheid.

(ii) Formylering van methionine:

Methionine is het uitgangs-N-terminale aminozuur in eukaryoten, terwijl in prokaryoten methionine bestaat uit een formylgroep (-CHO). Daarom wordt een formylgroep die methionine bevat, N-formylmethionine genoemd. Zowel bij prokaryoten als bij eukaryoten vindt de initiatie van eiwitsynthese plaats via een specifiek methionyl-tRNA dat algemeen bekend staat als initiatie-tRNA (d.w.z. tRNA met).

Binding van initiatie-tRNA met methionine/formylmethionine vindt als volgt plaats:

Methionine + tRNA → Methionine – tRNA (met – tRNA)

Formyltetrahydrofolaat + NH2-methionyl-tRNA Transformylase → N-formyl-methionyl-tRNA (N-fmet-tRNA)

(iii) Vorming van 30S-initiatiecomplex:

De eerste stap bij het initiëren van eiwitsynthese is de vorming van een 30S-initiatiecomplex. Dit complex bestaat uit een mRNA, 30S ribosomale subeenheid, GTP, IF (1, 2 en 3) en het initiator-tRNA, d.w.z. N-fmet-RNA.

De vorming van 30S-initiator vindt plaats in de volgende stappen (de daadwerkelijke volgorde van deze stappen is niet bekend):

(a) De initiatiefactoren (IF-1, IF-2 en IF-3) binden aan 30S ribosomale subeenheid in aanwezigheid van GTP om 30S-IF-complex te vormen (Fig. 10.15A). Wanneer het mRNA echter afwezig is, vormen IF-1 en IF-3 geen complex, noch met de 30S-subeenheid noch met de 50S-subeenheid.

(b) De tweede stap omvat de associatie van mRNA en initiator-tRNA aan de 30S-subeenheid. De daadwerkelijke volgorde van deze stappen varieert echter. De IF-3 kan zowel aan de 30S-subeenheid als aan mRNA binden. Het 30S-IF-complex bindt aan mRNA op de plaats die het startcodon bevat (in de volgorde van pB-referentie AUG, GUG, UUG, CUG, AUA of AUU). Elk mRNA in zijn niet-translationele gebied bestaat uit een ribosoombindingsplaats voor elk polypeptide in de vorm van een polycistronische boodschap.

Deze ribosoombindingsplaats (d.w.z. 5'8242-AGGAGGU-3'8242) staat bekend als de Shine-Dalgarno-sequentie die belangrijk is bij de binding van mRNA aan het 30S-IF-complex (Fig. 10.15B). De Shine-Dalgarno-sequentie basenparen met een gebied dat aanwezig is op het 3'8242-uiteinde van 16S-rRNA. Deze koppeling zal resulteren in een juiste positie van het initiërende AUG-codon, zodat het kan worden gecombineerd met een initiator-anticodon op tRNA.

(c) De IF-2 die is gecombineerd met GTP, maakt het mogelijk dat het initiator-tRNA (d.w.z. N-fmet-tRNA) bindt aan de 30S-ribosomale subeenheid (Fig. 10.15C). Vervolgens kunnen de 30S- en 508-subeenheden worden gekoppeld. Deze binding wordt gevolgd door verwijdering van IF-3 uit het 30S-IF-complex.

Verwijdering van IF-3 is noodzakelijk omdat de aanwezigheid ervan de associatie van twee ribosomale subeenheden remt. In dit stadium bestaat het initiatiecomplex uit mRNA dat is geassocieerd met de 30S-ribosomale subeenheden, IF-1, IF-2-GTP en fmet-tRNA.

(iv) Vorming van het complete initiatiecomplex:

De laatste stap in prokaryoten is de vereniging van het 30S-initiatiecomplex met 50S-ribosomale subeenheden en de vorming van een compleet 708-initiatiecomplex (Fig. 10.15D). Dit proces van vereniging veroorzaakt de onmiddellijke hydrolyse van het gebonden GTP tot GDP + Pi.

Het proces van vereniging wordt bewerkstelligd in aanwezigheid van een analoog van GTP (d.w.z. 5’guanylmethyleendifosfaat). Daarom is hydrolyse van GTP en daaropvolgende verwijdering van GDP essentieel voor de IF-1-afhankelijke afgifte van IF-2 uit het ribosoom (Fig. 10.15 E). Evenzo is bij eukaryoten het 40S-initiatiecomplex bevestigd aan de 60S-ribosomale subeenheid en vormt het het volledige 80S-initiatiecomplex.

Het ribosoom heeft drie belangrijke bindingsplaatsen, twee zijn belangrijk bij de eiwitsynthese. De twee bindingsplaatsen zijn: de aminoacyl-tRNA-bindingsplaats (A), de peptide (P)-bindingsplaats en de E-plaats (Fig. 10.15E).

De A-plaats ontvangt al het binnenkomende geladen tRNA, terwijl de P-plaats het vorige tRNA bezit waaraan het nieuwe polypeptide (peptidyl-tRNA) is bevestigd. Het fmet-tRNA (initiatie-tRNA) bindt direct aan de P-site, maar niet aan de A-site. Functie van de E-site is de-acylering.

3. Verlenging van de polypeptideketen:

Zoals getoond in Fig. 10.15 E, bezit het 70S-ribosoom aan het einde van de initiatiesequentie het fmet-tRNA in de P-plaats, terwijl de A-plaats vrij is om het volgende aminoacyl-tRNA te ontvangen volgens de codons op mRNA. De toevoeging van aminozuren aan de groeiende polypeptideketen volgens codon op mRNA wordt ketenverlenging genoemd.

De snelheid van toevoeging van aminozuur aan het groeiende polypeptide is ongeveer 16 residuen per seconde bij 37°C. Het 5S-rRNA-molecuul herkent de nucleotidesequentie van de TѰ-lus van tRNA en helpt zo bij de binding van tRNA aan de A-plaats. De codons sturen het specifieke aminoacyl-tRNA aan om bindingen te vormen. De bindingsvorming wordt gestimuleerd door een rekfactor T (EF-T) en GTP. T verwijst naar transferase-activiteit.

De verlengingsfactor (EF) is een oplosbaar eiwit dat nodig is voor de verlenging van de polypeptideketen. De EF is van twee soorten, EF-T en EF-G. De EF-T is geassocieerd met transferase-activiteit, terwijl de EF-G betrokken is bij de translocatie van mRNA.

In prokaryoten bestaat de EF-T uit twee eiwitsubeenheden die EF-Tu (temperatuur onstabiel, MW 44.000) en EF-Ts (temperatuur stabiel, MW 30.000) worden genoemd. De EF-Tu is het meest voorkomende eiwit in E.coli en is goed voor 5-10% van het totale cellulaire eiwit. Beide eiwitten (EF-Tu en EF-Ts) zijn nodig om het aminoacyl-tRNA aan het ribosoom te binden.

De eukaryote EF wordt EF-1 en EF-2 genoemd en lijkt op de prokaryotische EF-T en EF-G. Meer specifiek is de EF-1 qua structuur en functie vergelijkbaar met de EF-Tu. Ooit bestaat de EF-1 in een van de twee vormen (lichte vorm, EF-1L en zware vorm, EF-1H).

De functie van EF-2 is translocatie van aminoacyl-tRNA van de A-plaats naar de P-plaats. De GTP is nodig om het proces van kettingverlenging aan te sturen. Bermerk (1978) heeft het mechanisme van ketenverlenging op ribosoom besproken.

Verlenging van de polypeptideketen wordt bereikt in de volgende twee stappen:

Fig. 10.16: Gebeurtenissen van vorming van polypeptideketens.

(l) Binding van aminoacyl-tRNA aan de A-site:

De GTP bindt aan EF-T en splitst het in EF-Tu-GTP en EF-T's. Het EF-Tu-GTP kan binden aan alle aminoacyl-tRNA (behalve het initiator-tRNA) en resulteert in de vorming van GTP-EF-Tu-aminoacyl-tRNA-complex (Fig. 10.16A). Het is een intermediair complex dat aan het ribosoom is gebonden.

In deze stap speelt het EF-Ts-complex geen rol. Nadat het aminoacyl-tRNA aan de A-plaats bindt, wordt GTP gehydrolyseerd en wordt het EF-Tu-GDP-complex vrijgemaakt uit het ribosoom (B). Elke gebonden aminoacyl-tRNA hydrolyseert één GDP. Het aminoacyl-'8211-tRNA kan binden aan de A-plaats, maar deze binding wordt mogelijk niet gevolgd door EF-Tu-afgifte uit het ribosoom. Dit toont aan dat het doel van GTP-hydrolyse de afgifte van EF-Tu uit het ribosoom is.

(ii) Peptide-bindingsvorming:

Al snel katalyseert het enzym peptidyltransferase (PTas) de vorming van peptidebindingen. In feite wordt dit gekatalyseerd door het 23S-rRNA. Dit proces wordt peptidyloverdracht genoemd (Fig. 10.16.C).

De vorming van peptidebindingen hangt echter af van de afgifte van EF-Tu uit het ribosoom, maar niet van de hydrolyse van GTP. Het EF-Ts-complex recyclet het EF-Tu-GDP naar EF-Tu-GTP, maar veroorzaakt geen afgifte van EF-Tu uit het ribosoom, aangezien de afgifte van IF-2 afhangt van IF-1.

Wanneer een nieuw aminoacyl-tRNA aan de A-plaats bindt, vindt vorming van peptidebindingen plaats tussen het uitgangsaminozuur (N-fmet-tRNA op prokaryoten en met-tRNA in eukaryoten) en nieuw aminoacyl-tRNA op de P-plaats.

Het enzym peptidyltransferase dat zich in de 50S-ribosomale subeenheid bevindt, katalyseert de vorming van een peptidebinding tussen de aminogroep van het nieuwe binnenkomende aminozuur en het C-uiteinde van het langwerpige polypeptide dat aan tRNA is gehecht (Fig. 10.16D). Tijdens het proces van bindingsvorming, H2O wordt geëlimineerd.

4. Translocatie:

Wanneer de peptidebinding wordt gevormd, bindt de groeiende peptideketen zich aan het tRNA dat het binnenkomende aminozuur draagt ​​en bezet de A-plaats van het ribosoom. Het afgevoerde tRNA wordt na het dissociëren van de peptideketen vrijgemaakt van de P-plaats (Fig. 10.16D-E). Het is tot nu toe bekend dat ribosoom uit twee plaatsen (A en P) bestaat, maar de recente bewijzen suggereren dat het uit drie plaatsen bestaat: A, P en E. De E-plaats is specifiek voor gedeacyleerd tRNA (E).

(l) Mechanisme van translocatie:

In het ribosoom op plaats A (aminoacyl-tRNA-accepterende plaats) komt het binnenkomende aminoacyl-tRNA binnen waar decodering (codon-anticodonherkenning) plaatsvindt. Daarna beweegt het ribosoom langs mRNA en daarom vindt er een verandering in complex plaats.

De beweging van het ribosoom zorgt ervoor dat de uitlijning met de A-plaats van het volgende codon van mRNA wordt vertaald. Dientengevolge wordt het peptidyl-tRNA dat zich op de A-plaats bevindt, overgebracht naar de P-plaats. Deze gebeurtenis van overdracht van peptidyl-'8211-tRNA wordt translocatie genoemd (Fig. 10.16E-F).

Tijdens translocatie zijn de gebeurtenissen die worden bereikt:

(i) Verwijdering van afgevoerd tRNA van de P-site,

(ii) Beweging van het peptidyl-tRNA van de A-site naar de P-site, en

(iii) Verplaatsing van bericht door één codon.

(ii) Energetica:

Het recente model van ribosoom laat zien dat:

(i) Het binnenkomende geladen tRNA bindt op de A-site,

(ii) Het groeiende polypeptide gehecht aan tRNA en gebonden aan de P-plaats wordt overgebracht naar het tRNA in de A-plaats, en

(iii) Het nieuw gedecayleerde tRNA na translocatie wordt niet onmiddellijk vrijgegeven, maar is gebonden aan de E-site.

Nu zijn zowel de E- als de P-site betrokken. Het andere binnenkomende geladen tRNA bindt aan de onbezette A-plaats. Dit veroorzaakt een vermindering van de affiniteit van de E-plaats voor het gedeacyleerde tRNA en resulteert in afgifte van afgevoerd tRNA uit het ribosoom. Het proces van binding van binnenkomend aminoacyl-tRNA aan plaats A gaat door totdat het terminatiesignaal wordt ontvangen (G-I).

Bij prokaryoten wordt translocatie veroorzaakt door de EF-G of translocase (MW, 80.000 waarin G = GTPase) en is GTP-hydrolyse vereist. EF-G bindt aan dezelfde plaats als de EF-Tu. Na binding van EF-G hydrolyseer je de ATP tot ADP + Pi in aanwezigheid van ribosoom.

Het is duidelijk dat tijdens elongatie twee moleculen GTP per peptidebinding worden gehydrolyseerd, de ene is EF-T-afhankelijk en de andere EF-G-afhankelijk. De EF-G wordt na elke verlengingsstap uit het ribosoom vrijgegeven. Aangezien zowel EF-T als EF-G dezelfde bindingsplaats gebruiken, kan verlenging niet doorgaan tenzij EF-G wordt afgegeven.

5. Beëindiging van de polypeptideketen:

(i) Herkenning van beëindigingssignaal:

De polypeptideketen zet de verlenging voort totdat een terminatiecodon op mRNA het ribosoom bereikt. De terminatiecodons (UAA-oker, UAG-amber, UGA-opaal of omber) worden ook wel non-sense codons genoemd omdat er geen tRNA-anticodon mee paren. Het is niet nodig dat het terminatiecodon het laatste codon van mRNA is.

In bacteriën en bacteriofagen komen polygene mRNA's bijvoorbeeld veel voor en ze bestaan ​​uit een aantal initiatie- en terminatiecodons. Na translocatie van een van de bovenstaande terminatiecodons naar de A-plaats, bindt het ribosoom niet aan een aminoacyl-tRNA-EF-Tu-GTP-complex. Dan ontvangt het het signaal van beëindiging.

(ii) Vrijgave van polypeptideketen:

Wanneer een terminatiecodon wordt verplaatst naar de A-plaats, bindt het ribosoom in plaats van te binden aan een complex dat een aminozuur bevat, met een peptide-afgiftefactor (RE) (Fig. 10.16 J). In prokaryoten zijn er drie RF-eiwitten (RF-1, MW 44.000 RF-2, MW 47.000 RF-3, MW 46.000).

De RF-1 is actief met UAA- en UAG-codons en de RF-2 is actief met UAA- en UGA-codons. De RF-3 activeert de RF-1 en RF-2 daarom wordt de RF-3 stimulatory (S) factor genoemd. In eukaryoten is er slechts één RF-eiwit (MW 56.500 en 1.15.000) dat actief is met de codons UAA, UAG en UGA. Het RF-eiwit bestaat in twee eenheden en beide blijven in actieve vorm.

Het ribosoom bindt ofwel met RF-1 of RF-2. Het RF-eiwit activeert echter peptidyltransferase dat de binding hydrolyseert die het peptide verbindt met het tRNA op de plaats P. Dit resulteert in afgifte van de peptideketen (Fig. 10.16J).

6. Post-translationele verwerking:

Na afgifte vinden sommige van de verwerkingsgebeurtenissen plaats in de polypeptideketen.

Dergelijke modificaties komen zowel voor bij prokaryoten als bij eukaryoten, zoals hieronder aangegeven:

(i) Verwijdering van fmet uit de polypeptideketen:

De formylgroep van het N-terminale fmet wordt verwijderd door het enzym methioninedeformylase. Het enzym formylmethionine-specifieke peptidase (methionyl-amino-peptidase of MAP) hydrolyseert de volledige formylmethionine-residuen. Alle terminale methionines worden niet verwijderd omdat er sprake is van discriminatie bij het kanaliseren van verschillende polypeptiden via deze twee alternatieve stappen.

Het voorlaatste aminozuur van de zijketen fungeert als de onderscheidende factor. Verwijdering van methionine door MAP hangt af van de lengte van de zijketen. De zijketen van de langere lengte heeft minder mogelijkheid voor MAP om de methionine te verwijderen. De andere bewerkingen zijn acetylering (van L12 om L7 te veroorzaken) of adenylering.

(een) Verlies van signaalsequenties:

In sommige polypeptiden zijn ongeveer 15 tot 30 aminozuurresiduen aanwezig aan het N-uiteinde. Deze residuen fungeren als signaalsequentie en leiden het eiwit naar zijn uiteindelijke bestemming. De signaalsequenties worden gesplitst door specifieke peptidasen.

(B) Wijziging van individueel aminozuur:

Sommige aminozuurzijketens zijn specifiek gemodificeerd, zoals:

(a) Enzymatische fosforylering door ATP van -OH-groep van bepaalde aminozuren (bijv. serine, threonine, tyrosine),

(b) Binding van Ca++ aan fosforesinegroepen van melkeiwit, caseïne,

(c) Toevoeging van een carboxyl (-COOH) groep aan aspartaatglutamaatresiduen van sommige eiwitten (bijv. bloedstollingseiwit, protrombine),

(d) Methylering van eiwitten (bijv. methylering van lysineresiduen in cytochroom c, calmoduline).

(C) Vorming van disulfide-verknopingen:

Er worden disulfidebruggen gevormd tussen cysteïneresten van sommige eiwitten. Daarom zijn ze covalent verknoopt en worden ze natuurlijk verkregen uit.

(NS) Glycosylering:

Aanhechting van de koolhydraatzijketens tijdens of na de eiwitsynthese wordt glycosylering genoemd, bijvoorbeeld glycoproteïnen.

(e) Toevoeging prothesegroep:

Prothetische groepen worden covalent gebonden aan veel prokaryote en eukaryote eiwitten. Het biotinemolecuul is bijvoorbeeld covalent gekoppeld aan acetyl-CoA-carboxy­lase.

(ii) Ribosoombewerking:

Tijdens het translatieproces komen bepaalde ongepaste amino-geacyleerde tRNA's de A-plaats van het ribosoom binnen en blijven aan het ribosoom gebonden. Deze overtreffen de juiste amino-geacyleerde (aa)-tRNA's.

De aa-tRNA's blijven echter lange tijd gebonden aan de A-plaats voor een peptide van de P-plaats van het ribosoom. Er zijn twee processen die de fout van overlevende polypeptideketen kunnen verminderen, b.v. ribosoombewerking en preferentiële afbraak van polypeptideketen die foutieve aminozuren bevat.

Volgens de ribosoombewerkingshypothese vormt de structuur van ongepast peptidyl-tRNA de structuur van mRNA niet correct en daarom dissocieert het van het ribosoom tijdens eiwitsynthese. Het gen relA produceert echter een signaalmolecuul (alarmone), guanosinetetrafosfaat (ppGpp), dat het bewerkingsproces beïnvloedt.

De ppGpp interageert met EF-G en resulteert in een langere levensduur van peptidyl-tRNA in de A-site en verbetert het bewerkingsproces. Het gen pth synthetiseert peptidyl-tRNA-hydrolase dat inwerkt op het peptidyl-tRNA wanneer het wordt vrijgegeven. Het ribosoomvrije peptidyl-tRNA wordt door dit enzym gehydrolyseerd. Dientengevolge worden een intact peptide en een intact tRNA geproduceerd. Het defecte peptide wordt afgebroken door het enzym.

(iii) Eiwitvouwing:

Na de synthese van de polypeptideketen ondergaat het spontane vouwingen. De secundaire vouwen worden gevormd tussen de gevouwen gebieden. Ten slotte ontwikkelt zich als resultaat van verdere vouwing een tertiaire structuur van de polypeptideketen, d.w.z. eiwit. Voordat de terminale aminozuren in de polypeptideketen worden toegevoegd, bereikt het eiwit zijn uiteindelijke vorm tijdens de ketenbeëindiging.

Volgens de recente theorieën is het proces van eiwitvouwing complex. Veel eiwitten hebben hulp nodig om goed opgevouwen te worden. Deze hulp wordt geleverd door de eiwitten van een speciaal soort die bekend staan ​​als chaperonnes of chaperonines. Deze helpen polypeptiden om zichzelf te assembleren door alternatieve assemblageroute te remmen.

Wanneer chaperonnes een interactie aangaan met het polypeptide, wordt de kans op onjuiste in-folding verkleind. In E. coli zijn chaperonnes als voorbeeld GroE1 (60 KDa), GroES (10KDa) en DnaK (70KDa). Dit zijn allemaal constitutieve eiwitten die hun concentratie verhogen wanneer er stress is, zoals een hitteschok.

7. De signaalhypothese (eiwitexport):

Het is interessant om op te merken dat na de synthese van eiwit, hoe het wordt opgenomen in membranen of door de cel naar buiten wordt uitgescheiden? Er wordt echter aangenomen dat de secretoire eiwitten worden gesynthetiseerd door de ribosomen die aan het endoplasmatisch reticulum zijn gehecht en daarin worden afgegeven. Vanuit het endoplasmatisch reticulum worden ze getransporteerd naar verschillende celorganellen (in eukaryoten) waar ze door het proces van exocytose buiten de cel worden uitgescheiden.

Om dit mechanisme te verklaren, hebben Blobel en Dobberstein (1975) een theorie voorgesteld die bekend staat als signaalhypothese. Verder heeft Blobel (1978) deze hypothese beoordeeld en gepostuleerd dat de mRNA's die secretoire eiwitten vertalen, aan de 3'8242-zijde van het initiatiecodon (AUG) een groep signaalcodons bezitten.

Het endoplasmatisch reticulum bestaat uit ribosoomreceptoreiwitten. Een polypeptideketen bestaande uit een speciaal gebied (signaalpeptidegebied) wordt gesynthetiseerd door het ribosoom. Nadat het uit het ribosoom komt, interageert het signaalpeptide met het ribosoomreceptoreiwit en resulteert in de vorming van een tunnel in het membraan.

De membraantunnel valt echter samen met de ribosomale tunnel. Het enzym signaalpeptidase breekt de polypeptideketen die wordt gesynthetiseerd. Na volledige synthese van de polypeptideketen wordt het vrijgegeven in de ruimte van het endoplasmatisch reticulum.

Aan het einde dissociëren de ribosomen van het membraan van endoplasmatisch reticulum ribosoomreceptoreiwitten worden diffuus en sluiten de tunnels. Dit proces van het binnendringen van de eiwitten in de membranen wordt ook wel eiwitexport genoemd.

Er is de afgelopen jaren veel werk verricht aan het translocatiesysteem van secretoire eiwitten in E. coli en de andere bacteriën, zoals Bacillus subtilis. Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens, Enterobacter aero-genen. Vibrio cholerae, Klebsiella oxycota, enz.

De meeste secretoire eiwitten worden eerst getranslateerd in een vorm van een voorloper die 15-30 aminozuren aan de N-terminus bevat, wat een signaalsequentie wordt genoemd. De signaalsequentie bestaat uit een hydrofoob gebied van ongeveer 11 aminozuurresiduen en een kort stuk hydrofiel gebied aan het N-uiteinde. De signaalsequentie is betrokken om het ontluikende polypeptide aan het membraan te binden.

In Gram-negatieve organismen wordt de route voor export en secretie van signaalsequentie-bevattende eiwitten de algemene secretoire route genoemd. De eerste stap is de sec-genproductafhankelijke translocatie van geëxporteerd eiwit buiten het cytoplasmatische membraan. Brondage (1990) heeft een model gepresenteerd van proOmpA (een export pro­teïne) translocatie over het plasmamembraan (Fig. 10.17).

Fig. 10.17: Een model voor translocatie van proOmpA over het plasmamembraan.

Het eiwit SecB (een product van het secB-gen) is een pilootchaperonine. Het is geassocieerd met het te transporteren eiwit, d.w.z. transporteiwit, bijvoorbeeld proOmpA. Het wordt ook gesynthetiseerd op het ribosoom. Bij afwezigheid van SecB aggregeert het proOmpA en controleert het zijn invoeging in het membraan.

Het eiwit SecA is in feite een ATPase en vormt ook een onderdeel van pre-eiwit translocase samen met het integrale membraaneiwit SecY/E. Het SecA-eiwit werkt als een receptor voor het proOmpA-SecB-complex. Vervolgens wordt het ATP gehydrolyseerd, waardoor het proOmpA in het membraan vrijkomt. Het drijft ook de algehele chaperonnes en membraan-geassocieerde reacties aan.

Als het transportproces eenmaal is gestart ten koste van ATP, vindt verdere translocatie plaats via een reeks transmembraantussenproducten, waarvan de energiebehoefte wordt vervuld door protonaandrijfkracht in plaats van ATP-hydrolyse. Tijdens het translocatieproces splitst het enzym signaalpeptidase (LepB) de signaalsequentie van het geëxporteerde eiwit.

Het moet het periplasma binnendringen of zich verplaatsen over het buitenmembraan. Pugsley (1993) heeft de volledige algemene secretaresseroute in Gram-negatieve bacteriën gepubliceerd, waarbij de verschillende takken eiwitten naar hun uiteindelijke extra cytoplasmatische bestemming leiden (Fig. 10.18).

Fig. 10.18: Hoofdtakken van de algemene secretoire routes (GSP) van Gram-negatieve bacteriën. IMP, geïntegreerde membraaneiwitten CAC, chaperonne-assemblagekanaal PSI, periplasmatische secretie-tussenproducten SP, signaalpeptidase.

8. De remmers van genexpressie:

Er zijn verschillende antimicrobiële middelen die de eiwitsynthese in twee stappen remmen, hetzij tijdens transcriptie of translatie. Franklin en Snow (1991) hebben de biochemie van de werking van antimicrobiële antibiotica mooi besproken.

(i) Transcriptieremmers:

De rifamycine en chemisch vergelijkbare groep (streptovarcines) remmen de initiatie van transcriptie. Rifampicine en streptovarcine zijn de halfsynthetische verbindingen, terwijl rifamycine de van nature voorkomende antibiotica zijn. Ze binden stevig aan de P-subeenheid van RNA-polymerase (rpoB) en remmen de initiatie van transcriptie.

(B) Streptolydigine:

Het is vergelijkbaar met rifamycine omdat het ook bindt aan de P-subeenheid van RNA-polymerase. Bovendien remt het beide processen: keteninitiatie en ketenverlenging in vitro.

(ii) Translatieremmers:

Het remt de activiteit van peptidyltransferase na binding aan 508-subeenheid van bacterieel ribosoom. Het effect is bacteriostatisch, d.w.z. na verwijdering van het medicijn is het effect snel omgekeerd. Het effect bij eukaryoten is echter hetzelfde als bij prokaryoten. Beenmergtoxiciteit resulteert in aplastische anemie.

Deze groep antibiotica vertoont breedspectrum bacteriostatische activiteiten tegen Gram-positieve en negatieve bacteriën, mycoplasma's, rickettsiae en chlamydiae. Deze voorkomen de binding van aminoacyl-tRNA aan de A-plaats van 30S-ribosoom. Bovendien kan het binden aan verschillende plaatsen van zowel 30S- als 50S-subeenheden.

(C) Cycloheximide (actidion):

Het remt de eiwitsynthese in eukaryoten (bijv. gisten, schimmels, hogere planten en zoogdieren), maar niet de prokaryotische micro-organismen. Het interfereert met de activiteit van ribosoom dat aanwezig is in het cytoplasma maar niet in de mitochondriën, door te binden aan 80S-subeenheden en de beweging van mRNA te voorkomen.

Dit is een grote groep antimicrobiële middelen, waaronder erytromycine, leukomycine, macrocine, carbomycine, chalcomycine, angalomycine, enz. Deze zijn actief tegen de Gram-positieve bacteriën en minder actief tegen Gram-negatieve bacteriën, maar niet tegen de eukaryoten. Deze interageren met de SOS-subeenheid van ribosoom en remmen de eiwitsynthese. Ook stimuleren ze de dissociatie van peptidyl-tRNA van het ribosoom door middel van een mislukte translocatiestap.

Lincomycine en de andere chemisch vergelijkbare antibiotica remmen peptidyltransferase door binding aan 23S-rRNA van de 50S-subeenheid. Deze beïnvloeden zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën.

Het bindt aan een peptide met de C-terminus van groeiend polypeptide en resulteert in voortijdige beëindiging van de polypeptideketen. Het interageert met de P-site van ribosoom, maar niet met de A-site. Het werkt even goed op 70S en 50S ribosomen.


Invoering

Na synthese door RNA-polymerase II ondergaan eukaryote mRNA-precursors (pre-mRNA) een reeks modificaties, waaronder capping aan het 5'-uiteinde, splitsing en toevoeging van een 3'-poly (A) -staart. Het is aangetoond dat de poly(A)-staart vrijwel alle aspecten van het mRNA-metabolisme beïnvloedt, inclusief translatie-initiatie en mRNA-stabilisatie (besproken in Beelman en Parker, 1995 Sachs et al., 1997 Wahle en Rüegsegger, 1999). Polyadenylatie is een gebeurtenis in twee stappen: endonucleolytische splitsing van het pre-mRNA wordt gevolgd door poly(A)-toevoeging aan het 3'-uiteinde van mRNA's. De splitsings- en polyadenyleringsreacties omvatten een uit meerdere componenten bestaande machinerie van opmerkelijke complexiteit (besproken in Colgan en Manley, 1997 Wahle en Rüegsegger, 1999 Zhao et al., 1999 ). Bij zoogdieren wordt de synthese van de poly(A)-staart gekatalyseerd door poly(A)-polymerase (PAP) met behulp van de splitsings- en polyadenyleringsspecificiteitsfactor (CPSF Christofori en Keller, 1988 Takagaki et al., 1988 Gilmartin en Nevins, 1989 Wahle, 1991b). CPSF bindt aan het canonieke polyadenylatiesignaal AAUAAA, dat zich in de pre-mRNA 10-30 nucleotiden stroomopwaarts van de polyadenylatieplaats bevindt (Keller et al., 1991 ). PAP alleen bindt RNA zeer zwak en niet-specifiek en vertoont een lage, distributieve polyadenyleringsactiviteit. Dit in tegenstelling tot wat er gebeurt nadat het polymerase door CPSF is gerekruteerd naar AAUAAA-bevattende RNA's, de eiwit-eiwit-interacties met CPSF stimuleren polyadenylatie en stabiliseren het ternaire complex dat bestaat uit CPSF, PAP en de RNA-primer (Bienroth et al., 1993 Murthy en Manley, 1995). In aanwezigheid van het nucleaire poly(A)-bindende eiwit II (PABP2), een andere factor van de polyadenyleringsmachinerie, wordt de poly(A)-synthese snel en procesmatig. Van PABP2 is ook aangetoond dat het de uiteindelijke lengte van poly(A)-staarten controleert, die gemiddeld 250 nucleotiden lang zijn. in vivo (Wahle, 1991a Wahle et al., 1993 ).

De meeste PAP's zijn enkelvoudige polypeptide-enzymen en cDNA-klonen die ervoor coderen, zijn geïsoleerd uit veel verschillende organismen (Martin et al., 1999 ). PAP's hebben een modulaire organisatie met een katalytisch domein nabij de N-terminus en een RNA-bindend gebied dat overlapt met een nucleair lokalisatiesignaal (NLS) nabij de C-terminus (Zhelkovsky et al., 1995 Martin en Keller, 1996 Martin et al., 1999 ). C-terminale extensies van ∼20 kDa worden alleen gevonden bij gewervelde dieren en zijn overbodig voor katalytische activiteit in vitro. Het verlengde C-terminale domein van PAP's van gewervelde dieren is rijk aan serines en threoninen, en enzymactiviteit kan worden gedownreguleerd door fosforylering op meerdere plaatsen (besproken in Colgan en Manley, 1997 Wahle en Rüegsegger, 1999). De extreme C-terminus van PAP is ook het doelwit voor een ander type regulering. Van het U1A-eiwit, een bestanddeel van het U1-snRNP dat functioneert bij de herkenning van 5'-splitsingsplaatsen, is bekend dat het polyadenylatie van zijn eigen mRNA remt door te binden aan PAP (Gunderson et al., 1994 Vagner et al., 2000 ). De C-terminus van PAP is ook betrokken bij eiwit-eiwit interacties met de splicing factor U2AF65 (Vagner et al., 2000) en het snRNP-eiwit U1-70K (Gunderson et al., 1998 ).

PAP's behoren tot een grote superfamilie van nucleotidyltransferasen met twee kenmerkende kenmerken: een geconserveerd katalytisch domein versierd met drie invariante carboxylaten die cruciaal zijn voor activiteit, en een spiraalvormig draaimotief dat betrokken is bij nucleotidebinding (Holm en Sander, 1995 Martin en Keller, 1996 Aravind en Koonin, 1999 Martin et al., 1999 ). Zoogdier DNA-polymerase β (pol β) en kanamycine nucleotidyltransferase (KanNt) zijn ook leden van deze superfamilie van nucleotidyltransferasen. De structuren van pol β ( Davies et al., 1994 Pelletier et al., 1994 Sawaya et al., 1997) en KanNt (Sakon et al., 1993 Pedersen et al., 1995 ) zijn bekend. Beide kristalstructuren hebben aangetoond dat geconserveerde residuen in het spiraalvormige draaimotief betrokken zijn bij het herkennen van de trifosfaateenheid van het nucleotide. Pol β is een matrijsafhankelijke DNA-polymerase die betrokken is bij de herstelroute voor base-excisie (Pelletier et al., 1994 Sobol et al., 1996 Sawaya et al., 1997 ). Tot nu toe ontbrak een structuur van een template-onafhankelijk polymerase zoals PAP.

Hier rapporteren we de structuur van een C-terminale deletiemutant van runder-PAP gebonden aan een analoog van ATP, cordycepin 5'-trifosfaat (3'-dATP), met een resolutie van 2,5 A. De hier gepresenteerde structurele resultaten onthullen een verrassende domeinsamenstelling en architectuur, en geven inzicht in de manieren waarop PAP specifiek bindt aan en ATP incorporeert.


Grote zorgen over de integriteit van de mitochondriale ADP/ATP-drager in dodecyl-fosfocholine die wordt gebruikt voor NMR-onderzoeken naar oplossingen

Membraaneiwitten (MP's) omvatten 15-25% van het menselijke proteoom, maar vormen samen minder dan 1% van de gedeponeerde driedimensionale structuren in de Protein DataBank (PDB). Een dergelijk gebrek aan structurele informatie blijkt uit moeilijkheden die gepaard kunnen gaan met de biochemische bereiding van gezuiverde MP's, variërend van complicaties met getrouwe abstractie van het oorspronkelijke membraan tot verkeerd vouwen na extractie uit onoplosbare inclusielichamen. Bovendien, ondanks de algemene opvatting dat MP's bestaan ​​in een van de twee eindtoestanden (dwz "open" of "gesloten" transporters, "actieve" of "inactieve" G-eiwit gekoppelde receptoren), kunnen MP's een breed scala aan conformaties bevolken die dynamisch uitwisseling op verschillende tijdschalen, variërend van pico-nanoseconden, micromilliseconden of veel langer dan uren. Dergelijke dynamiek kan kristallisatiepogingen voor structurele analyse door röntgenkristallografie vaak belemmeren. Ondanks het huidige gebrek aan structurele kennis met betrekking tot parlementsleden, richten veel door de FDA goedgekeurde medicijnen zich op hen. Een holistisch begrip van membraaneiwitstructuren, dynamiek en interacties in natieve membraanomgevingen, of betrouwbare membraanmimetica, blijkt dus van cruciaal belang.

Een belangrijke factor in structurele studies van MP's is de membraanomgeving. Zoals opgemerkt in een recent overzicht 1 , heeft bijna 80% van de tot nu toe bepaalde MP-structuren detergentia gebruikt, die kleine micellen vormen die een heel andere omgeving bieden dan lipiden. Recent werk heeft echter aangetoond dat veel MP's die in dergelijke micellen zijn ingebed, bijvoorbeeld van het veelgebruikte detergens dodecylfosfocholine (DPC, ook bekend als Foscholine-12), niet langer functioneel of correct gevouwen zijn 1 .

Dus, bij het kiezen van een membraanmimetisch systeem, hoe zorg je ervoor dat een gereconstitueerd MP functioneel relevant is? De meest rigoureuze demonstratie is een test die de biochemische activiteit direct volgt: bijvoorbeeld het transport van een substraat of een ander reportermolecuul. Bij afwezigheid van een dergelijke test, gaan onderzoekers doorgaans standaard in op het aantonen van de MP-binding aan een relevant ligand, in het algemeen door een dissociatieconstante te meten (KNS) en dit te vergelijken met waarden die zijn verkregen door andere groepen die natieve membranen hebben gebruikt. In de hieronder besproken preprints zijn twee reproductiestudies uitgevoerd die significante tekortkomingen in deze praktijk aan het licht brengen, en laten zien dat de veronderstelde functionaliteit van MP's met voorzichtigheid moet worden geïnterpreteerd bij het gebruik van detergentia.

De voordrukken

Twee recente preprints hebben reproduceerbaarheidsstudies uitgevoerd naar de structurele en functionele integriteit van een AAC-transporter (AAC3) in DPC 2,3. AAC3 functioneert om ADP uit te wisselen voor ATP over het binnenste mitochondriale membraan, een essentieel proces voor de cel. Dit membraaneiwit was eerder gekristalliseerd in aanwezigheid van een sterke remmer (CATR) en er werd aangetoond dat het een vergrendelde conformatie aannam, de "c-state" genoemd 4,5 . Als onderdeel van zijn transportmechanisme bevolkt AAC3 een tweede conformatie die bekend staat als de "m-state", maar structureel bewijs voor deze staat is ongrijpbaar gebleven.

In 2015, een paper van Chou en collega's 6 in Natuur Structurele en moleculaire biologie rapporteerde met behulp van NMR-spectroscopie dat, in DPC, de gistversie van AAC3 (yAAC3) kon worden vastgelegd in een dynamisch evenwicht met twee toestanden: de c-toestand en een tijdelijk bevolkte conformatie, waarvan werd aangenomen dat het de m-toestand was (of vergelijkbaar ). Van cruciaal belang was dat hun resultaten afhing van het feit dat yAAC3 correct gevouwen en volledig functioneel bleef terwijl het in het wasmiddel was ingebed. De integriteit en correcte vouwing van het yAAC3-monster werd bepaald door binding van de remmer (CATR) en substraat (ADP) zoals gemeten door isotherme titratiecalorimetrie (ITC) of NMR6.

Preprints van Schanda en collega's 2 van het Institut de Biologie Structurale in Grenoble (Frankrijk) en Kunji en collega's 3 van de Mitochondrial Biology Unit in Cambridge (VK) daagden het idee uit dat yAAC3 correct gevouwen en functioneel is in DPC. Integendeel, de auteurs tonen overtuigend aan dat yAAC3 verkeerd is gevouwen en niet functioneel is in de aanwezigheid van DPC.

Ten eerste, beide koning et al. 3 en Kurauskas et al. 2 merkte op dat de KNS waarden voor CATR-binding aan yAAC3 gerapporteerd door Chou en collega's waren bijna drie tot vier orden van grootte groter dan de algemeen aanvaarde literatuurwaarden (5-300 nM). Ten tweede onderzochten Schanda en collega's de onbewerkte gegevens die werden gebruikt om te bepalen dat het substraat (ADP) specifiek bindt, en ontdekten dat residuen overal in yAAC3, inclusief die op meer dan 20 afstand van de ADP-bindingsplaats, werden beïnvloed door ADP-binding 2 . Hoewel dit allosterische structurele veranderingen zou kunnen weerspiegelen, merkte een recente publicatie op dat AAC3 ingebed in DPC identiek bond aan ATP en GTP, ondanks de voorkeur voor de eerstgenoemde in het natieve membraan 5 . Een dergelijk verlies aan specificiteit impliceert een onjuiste tertiaire structuur. Eindelijk, koning et al. 3 gemeten smelttemperaturen van yAAC3 in DPC en andere wasmiddelsystemen (Figuur 1A). In het natieve mitochondriale membraan ontvouwde yAAC3 zich bij 40°C, maar hetzelfde experiment uitgevoerd in DPC onthulde een grote fractie van ongevouwen eiwit dat al aanwezig was bij omgevingstemperatuur, dat geen ontvouwende coöperativiteit vertoonde 3 . Vergelijkbare resultaten werden verkregen met NMR3. Samengevat suggereren deze gegevens dat yAAC3 opgelost in DPC onjuist is gevouwen en niet-specifiek aan CATR en ADP bindt 2,3. koning et al. merk op dat een niet-specifieke interactie elektrostatisch van aard kan zijn, aangezien yAAC3 een iso-elektrisch punt van 9,82 heeft en daarom overmatige positieve lading bevat, terwijl ADP en CATR beide negatief geladen zijn bij neutrale pH 3 .

Nadat is vastgesteld dat ADP- en CATR-binding in feite niet-specifieke interacties weerspiegelt, hebben Schanda en collega's 2 de eerder gepubliceerde NMR-gegevens opnieuw onderzocht die werden gebruikt om conformationele uitwisseling in yAAC3 tussen de c-state en vermeende m-state (Figuur 1B) te meten. Het experiment dat voor een dergelijke analyse wordt gebruikt, heet Carr-Purcell-Meiboom-Gill-relaxatiedispersie (CPMG RD, hier besproken), en omvat de meting van een NMR-parameter (transversale relaxatiesnelheid, de effectieve R2) als functie van het aantal radiofrequente pulsen dat gedurende een vaste vertraging wordt toegediend. In de aanwezigheid van conformationele uitwisseling tussen twee of meer toestanden op de micro-tot-milliseconde tijdschaal, zullen CPMG RD-experimenten een afhankelijkheid van R2 op het aantal toegepaste radiofrequentiepulsen (Figuur 1B). Het vervolgens aanpassen van deze gegevens aan de juiste vergelijkingen levert de snelheid van conformationele uitwisseling, de relatieve populaties en (kwalitatieve) residu-specifieke informatie over structurele verschillen tussen de twee vormen. Dergelijke experimenten zijn bijvoorbeeld ingezet om nauwkeurige oplossingsstructuren te bepalen van anderszins onzichtbare eiwitvouwingstussenproducten die op de milliseconde tijdschaal worden uitgewisseld met een gevouwen conformatie 7 .

In het originele artikel ontdekten Chou en collega's 6 via CPMG RD dat de snelheid van conformationele uitwisseling met ongeveer 20-voudig varieerde tussen de remmer- en substraatgebonden vormen van yAAC3, en rapporteerden grote structurele verschillen tussen de twee toestanden (voor NMR-spectroscopisten , 15 N |delta omega| > 5 ppm). Echter, Kurauskas et al. pas de onbewerkte CPMG RD-gegevens in vrije staat en de remmer- en substraatgebonden vormen van yAAC3 (Figuur 1B) opnieuw aan, waarbij wordt vastgesteld dat er geen verschil bestond in de snelheid van conformationele uitwisseling (1500 s-1 voor alle vormen), met aanzienlijk kleinere structurele verschillen dan aanvankelijk gerapporteerd (15 N |delta omega|-waarden rond 2 ppm). Ten slotte werd een vergelijkbare uitwisselingsdynamiek in milliseconden verkregen die onafhankelijk was van toegevoegd substraat/remmer bij het analyseren van conformationele uitwisseling in mutanten van AAC3 die niet in staat zijn tot ADP/ATP-uitwisseling, wat aangeeft dat er geen verband is tussen dynamiek en transport 8 .

Concluderend tonen deze twee nieuwe preprints van de Schanda- en Kunji-groepen aan dat het yAAC3-membraaneiwit niet functioneel is en verkeerd is gevouwen wanneer het wordt ingebed in DPC. Deze studies benadrukken de moeilijkheid en het belang van het kiezen van de juiste membraannabootser (wanneer er geen natuurlijke membranen worden gebruikt). Bovendien bieden deze werken een platform voor het diagnosticeren van toekomstige problemen die voortvloeien uit verkeerd gevouwen MP's (bijv. niet-specifieke ligandbinding, lagere KNS dan verwacht, doordringende bewegingen van milliseconden), in het bijzonder die geanalyseerd met NMR-spectroscopie.

Deze twee nieuwe preprints benadrukken het belang van onafhankelijke replicatiestudies die tot doel hebben biologische implicaties verkregen uit biofysische experimenten te verifiëren, uit te dagen of in twijfel te trekken. Hoewel er in de gepubliceerde literatuur een paar voorbeelden zijn, zijn er zeker niet genoeg van dergelijke onderzoeken. Het is bemoedigend dat onlangs een replicatie-preprint werd gemarkeerd op voorlichten. De bioRxiv zal het stigma helpen wegnemen dat verbonden is aan het publiceren van replicatiestudies, en zal een handig platform bieden voor de publicatie van replicatiestudies in plaats van publicatie in traditionele tijdschriften. Evenzo heeft PLOS Biology een initiatief opgezet om artikelen te publiceren van groepen die onlangs zijn 'gescoopt', wat ook het aantal artikelen zou moeten vergroten dat gegevens op hetzelfde systeem rapporteert.

Hoewel de twee preprints die hier worden besproken negatieve resultaten opleveren, zullen hun bevindingen samen het gebied van AAC-structurele biologie vooruithelpen en hopelijk toekomstige onderzoekers ervan weerhouden om DPC als een reconstitutiesysteem te gebruiken. Meer in het algemeen benadrukken de preprints van de Schanda- en Kunji-groepen het belang van het selecteren van het juiste membraanmimetische systeem en vervolgens verifiëren dat de ingebedde MP functionele en structurele integriteit behoudt.

Als praktiserend NMR-spectroscopist die van dynamische metingen houdt, was het experiment waar ik het meest van genoot eigenlijk een data-analysemethode om inzicht te krijgen in bewegingen van microseconden tot milliseconden. Schanda en collega's merkten op dat de CPMG RD-gegevens van Chou en collega's konden worden beschreven door een enkele set parameters voor alle drie de voorwaarden (apo-AAC3, CATR-gebonden AAC3, ADP-gebonden AAC3), en toonden aan dat deze gegevens inderdaad kunnen worden wereldwijd gemonteerd. Dit betekent dat het AAC3-uitwisselingsproces op de micro-tot-milliseconde tijdschaal, dat wordt onderzocht in het NMR-experiment, ongevoelig is voor toegevoegd substraat of remmer en daarom geen transportfilter is.