Informatie

7: Gistkolonie PCR - Biologie


De S. cerevisiae soorten die we dit semester gebruiken, zijn gemaakt door de Saccharomyces Project voor het verwijderen van genen. In het project hebben gistonderzoekers systematisch elke ORF in het gistgenoom vervangen door een bacteriële kanamycineresistentie (KANR) gen. In dit lab ga je de polymerasekettingreactie (PCR) gebruiken om de verstoorde LEERDE KENNEN genen in uw deletiestammen. Thermostabiele DNA-polymerasen (hierboven) spelen een sleutelrol bij PCR.


Doelen

Aan het einde van dit lab moeten studenten in staat zijn om:

  • beschrijf de reacties die plaatsvinden bij de verschillende temperaturen die worden gebruikt in PCR-cycli.
  • ontwerp oligonucleotide-primers om sequenties te amplificeren met PCR.
  • uitleggen hoe veranderingen in de gloeitemperatuur en verlengingstijd de productie van PCR-producten beïnvloeden.
  • ontwerp en voer een PCR-strategie uit die drie leerde kennen verwijdering stammen.

In een vorig lab gebruikte je verschillende kweekmedia om onderscheid te maken tussen verschillende S. cerevisiae ontmoet mutanten. Uw resultaten hebben u mogelijk in staat gesteld om uw stammen voorlopig te identificeren. In dit lab ga je de polymerasekettingreactie (PCR) gebruiken om de mutante stammen meer overtuigend te identificeren. Dit hoofdstuk begint met een overzicht van de PCR en de Saccharomyces Project voor het verwijderen van genen. Je gebruikt deze kennis om een ​​strategie te ontwerpen en uit te voeren voor het identificeren vanleerde kennen deletiestammen door gistkolonie PCR.


Extractie van genomisch DNA uit gisten voor op PCR gebaseerde toepassingen

We hebben een snel en goedkoop genomisch DNA-extractieprotocol van gistcellen ontwikkeld voor op PCR gebaseerde toepassingen. Deze methode vereist geen enzymen, gevaarlijke chemicaliën of extreme temperaturen en is bijzonder krachtig voor gelijktijdige analyse van een groot aantal monsters. DNA kan efficiënt worden geëxtraheerd uit verschillende gistsoorten (Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris en Saccharomyces cerevisiae). Het protocol omvat lysis van gistkolonies of cellen uit vloeibare cultuur in een lithiumacetaat (LiOAc)-SDS-oplossing en daaropvolgende precipitatie van DNA met ethanol. Ongeveer 100 nanogram totaal genomisch DNA kan worden geëxtraheerd uit 1 x 10 (7) cellen. DNA dat met deze methode wordt geëxtraheerd, is geschikt voor een verscheidenheid aan op PCR gebaseerde toepassingen (waaronder kolonie-PCR, realtime qPCR en DNA-sequencing) voor amplificatie van DNA-fragmenten van ≤ 3500 bp.

Figuren

Figuur 1. Optimalisatie van LiOAc-SDS-lysis in ...

Figuur 1. Optimalisatie van LiOAc-SDS-lysis in S. cerevisiae

Figuur 2. PCR-amplicongrootte van LiOAc-SDS...

Figuur 2. PCR-amplicongrootte van met LiOAc-SDS geëxtraheerd DNA en de lysis van verschillende gist ...


Kolonie PCR

Kolonie-PCR is een handige high-throughput-methode voor het bepalen van de aan- of afwezigheid van insert-DNA in plasmideconstructen. Individuele transformanten kunnen ofwel in water worden gelyseerd met een korte verwarmingsstap of direct aan de PCR-reactie worden toegevoegd en tijdens de initiële verwarmingsstap worden gelyseerd. Deze initiële verwarmingsstap zorgt ervoor dat het plasmide-DNA uit de cel vrijkomt, zodat het als matrijs kan dienen voor de amplificatiereactie. Primers die zijn ontworpen om specifiek het insert-DNA te targeten, kunnen worden gebruikt om te bepalen of het construct het van belang zijnde DNA-fragment bevat. Als alternatief kunnen primers die gericht zijn op vector-DNA dat het insert flankeert, worden gebruikt om te bepalen of het insert al dan niet de juiste molecuulgrootte heeft. Insert-specifieke primers kunnen informatie verschaffen over zowel de specificiteit als de grootte van het insert-DNA, terwijl het gebruik van vectorspecifieke primers het gelijktijdig screenen van meerdere constructen mogelijk maakt. Kolonie-PCR kan ook worden gebruikt om de oriëntatie van de insert te bepalen. PCR-amplificatie van het plasmide met behulp van een insert-specifieke primer in combinatie met een vector-specifieke primer kan alleen worden ontworpen om een ​​amplicon van een specifieke grootte te produceren als het insert in de juiste oriëntatie is. In alle experimentele ontwerpen worden de aanwezigheid of afwezigheid van een PCR-amplicon en de grootte van het product bepaald door middel van elektroforese naast een DNA-groottemarkering op een agarosegel.

Kies Type:

Toekomstige artikelen

Brochures

Webhulpmiddelen

Gidsen voor probleemoplossing

Gebruiksrichtlijnen

Dit product valt onder een of meer patenten, handelsmerken en/of copyrights die eigendom zijn van of beheerd worden door New England Biolabs, Inc (NEB).

Hoewel NEB haar producten voor verschillende toepassingen ontwikkelt en valideert, kan het voor het gebruik van dit product van de koper zijn dat hij voor bepaalde toepassingen aanvullende intellectuele eigendomsrechten van derden moet verkrijgen.

Neem voor meer informatie over commerciële rechten contact op met het Global Business Development-team van NEB via [email protected]

Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden. Dit product is niet bedoeld voor therapeutische of diagnostische doeleinden bij mensen of dieren.


Een uiterst eenvoudige en effectieve kolonie-PCR-procedure voor bacteriën, gisten en microalgen

Er is een uiterst eenvoudige en effectieve kolonie-PCR-procedure vastgesteld voor zowel gram-negatieve als gram-positieve bacteriën, gisten en microalgen. Van de vier onderzochte lysisbuffers is waargenomen dat Y-PER effectiever is dan Tris/EDTA, 0,2% SDS en 10 mM EDTA bij de extractie van genomisch DNA van PCR-kwaliteit uit die micro-organismen. Vortexen of pipetteren van de cellen in Y-PER gedurende 5-10 seconden was voldoende om genomisch DNA vrij te maken voor alle testbacteriën en gisten, en de meeste microalgen. Extra incubatie bij 98 ° C gedurende 5 minuten voor verdere celverstoring was alleen essentieel voor Chlorella vulgaris vanwege zijn notoir stijve celwand.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Gistkolonie PCR - Hoe gistkolonie PCR te verbeteren (26-dec.2007 )

hallo, ik heb weer een probleem.
geef me een suggestie over gistkolonie PCR, dit is mijn protocol!
1. Incubeer de gistcultuur met een geschikt medium bij 30°C, 's nachts.
2. Centrifugeer 0,5 ml cellen bij 8000 tpm gedurende 5 minuten, gooi supernatant weg.
3. Resuspendeer de cellen met 0,5 ml 1xPBS, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 8000 tpm, gooi het supernatant weg.
4. Resuspendeer de cellen met 0,1 ml TE, vervolgens gekookt in water gedurende 3 minuten
5. koud in de vloeibare stikstof voor 0,5 min
6. gekookt in water gedurende 2 minuten.
7. neem dan 1 ul supernatant als sjabloon voor PCR

nu is het probleem dat ik het juiste PCR-product niet kan krijgen, zelfs niets kan krijgen. Dus ik wil weten dat mijn oude kolonieprotocol levensvatbaar is of niet.

Dit klinkt erg ingewikkeld. Als je een mini-kralenklopper hebt, zou het veel gemakkelijker zijn om de cellen met agitatie en glasparels te breken. Een cryobuis die voor de helft gevuld is met kleine glasparels en een deel van het kweekmedium en krachtig wordt gevortext, zou waarschijnlijk ook werken. Het toevoegen van Zymolase aan het kweekmedium voor een paar minuten, gevolgd door koken en het gebruik van 1 ul van het supernatant zou zijn waar ik zou beginnen met chemische technieken. Zymolase werkt goed bij het lyseren van de celwand van gist. U moet ook controleren of uw PCR werkt met puur DNA.

Is het DNA dat u amplificeert op een plasmide of chromosomaal? Als ze chromosomaal zijn, zullen deze vuile bereidingen met chemicaliën en hitte / vries veel minder effectief zijn.

Ik denk niet dat de voorgestelde methode de celwand voldoende kan afbreken. Mijn stem gaat naar Zymolyase om de celwand enzymatisch te verteren.

allereerst bedankt voor je suggesties.
ik heb DNA van chromosomaal geamplificeerd. Zoals je zei, moet ik Zymolyase gebruiken om de celwand te verteren, toch?

Als je chromosomaal DNA amplificeert, zijn er twee problemen. Eerst moeten de cellen worden opengebroken, hetzij mechanisch, hetzij met Zymolase, gevolgd door de normale chemie (bijvoorbeeld SDS en NaOH). Het tweede probleem is dat het DNA mechanisch vezelig is en moet worden opgebroken. Mechanische technieken zullen dit ook doen, maar de chemische technieken zullen een draderige puinhoop achterlaten. Je kunt het DNA afknippen met een spuit en een fijne naald, maar het gaat erom dat je dingen gemakkelijker kunt doen dan een standaard DNA-voorbereiding. Ik herhaal, de makkelijke manier is mechanische lysis en DNA-schering met glasparels en vortexen.
http://www.daigger.com/catalog/product/d-B. r%C2%99+Blender
Daigger heeft misschien niet de beste prijs.

phage434, nogmaals bedankt. Ik denk dat ik weet wat je zei. Maar nu is er een nieuw probleem: kan ik het supernatant met lysisbuffer als sjabloon voor PCR nemen?

hallo, ik heb weer een probleem.
geef me een suggestie over gistkolonie PCR, dit is mijn protocol!
1. Incubeer de gistcultuur met een geschikt medium bij 30°C, 's nachts.
2. Centrifugeer 0,5 ml cellen bij 8000 tpm gedurende 5 minuten, gooi supernatant weg.
3. Resuspendeer de cellen met 0,5 ml 1xPBS, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 8000 tpm, gooi het supernatant weg.
4. Resuspendeer de cellen met 0,1 ml TE, vervolgens gekookt in water gedurende 3 minuten
5. koud in de vloeibare stikstof voor 0,5 min
6. gekookt in water gedurende 2 minuten.
7. neem dan 1 ul supernatant als sjabloon voor PCR

nu is het probleem dat ik het juiste PCR-product niet kan krijgen, zelfs niets kan krijgen. Dus ik wil weten dat mijn oude kolonieprotocol levensvatbaar is of niet.

Hallo, Zonnige Zon
Ik heb geen idee van je doel: chromosomaal DNA of plasmide-DNA?
Hier is mijn ervaring:
Ik heb plasmide-genexpressie in gist bepaald met behulp van kolonie-PCR.

kies een kolonie en verdun deze direct in 10 ul dd H2O
1ul wordt gebruikt als sjabloonbron. Het PCR-programma is een beetje anders dan de "normale" PCR in de eerste stap.
94 ° C gedurende 10 minuten is nodig om de celwand van gist af te breken en de afgifte van DNA daaropvolgend.
Ik heb het vaak geprobeerd en het werkt redelijk goed.

glcui, heel erg bedankt. Ik denk dat je suggestie nuttig voor me is, hoewel ik DNA van chromosomaal heb versterkt.


Zeer efficiënte kolonie-PCR-methode voor rode gisten en de toepassing ervan om mutaties binnen twee leucine-auxotrofe-mutanten te identificeren

Rode gisten zijn veelbelovend voor de productie van microbiële lipiden en carotenoïden. Genetische studie van rode gisten heeft veel aandacht getrokken, maar snelle amplificatie van genen uit rode gistmonsters blijft technisch uitdagend. Hier werd een zeer efficiënte methode ontwikkeld voor de bereiding van genomisch DNA (gDNA)-sjabloon, die direct voor PCR kon worden gebruikt. Cellen van kolonies of vloeibare culturen werden verzameld en achtereenvolgens behandeld met microgolf, plMAN5C, proteïnase K en koken (MMPB) in een enkele buis om cellysaten te geven die werden gekwalificeerd als PCR-templates. Enkelvoudig gekopieerde gDNA-fragmenten van maximaal 2,8 kb werden met succes geamplificeerd. We hebben ook een succesvolle toepassing van deze methode aangetoond voor soorten in de Ascomycetes en Basidiomycetes en identificatie van twee leucine-auxotrofe-mutanten van Rhodotorula glutinis. Deze methode zou op grote schaal kunnen worden gebruikt voor de screening en genetische manipulatie van verschillende gisten.


Kolonie PCR

In een vorig lab gebruikte je verschillende kweekmedia om onderscheid te maken tussen verschillende S. cerevisiae mutanten ontmoet. Uw resultaten hebben u mogelijk in staat gesteld om uw stammen voorlopig te identificeren. In dit lab ga je de polymerasekettingreactie (PCR) gebruiken om de mutante stammen beter te identificeren. Dit hoofdstuk begint met een overzicht van de PCR en de Saccharomyces Project voor het verwijderen van genen. Je zult deze kennis gebruiken om een ​​strategie te ontwerpen en uit te voeren voor het identificeren van met deletie-stammen door middel van gistkolonie-PCR.

Overzicht polymerasekettingreactie

De polymerasekettingreactie (PCR) zorgde voor een revolutie in de moleculaire biologie. Met PCR hadden onderzoekers een hulpmiddel om DNA-sequenties van belang te amplificeren van extreem kleine hoeveelheden
van een DNA-sjabloon. In een typische PCR-reactie kunnen inderdaad miljarden kopieën worden gesynthetiseerd uit een enkel DNA-molecuul. De ontwikkeling van PCR kwam voort uit onderzoek naar DNA-polymerasen en de ontdekking van thermostabiele DNA-polymerasen die bestand zijn tegen langdurige hittebehandelingen die de meeste eiwitten denatureren (Sakai et al., 1988). Tegenwoordig is PCR een standaardtechniek die veel wordt gebruikt om DNA-moleculen te analyseren en om nieuwe recombinante moleculen te construeren.

Thermostabiele DNA-polymerasen staan ​​centraal in PCR. De eerste beschrijving van PCR gebruikte een DNA-polymerase van E coli, die gedenatureerd was en moest worden vervangen na elke ronde van
DNA-synthese (Sakai et al., 1985). De procedure werd sterk verbeterd door het vervangen van de E coli polymerase met een DNA-polymerase van Thermus aquaticus, een bacterie die gedijt
in thermale bronnen in Yellowstone National Park. De T. aquaticus DNA-polymerase, of Taq-polymerase, functioneert het beste bij temperaturen van 70-75 ̊C en is bestand tegen langdurige (maar niet onbeperkte) incubatie bij temperaturen boven 90 ̊C zonder denaturatie. Binnen een paar jaar was de Taq-polymerase gekloond en tot overexpressie gebracht in E coli, waardoor de beschikbaarheid aanzienlijk wordt uitgebreid. Tegenwoordig is de selectie van polymerasen die beschikbaar zijn voor PCR dramatisch toegenomen, aangezien nieuwe DNA-polymerasen zijn geïdentificeerd in andere thermofiele organismen en genetische modificaties zijn geïntroduceerd in Taq-polymerase om de eigenschappen ervan te verbeteren.

PCR omvat meerdere ronden van DNA-synthese van beide uiteinden van het DNA-segment dat wordt geamplificeerd. Bedenk wat er gebeurt tijdens DNA-synthese: een enkelstrengs oligonucleotide-primer bindt aan een complementaire sequentie in DNA. Dit dubbelstrengs gebied biedt een anker voor DNA-polymerase, dat de primer verlengt, ALTIJD in de richting van 5' naar 3'. Onderzoekers controleren de startplaatsen voor DNA-replicatie door oligonucleotiden te leveren die als primers voor de reactie dienen (hieronder weergegeven voor Je favoriete gen Yfg). to ontwerp PCR-primers, onderzoekers hebben nauwkeurige sequentie-informatie nodig voor de primerbindingsplaatsen in het doel-DNA. (Opmerking: sequentie-informatie is niet nodig voor de volledige sequentie die zal worden geamplificeerd. PCR wordt vaak gebruikt om sequenties te identificeren die voorkomen tussen twee bekende primerbindingsplaatsen.) Er zijn twee primers vereist voor PCR. Een primer bindt aan elke streng van de DNA-helix.

PCR begint met een denaturatieperiode van enkele minuten, waarin het reactiemengsel wordt geïncubeerd bij een temperatuur die hoog genoeg is om de waterstofbruggen te verbreken die de twee strengen van de DNA-helix bij elkaar houden. Effectieve denaturatie is van cruciaal belang, omdat DNA-polymerase enkelstrengs DNA als sjabloon vereist. Het initiële denaturatiesegment is langer dan de daaropvolgende denaturatiestappen, omdat biologische templates voor PCR, zoals genomisch DNA, vaak lange, complexe moleculen zijn die bij elkaar worden gehouden door vele waterstofbruggen. In volgende PCR-cycli worden de (kortere) producten van eerdere cycli de overheersende sjablonen.

Na de initiële denaturatie omvat PCR een reeks van 30-35 cycli met drie segmenten, uitgevoerd bij verschillende temperaturen. PCR-reacties worden geïncubeerd in thermocyclers die de temperatuur van een metalen reactieblok snel aanpassen. Een typische cyclus omvat:

  • een denaturatiestap – gewoonlijk 94 ̊C
  • een primer annealing stap – gewoonlijk 55 ̊C
  • een uitbreidingsstap – algemeen 72 ̊C

PCR-reacties omvatten meerdere cycli van denaturatie, annealing en verlenging.
Elke PCR-cyclus omvat drie verschillende temperaturen. In de denaturatiestap worden de waterstofbruggen die DNA-helices bij elkaar houden verbroken. In de annealingstap binden oligonucleotideprimers aan enkelstrengs templatemoleculen, wat startpunten oplevert voor processieve DNA-polymerasen die de primersequentie verlengen. DNA-polymerasen worden actiever bij de verlengingstemperatuur, die dichter bij hun optimale temperatuur ligt. Onderzoekers passen de temperaturen en timing van de bovenstaande stappen aan om rekening te houden met verschillende primers, sjablonen en DNA-polymerasen.
PCR-producten van de beoogde grootte accumuleren exponentieel

PCR is inderdaad een kettingreactie, aangezien de DNA-sequentie van belang ruwweg verdubbelt met elke cyclus. In tien cycli wordt een sequentie geamplificeerd

1000-voudig (2E10=1024). In twintig cycli wordt een sequentie geamplificeerd

miljoenvoudig. In dertig cycli kan een sequentie theoretisch worden geamplificeerd

miljard keer. PCR-reacties in het laboratorium omvatten doorgaans 30-35 cycli van denaturatie, annealing en verlenging. Om PCR te begrijpen, is het belangrijk om je te concentreren op de eerste paar cycli. PCR-producten van de beoogde grootte verschijnen eerst in de tweede cyclus. Exponentiële amplificatie van het beoogde PCR-product begint in de derde cyclus.

Tijdens de eerste cyclus synthetiseren de thermostabiele DNA-polymerasen DNA, waardoor de 3'-uiteinden van de primers worden verlengd. DNA-polymerasen zijn processieve enzymen die door zullen gaan met het synthetiseren van DNA totdat ze letterlijk van het DNA vallen. Dientengevolge hebben de complementaire DNA-moleculen die in de eerste cyclus worden gesynthetiseerd, een grote verscheidenheid aan lengtes. Elk van de producten heeft echter een gedefinieerde startpositie, aangezien het begint met de primersequentie. Deze "verankerde" sequenties worden sjablonen voor DNA-synthese in de volgende cyclus, wanneer PCR-producten van de beoogde lengte voor het eerst verschijnen. Het startsjabloon voor PCR zal in elke volgende PCR-cyclus worden gekopieerd, wat bij elke cyclus twee nieuwe "verankerde" producten oplevert. Omdat de lengtes van de "verankerde" producten nogal variabel zijn, zullen ze echter niet detecteerbaar zijn in de eindproducten van de PCR-reactie.

Eerste cyclus van PCR. DNA-polymerasen synthetiseren complementaire strengen van het matrijs-DNA, beginnend bij de primerplaats. De lengte van de producten is nogal variabel en hangt af van de processiviteit van het DNA-polymerase.

DNA-strengen van de beoogde lengte verschijnen voor het eerst tijdens de tweede cyclus. Replicatie van de "verankerde" fragmenten genereert PCR-producten van de beoogde lengte. Het aantal van deze fragmenten met een gedefinieerde lengte zal in elke nieuwe cyclus verdubbelen en snel het overheersende product in de reactie worden.

PCR-producten van de beoogde lengte verschijnen eerst in de tweede cyclus. De "verankerde" fragmenten die tijdens de eerste PCR-cyclus worden gegenereerd, beginnen met de primer 1- of primer 2-sequentie. Tijdens de tweede cyclus begint de replicatie op de andere primerplaats, het genereren van een PCR-product wordt aan beide uiteinden afgesloten met primersequenties.

De meeste PCR-protocollen omvatten 30-35 cycli van amplificatie. In de laatste paar cycli stapelen de gewenste PCR-producten zich om verschillende redenen niet meer exponentieel op. Zoals bij elke enzymatische reactie, zijn PCR-substraten uitgeput en de herhaalde incubatieronden bij 94 ̊C begonnen Taq-polymerase te denatureren.

Primer-gloeien is van cruciaal belang voor de specificiteit in PCR

Een goed primerontwerp is van cruciaal belang voor het succes van PCR. PCR werkt het beste wanneer de primers zeer specifiek zijn voor de doelsequentie in het matrijs-DNA. Mispriming treedt op wanneer primers binden aan sequenties die slechts gedeeltelijk complementair zijn, waardoor DNA-polymerase de verkeerde DNA-sequenties kopieert. Gelukkig zijn onderzoekers meestal in staat om experimentele parameters aan te passen om de kans te maximaliseren dat primers zullen hybridiseren met de juiste doelen.

PCR-primers zijn typisch synthetische oligonucleotiden tussen 18 en 25 basen lang. Bij het ontwerpen van een primer houden onderzoekers rekening met de Tm, de temperatuur waarbij de helft van de hybriden die tussen de primer en de template worden gevormd, zal smelten. In het algemeen neemt de thermische stabiliteit van een hybride toe met de lengte van de primer en zijn GC-gehalte. (Bedenk dat een GC-basenpaar wordt gestabiliseerd door drie H-bindingen, vergeleken met twee voor een AT-paar.) De volgende formule geeft een ruwe schatting van de Tm van oligonucleotidehybriden. In deze formule verwijst n naar het aantal nucleotiden en wordt de concentratie van eenwaardige kationen uitgedrukt in molaire (M) eenheden.

tm = 81,5 ̊C + 16,6 (log10[K+ + Na+]) + 0,41 (%[G + C]) – (675/n)

Indien mogelijk ontwerpen onderzoekers primers die qua lengte vergelijkbaar zijn en een GC-samenstelling van 40-60% hebben. De sequenties zijn zo ontworpen dat de Tms van de primer-DNA-hybriden binnen enkele graden van de annealingstemperatuur liggen. Het aanpassen van de Tms van de primers om dicht bij de annealingstemperatuur te zijn, geeft de voorkeur aan specifieke hybriden boven minder specifieke hybriden die een paar niet-overeenkomende basen kunnen bevatten. Een hybride gevormd tussen een primer en een niet-doelwitsequentie met zelfs maar één niet-overeenkomende base heeft een Tm dat is lager dan die van de volledig waterstofgebonden hybride. Als DNA-polymerase de niet-overeenkomende primer verlengt, zullen er onjuiste PCR-producten worden gegenereerd. Wanneer mispriming een probleem lijkt te zijn in een PCR-reactie, hebben onderzoekers verschillende opties om de opbrengst van het gewenste product te verhogen. Ze kunnen de lengte en/of het GC-gehalte van de primers vergroten, de zoutconcentraties wijzigen (resultaten zijn misschien moeilijk te voorspellen) of de uitgloeitemperaturen verhogen.

Bij het ontwerpen van PCR houden onderzoekers ook rekening met de aard van het sjabloon-DNA. Voor PCR kan een verscheidenheid aan DNA-templates worden gebruikt. Afhankelijk van het doel van het experiment konden onderzoekers kiezen voor genomisch DNA, een plasmide of een cDNA (complementair DNA gegenereerd door een reverse transcriptase uit mRNA). PCR kan ook met veel grovere preparaten van DNA, zoals een bacterie- of gistkolonie. Hoe complexer de template (zijn lengte in bp), hoe groter de kans dat deze een andere sequentie zal bevatten die erg lijkt op een primersequentie. Het haploïde gistgenoom is bijvoorbeeld 12 Mbp lang en bevat slechts één kopie van elk LEERDE KENNEN gen. De kans dat een niet-doelwitsequentie in het gistgenoom voldoende vergelijkbaar is met een 25-nucleotide LEERDE KENNEN primer om verkeerde priming te veroorzaken is redelijk goed. Bovendien kunnen deze sequenties met kleine mismatches de doelsequentie overtreffen. Met complexe templates zoals genomisch DNA kunnen onderzoekers daarom soms de impact van niet-overeenkomende hybriden verminderen door de hoeveelheid template-DNA in de reactie te verminderen. (Het gebruik van te veel sjabloon is de meest voorkomende fout in PCR voor gistkolonies.)

De componenten van PCR zijn eenvoudig, bestaande uit de DNA-template, primers, dNTP's, een buffer met MgCl2 (polymerasen gebruiken dNTP's gecomplexeerd met Mg2+), en het thermostabiele polymerase. Voor onze experimenten gebruiken we een mastermix die
alle componenten behalve het matrijs-DNA en de primers. Het gebruik van een mastermix zorgt ervoor dat alle reacties identieke reagentia hebben en vermindert ook het aantal transfers waarvoor micropipetten nodig zijn. Het kleinere aantal transfers is bijzonder voordelig, omdat het de kans op kruisbesmetting van reagentia vermindert. PCR is een buitengewoon gevoelige procedure. Sommige onderzoekers gebruiken zelfs speciale barrièretips voor hun micropipetten, die filters bevatten die voorkomen dat monsters de loop van de micropipetten bereiken.

Saccharomyces Genoomverwijderingsproject

De publicatie van de gistgenoomsequentie opende nieuwe kansen voor gistgenetici. Omdat ze de DNA-sequentie van het gistgenoom kenden, konden genetici nu profiteren van de hoge frequentie waarmee gist genen uitwisselt door homologe recombinatie om mutanten van hun eigen ontwerp te genereren. Homologe recombinatie vindt normaal gesproken plaats tijdens meiose en tijdens bepaalde soorten DNA-reparatie. Tijdens homologe recombinatie worden twee nauw verwante DNA-sequenties met elkaar uitgelijnd, verschijnen er breuken in de DNA-moleculen en vindt strenguitwisseling plaats wanneer de breuken worden hersteld. Homologe recombinatie stelt onderzoekers in staat om een ​​chromosomaal gen te vervangen door een DNA-construct van hun eigen ontwerp. Om deze strategie te gebruiken, construeren onderzoekers eerst een vervangingscassette waarin een markergen wordt geflankeerd door sequenties die identiek zijn aan chromosomale DNA-sequenties aan weerszijden van het gistdoelgen. De sequentie wordt vervolgens in cellen ingebracht door chemische transformatie of door elektroporatie. Getransformeerde cellen die de vervangingscassettes in chromosomaal DNA hebben opgenomen, kunnen worden geïdentificeerd door te selecteren op het merkergen in de vervangingscassette.

De Saccharomyces Genome Deletion Project (SGDP) gebruikte deze aanpak om systematisch elk van de voorspelde ORF's in de S. cerevisiae genoom met een kanamycineresistentie (KAN R) gen. Voor elke ORF gebruikten onderzoekers een reeks PCR-reacties (hieronder) om cassettes te construeren waarin het KAN R-gen werd geflankeerd door korte DNA-sequenties die stroomopwaarts en stroomafwaarts van het beoogde ORF op de S. cerevisiae chromosoom. De cassettes werden vervolgens gebruikt om de BY4742-stam te transformeren (Brachmann et al., 1998). Stammen die het KAN R-gen hadden ingebouwd, werden geselecteerd op platen die analogen van kanamycine bevatten (Winzeler et al., 1999).

De S. cerevisiae stammen die we in onze experimenten gebruiken, maken deel uit van de SGDP-verzameling van deletiemutanten. In dit lab ga je PCR gebruiken om te bepalen welke LEERDE KENNEN genen zijn verstoord in uw stammen. De PCR-primers werden ontworpen en getest door de SGDP om stamidentiteiten te verifiëren. Beschikbare primers omvatten twee genspecifieke primers (GSP) voor elk van de LEERDE KENNEN genen. Een van de SAP's, GSP Primer A, bevindt zich 200-400 bp stroomopwaarts van het startcodon. De tweede GSP, GSP Primer B, is een antisense-primer die bindt in het ORF. We hebben ook een antisense-primer die 250 bp bindt binnen de KAN R gen (KAN Primer B).


Resultaten  

Versnel Colony PCR met SapphireAmp Fast PCR Master Mix

SapphireAmp Fast PCR Master Mix is ​​snel en snel met een verlengingssnelheid van 10 seconden/kb, reacties kunnen worden voltooid in de helft van de tijd van conventionele Taak. De mastermix van SapphireAmp is ook aanzienlijk sneller dan de premixen met toegevoegde kleurstoffen die door andere fabrikanten worden aangeboden. De onderstaande tabel geeft een overzicht van de reactietijden voor SapphireAmp-mastermix en de aanbevolen reactietijden voor twee andere in de handel verkrijgbare voormengsels waaraan kleurstof is toegevoegd.

Amplicon lengteSapphireAmp Snelle PCR Master MixCompany P met kleurstof toegevoegde mastermixBedrijf T-kleurstof-toegevoegde mastermix
0,5 kb 50 minuten 1 uur 35 min 1 uur 30 min
1,0 kb 55 min 1 uur 50 min 1 uur 45 min
2,0 kb 1 uur 2 uur 20 min 2 uur 15 min
4,0 kb 1 uur 30 min 3 uur 20 min 3 uur 15 min

Experimenteel voorbeeld: SapphireAmp Fast PCR Master Mix gebruiken om een ​​cDNA-bibliotheek te screenen met kolonie-PCR

E coli cellen werden getransformeerd met een muis-cDNA-bibliotheek (insertgrootte van 0,5 tot 5 kb) geligeerd in pUC118. Plasmidebevattende transformanten werden geanalyseerd met behulp van SapphireAmp Fast PCR Master Mix en M4- en RV-primers (zie onderstaande methoden). De PCR-reactiecyclus was in slechts 70 minuten voltooid en er werden uitstekende opbrengsten verkregen. Van alle 16 gecontroleerde klonen werd bevestigd dat ze inserts van 0,5 tot 5 kb bevatten.

Figuur 2. Kolonie PCR met SapphireAmp Fast PCR Master Mix.


Gist Oefeningen

Microbiologen beginnen hun experimenten graag met een enkele kolonie, omdat de cellen in een kolonie het nageslacht zijn van een enkele cel. Een punt van zorg bij alle genetische experimenten zijn onbekende mutaties die spontaan ontstaan ​​en het fenotype kunnen beïnvloeden dat wordt bestudeerd. Spontane mutaties ontstaan ​​constant in alle cellen, met een snelheid van ongeveer 10-8/base/generatie. Voor S. cerevisiae, met een genoom van 12 Mbp, zullen de meeste cellen ten minste één mutatie hebben verzameld tegen de tijd dat ze 9-10 delingen hebben ondergaan. Een kolonie, die honderden miljoenen cellen heeft, is daarom een ​​populatie van genetisch zeer vergelijkbare, maar niet volledig identieke, organismen.
Onderzoekers gebruiken vaak streak-platen om afzonderlijke kolonies te isoleren. Een streak-plaat is eigenlijk een seriële verdunning van een bestaande cultuur op vaste media. Onderzoekers beginnen een reeks door een klein monster van gist of een ander micro-organisme op te pakken met een steriel instrument, dat een platinalus, een tandenstoker of een micropipetpunt kan zijn. Vervolgens verspreiden ze de cultuur door een reeks zigzagbewegingen over het oppervlak van de plaat te maken. Het aantal cellen op de lus of tandenstoker neemt af naarmate de streep vordert. Dientengevolge lijken strepen het dikst aan het beginpunt en neemt de dikte van de streep af totdat het mogelijk is om goed geïsoleerde afzonderlijke kolonies aan het einde van de streep te detecteren. Omdat het moeilijk kan zijn om kolonies van een enkele streep op te lossen, gebruiken veel laboratoria een reeks strepen op dezelfde plaat om kolonies te scheiden. Elke nieuwe streak wordt gedaan met een vers gesteriliseerde lus die cellen oppikt door de sporen van de vorige streak te kruisen, voordat een nieuwe reeks zigzaglijnen begint. In onze experimenten zullen we een multi-streak-protocol gebruiken, waarmee we meerdere stammen op een enkele plaat kweekmedium kunnen kweken. (Zie de onderstaande afbeelding.) De strookplaten die u klaarmaakt, bevatten de voorraden voor toekomstige experimenten. Let bij het uitstrijken van je soorten goed op de details om kruisbesmetting of verwarring over de identiteit van individuele soorten te voorkomen.

  1. Je team krijgt drie verschillende S. cerevisiae onder druk kwamen te staan ​​met cultuur. De stamsoorten die je gaat gebruiken zijn gekweekt tot een hoge dichtheid in vloeibaar YPD-medium. Verzamel de YPD-culturen van de ouderstammen die moeten worden vermeerderd, een platina-inentingslus en een agarplaat met verse YPD-media. Dit bord zal tijdens het semester dienen als het voorraadbord van je team.
  2. Verdeel de voorraadplaat van je team in sectoren door de onderkant van de plaat te markeren met een magische stift. Label elke sector DUIDELIJK met een code voor de soort die erin zal worden gestreept. Er worden namelijk series van drie strepen gemaakt binnen elke sector, zoals beschreven op de vorige pagina. Bewaar de etiketten aan de rand van het bord en gebruik kleine letters. Noteer uw initialen en de datum.
  3. Steriliseer de inentingslus door deze in de vlam van een bunsenbrander te houden totdat deze rood gloeit. Koel de lus af door het oppervlak van uw agarplaat kort aan te raken voordat u verder gaat. (Een hete lus doodt gistcellen waarmee het in contact komt!)
  4. De cellen in uw stamculturen kunnen in de loop van de tijd zijn gaan liggen. Resuspendeer de cellen met behulp van de vortex mixer. Werk snel en verwijder de dop van de eerste kweekbuis. gesteriliseerde lus in de kweek, verwijder de lus en plaats de dop terug op de kweekbuis.
  5. Breng cellen over naar de correct gelabelde sector op uw voorraadplaat. Eerste streep: maak meerdere zigzaglijnen over de buitenrand van de sector met de lus. Raak het agar-oppervlak LICHT aan terwijl u de tandenstoker beweegt. Denk aan het duwen van een hockeypuck over een ijsbaan, in plaats van een greppel te graven. U wilt GEEN spoormarkeringen in de agar plaatsen! Plaats het deksel terug.
  6. Steriliseer de lus in de vlam en koel deze af op het agar-oppervlak voordat u aan de tweede streep begint. Maak een tweede verticale streep vanaf de rand van de plaat naar het midden en blijf binnen de sector. De streep moet de zigzaglijnen in de eerste streep kruisen. Sluit het deksel en steriliseer (en koel) de lus opnieuw.
  7. Derde streep: maak een derde reeks zigzaglijnen die heen en weer kruisen over de rechte tweede streep, beginnend bij de buitenrand van de plaat en naar het midden toe bewegend. Zorg ervoor dat u binnen de sector blijft. Sluit het deksel en steriliseer de lus.
  8. Herhaal stap 4-7 voor elk van uw vloeibare culturen.
  9. Keer de plaat om en incubeer deze bij 30 °C totdat individuele kolonies zichtbaar zijn, wat meestal 24-48 uur is.
Oefening 2 – Spotplaten

Wetenschappers gebruiken spotplaten zowel om het aantal cellen in culturen te berekenen als om informatie te verkrijgen over de groei-eigenschappen van stammen op verschillende media. De afbeelding rechts toont een voorbeeld van een typische spotplaat. Elke rij vertegenwoordigt een verdunningsreeks van een andere gistcultuur. Voor elke plek wordt hetzelfde volume verdunde cultuur gebruikt. De verdunningsreeks is zo gepland dat de meest verdunde plekken een klein aantal individuele kolonies bevatten die van elkaar kunnen worden onderscheiden, meestal minder dan tien.

Meestal maken onderzoekers een reeks van 1:10 verdunningen in steriel water en spotten vervolgens een paar microliters van elke verdunning op een rij. In dit experiment werden aliquots van 5 L gespot uit de seriële verdunningen. Merk op dat het mogelijk is om individuele kolonies te tellen in de meest verdunde monsters. Dit stelt u op zijn beurt in staat om het aantal levensvatbare cellen in de oorspronkelijke cultuur te berekenen. In de bovenste rij kun je 4 kolonies onderscheiden in het monster dat 100.000-voudig is verdund. De oorspronkelijke cultuur zou 400.000 cellen in 5 L hebben bevatten, wat overeenkomt met 80 miljoen cellen per ml (8 x 107 cellen/ml).

In dit experiment ga je spotplaten gebruiken om de celdichtheden van log-fase en stationaire fase-culturen van te schatten S. cerevisiae. Elke groep krijgt twee culturen:

CL – S. cerevisiae log fase cultuur
CS – S. cerevisiae stationaire fase cultuur
Zoek de verdunningsreeks van elke cultuur op een aparte rij van de plaat. Be sure to LABEL the rows!

  1. Alignment grids are useful for preparing good-looking spot plates! Obtain an alignment grid (right) and mark the target positions for culture dilutions. Place an orientation mark at one point along the circumference.
  2. Label the plate with your initials and date with small letters around the BOTTOM rim of the dish. Put a hash mark on the edge of the plate to serve as an alignment marker.
  3. Prepare a series of five 1:10 dilutions from each culture using sterile water. (Diagrams in your lab notebook are often helpful in designing dilution series.) To prepare a serial dilution, first pipette 90 μL sterile water into five microcentrifuge tubes. Next, use a P20 to transfer 10 μL from the original culture into the first tube. Eject the tip into the appropriate waste container.
  4. Vortex the newly diluted culture to insure that the cells are uniformly distributed. With a fresh micropipette tip, transfer 10 μL from this tube to the second tube in the series. Repeat this step for tubes 3-5.
  5. Prepare the spot plate. Beginning with the last dilution in the series, spot 5 μL spots in a row. Vortex each dilution before spotting it, because cells may have settled. You will be able to use a single pipette tip for each dilution series, since you started with the most dilute cell suspension.
  6. Repeat step 3 for each culture that you are analyzing. Be careful to note in your lab notebook which culture has been spotted into each row on the plate!
  7. Leave the plate right side up for

Exercise 3 – Estimating cell densities with a spectrophotometer

The spectrophotometer provides a “quick and dirty” way to estimate the density of cells in a culture. In contrast to spot plates, which must be incubated for several days before colonies appear, spectrophotometer readings can be instantly converted into cell densities. On the other hand, the method does not discriminate between living and dead cells. The spectrophotometric method is based on light scattering by cells in the culture. When the light in a spectrophotometer hits a large particle such as a cell, light rays are deflected from a straight path and these light rays may not reach the detector. The greater the number of cells in a sample, the more light scattering occurs. The light scattering ability of a cell depends on its size and geometry, so a calibration curve is necessary to extrapolate optical density measurements to cell number. For example, the same number of yeast cells would scatter light more than the same number of bacterial cells, because the bacterial cells are much smaller.

Light scattering is measured with the spectrophotometer set to report absorbance. Because the principles used to measure light scattering and absorbance are different, the amount of light scattered by a solution is referred to as its “optical density” rather than its “absorbance.” The optical density of a sample analyzed at 600 nm is abbreviated OD600, with the subscript indicating the wavelength used for the measurement.


Tips and tricks from the bench

Don't pick too large of a colony. Too many bacteria can inhibit your PCR reaction or cause non-specific products to show up on your gel.

Beware of false positives. Just because you get the expected sized PCR product doesn’t mean there aren’t mutations in your insert. Make sure to submit multiple positive clones for sequencing to verify the insert sequence before proceeding with your experiment.

Shorter amplicons tend to be better. Shorter amplicons make for shorter PCR programs and are more likely to work in a PCR reaction that has bacterial debris.

Use a positive control. A good positive control is bacteria transformed with the same backbone plasmid. If this control doesn’t amplify a product, then you know there could be something wrong with the PCR setup and/or the primer design.

Use a negative control strain. A good negative control strain is an untransformed culture of the same strain of bacteria you used for cloning. This type of control is especially important for insert-specific primers. If your negative control amplifies a product of the expected size, you know the genome of your bacteria already contains your target sequence.

/>Beth Kenkel is currently a Research Assistant in the Department of Pediatrics at the University of Iowa. She is particularly interested in science communication and in vitro diagnostics.


Bekijk de video: PCR - Polymerase Chain Reaction IQOG-CSIC (Januari- 2022).